肌动蛋白丝组装的结构基础及老化gydF4y2Ba

许多由肌动蛋白驱动的过程，如细胞分裂，依赖于它的atp酶活性gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．在其单体形式(G-actin)中，actin表现出非常弱的atp酶活性(7 × 10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}) (ref。gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba})，但聚合成丝(F-actin)触发构象重排，使actin在数秒(0.3秒)内水解ATPgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}) (ref。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)．裂解的无机磷酸盐(PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)水解后不会立即释放(释放速率为0.006 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}) (ref。gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba)，生成中间产物ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba的f -肌动蛋白gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．P退出后gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba， adp结合的F-actin代表纤维的“老化”状态，然后可以解聚回G-actin。在体内，这一循环过程受到各种肌动蛋白结合蛋白(ABPs)的严格调控，其中一个子集能够感知肌动蛋白核苷酸状态gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．作为一个突出的例子，ADF/cofilin家族的ABPs有效地结合和切断ADP-F-actin以促进肌动蛋白的翻转，但只与ATP或ADP-P中的“年轻”肌动蛋白丝具有弱亲和力gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba状态gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

除了ABPs，二价阳离子与肌动蛋白结合的核苷酸，MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}或CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，也强烈影响聚合速率。现在人们普遍认为MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}体内主要阳离子是否与肌动蛋白结合gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．然而,由于这gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}- atp结合G-actin表现出较慢的聚合动力学和较高的聚合临界浓度gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}，已被用作肌动蛋白纯化的标准品gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba，许多体外研究和大多数G-actin晶体结构gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．是什么原因导致钙的聚合速率慢gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白仍是未知的。gydF4y2Ba

自2015年以来，许多低温电子显微镜研究表明，所有核苷酸状态的f -肌动蛋白结构gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}并与多种ABPs如cofilin复合gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}和肌凝蛋白gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}．然而，先前发表的F-actin结构是在3-4.5 Å的中等分辨率下求解的，因此没有显示足够的细节来模拟溶剂分子和氨基酸侧链的精确位置。因此，f -肌动蛋白老化的关键机制事件，如强烈依赖水分子的ATP水解，仍然未知。在这里，我们展示了兔骨骼α-肌动蛋白丝在3种功能状态下的6个冷冻电子显微镜(cryo-EM)结构，分辨率约为2.2 Å，在Mg存在下聚合gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}或CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}．该结构以前所未有的细节阐明了f -肌动蛋白的结构，并支持了溶剂分子在肌动蛋白丝组装和老化中的关键作用。gydF4y2Ba

首先，通过使用优化的低温电子显微镜工作流程(扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)，我们测定了Mg的结构gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin在三种相关的核苷酸状态(ATP, ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba和ADP)在2.17-2.24分辨率Å(图。gydF4y2Ba1模拟gydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba；gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

前所未有的高分辨率的f -肌动蛋白重建允许数百个溶剂分子的模型，我们相应地观察到核苷酸和相关的Mg的清晰密度gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子及其配位水分子(图。gydF4y2Ba1罪犯gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．所有Mg的整体构象gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin结构高度相似，Cα原子均方根偏差<0.6 Å，螺旋上升和扭转没有变化(补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)，表示差异在于细节(见下文)。尽管早期的研究预测MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和PgydF4y2Ba_我gydF4y2BaF-actin核苷酸结合袋外的结合位点gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}在我们的任何重建中，我们都没有发现这些次级离子结合位点的证据。gydF4y2Ba

我们用ADP与氟化铍(BeF)络合来解决f -肌动蛋白的结构gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba，也被称为BeFgydF4y2Ba_xgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba来模拟灯丝的短命ATP状态(图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)．在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaF-actin结构(2.17 Å)，我们观察到ADP-BeF模型的明确密度gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在核苷酸结合位点(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．值得注意的是，Mg的核苷酸构象gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Baf -肌动蛋白与Mg相似gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ATP在G-actin中的表达(图;gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，证实ADP-BeF的适用性gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaATP模拟。gydF4y2Ba

阐明钙的缓慢聚合动力学的机理基础gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin，我们解决了CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin结构与ADP-BeF复合体gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2BaADP的分辨率为2.15-2.21 Å(图1)。gydF4y2Ba1比gydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 g-lgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4 d-fgydF4y2Ba补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．重构结果表明，即使CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin表现出慢聚合和快解聚合的动力学gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba，它在丝状态下采用稳定构象。在全球范围内,CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin的结构与Mg的结构相似gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin，螺旋上升和扭转没有变化，Cα原子均方根偏差<0.6 Å(扩展数据图。gydF4y2Ba4 h-kgydF4y2Ba)，表示从MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}对CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}不会在纤维中引起大的构象重排。gydF4y2Ba

聚合完成后，肌动蛋白单体的子结构域1和子结构域2 (SD1和SD2)旋转约12.4°，导致纤维的排列更加致密(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)，通常被称为扁平化gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．g -肌动蛋白在ATP状态下晶体结构的比较gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba我们的F-actin结构允许描述在溶剂分子的背景下G-到F-actin的转变。我们首先分析了直接与核苷酸阳离子结合的水分子。在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Baf -肌动蛋白、镁gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}由P协调gydF4y2Ba_βgydF4y2BaADP是BeF的氟化物部分gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和四个水分子，定义了六配位，八面体配位，类似于镁gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}在ATP-G-actin(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．我们的f -肌动蛋白结构为MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}在G-向f -肌动蛋白的转变过程中保持其水配位性，这是以前仅根据分子动力学数据预测的gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．我们接下来检查了核苷酸结合袋附近水分子的潜在重新定位。在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ATP-G-actin (PDB 2 v52)gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba在SD3和SD1之间，有一个大的空腔(直径约7 Å)，容纳了ATP γ-磷酸盐前面的几个有序的水分子(SD3/1空腔，图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．肌动蛋白变平导致h -环(残基72-77)向上移位，富脯氨酸环(残基108-112)和Q137和H161的侧链向核苷酸移动(图)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．结果，SD3/1腔变窄(直径约5 Å)， SD1腔(被认为是SD1腔)打开(扩展数据图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．由于SD3/1腔的变窄，一些水分子会与氨基酸发生冲突，因此需要通过一条包括水分子(WgydF4y2Ba_xgydF4y2Ba)结合在两个腔之间(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．值得注意的是，水分子进入SD1腔的重新定位并不影响核苷酸结合Mg的配位gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子(图。gydF4y2Ba2 c fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由G-构象转变为F-actin后，SD3/1空腔中只剩下3个不经Mg配位的水分子gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}．其中一个与Q137的侧链氢键相连(图1)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．由于F-actin中核苷酸结合位点的重排，这个水分子更接近于p γ类似物BeF (3.6 Å)gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba比在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ATP-G-actin (>4 Å距离Pγ和4.6 Å在PDB 2V52;ref。gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．由于核苷酸前面没有其他有序的水分子排列，与Q137成氢键的水分子很可能代表亲核试剂(WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba)水解f -肌动蛋白中的ATP。的O-Be-WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba角度为144°(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 c,我gydF4y2Ba)，而有效的亲核攻击需要>150°的角度gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．虽然不能排除ADP-BeF之间核苷酸取向略有改变gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-结合型和atp结合型f -肌动蛋白，重构检查显示WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)，表示W的位置gydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba是不固定的，允许它移动到一个位置，带来O-Be-WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba角>150°，而其余氢键与Q137。换句话说，WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba可能是在水解能力和水解能力较差的构象之间交换。gydF4y2Ba

虽然Q137立场WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba在接近Pγ时，Q137侧链不能接受质子作为水解的催化碱。我们没有发现其他氨基酸足够接近与W相互作用gydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba．相反,WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba位于4.2 Å附近的水分子(WgydF4y2Ba_桥gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)，这还不足以形成氢键，而是WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba进入水解能力的位置也会使WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba到W的氢键距离gydF4y2Ba_桥gydF4y2Ba．通过与D154和H161形成氢键，WgydF4y2Ba_桥gydF4y2Ba可能代表刘易斯碱具有很高的激活WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba并可能在水解过程中充当初始质子受体，随后质子转移到D154，正如先前模拟预测的那样gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}或者，或者，到H161。综上所述，我们提出Q137坐标WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba但组成WgydF4y2Ba_桥gydF4y2BaD154和H161负责激活WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba和质子转移。事实上，Q137向丙氨酸(Q137A)肌动蛋白突变体的ATP水解速率较慢，但并未完全消失gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba，而三联突变Q137A/D154A/H161A-actin显示没有可测量的atp酶活性gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们接下来检查了钙中G-到f -肌动蛋白的转变gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白的结构。CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}G-actin中的PgydF4y2Ba_βgydF4y2BaATP和5个水分子的Pγ呈七配位、五-双金字塔排列(图4)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}．相比之下，在加州gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Baf -肌动蛋白,CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子失去一个配位水，显示出一个八面体配位球(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．G-到f -肌动蛋白的转变如何导致钙的变化gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}协调吗?在全球范围内，Ca的趋平gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin引发的重排与Mg中观察到的类似gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin(扩展数据图gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)，有序的水分子从狭窄的SD3/1空腔向扩宽的SD1空腔进行了类似的迁移。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．然而,在这gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-G-actin，一种重新定位的水分子(WgydF4y2Ba_xgydF4y2Ba)在Ca的协调范围内gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，表明钙的水化壳gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}G-到f -肌动蛋白的转变需要改变。因此，我们的分析合理化了为什么Ca的内部协调gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}从ATP-G-actin中的七配位、五边形双锥体转变为ADP-BeF中的六配位、八面体gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Baf -肌动蛋白(无花果。gydF4y2Ba2 d, e, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．所需的Ca重排gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-配位球可为G-向f -肌动蛋白的转变提供动力学障碍，这为钙的慢聚合动力学提供了结构基础gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin相比MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白。gydF4y2Ba

我们还评估了钙的ATP水解机制gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin，其ATP水解速率慢5倍(0.06 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}比毫克)gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白(0.3年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}) (ref。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)．Ca和Ca的结构比较gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ATP-G-actin (PDB 1QZ5)和CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaF-actin表明水对应WgydF4y2Ba_nucgydF4y2BaF-actin中的Be (3.7 Å)比G-actin中的Pγ (4.5 Å)位置更近(扩展数据图。gydF4y2Ba6 d, h,我gydF4y2Ba)．因此，钙对ATP水解的诱导作用是相当的gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白和毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白。然而,在这gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaF-actin, Q137和W之间的距离gydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba是3.4 Å (3.2 Å在MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin)和O-Be-WgydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba角度为137°(Mg为144°)gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin扩展数据图gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)，使W的位置gydF4y2Ba_nucgydF4y2Ba类似，但略不利于亲核攻击，这为钙水解速度较慢提供了可能的解释gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin。gydF4y2Ba

接下来我们分析了ATP水解如何影响f -肌动蛋白核苷酸排列。在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba状态，劈裂的PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba部分与ADP分离至少2.9 Å(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，表示ADP和PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba不形成共价键。P后gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba释放,PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba-结合位点被水分子占据，这也适用于单体Mg的结构gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-G-actingydF4y2Ba^38gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．综合来看，我们的结构表明MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-配位壳是八面体，MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}位于P下面的固定位置gydF4y2Ba_βgydF4y2Bag -肌动蛋白和f -肌动蛋白在所有稳定状态下的核苷酸的一部分。gydF4y2Ba

在Ca中经过ATP水解gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin, CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}在ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba状态(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)．有趣的是，一个配位水分子被Q137的侧链所取代。gydF4y2Ba5汉英gydF4y2Ba)．最后,在PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba释放,CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-F-actin结构表明CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子改变位置，因此它直接与PgydF4y2Ba_αgydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_βgydF4y2BaADP(无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)和四个八面体排列的水分子。因此，相对于MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}, CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}f -肌动蛋白中的离子位置不固定，在atp酶循环过程中其配位发生了显著变化。钙的ADP态之间的氨基酸构象没有离散的差异gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}- - - MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin表明Ca解聚速度较快gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}- f -肌动蛋白可能是由长丝机械稳定性或丝端构象的差异引起的。gydF4y2Ba

PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba被认为从f -肌动蛋白内部通过所谓的“后门”gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba它是由R177和N111的侧链和甲基化组氨酸73 (H73)和G74的主链组成的。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 f, ggydF4y2Ba)．在该模型中，S14改变旋转聚类位置，使其氢键相互作用从G74的骨干酰胺转移到G158，从而使PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba接近后门，R177将在那里调解它的出口gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}．在低分辨率重建的基础上，建议在ADP-F-actin中打开后门gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．然而，S14-G74氢键是完整的，并且在我们的ADP-P的2.2 Å结构中后门是关闭的gydF4y2Ba_我gydF4y2BaMg的ADP态gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin(无花果。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)和CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin(扩展数据图。gydF4y2Ba5 f, ggydF4y2Ba)．因此，出乎意料的是，我们的结构表明，后门在P之后再次关闭gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba释放，表明f -肌动蛋白构象允许PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba是一种短暂的状态。事实上，仅由S14向G158旋转旋转的提议并不会导致后门被打开，这表明P需要更大的重新安排gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba释放，表明释放机制仍然不完全了解。我们设想PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba在未来的研究中，以我们的结构作为高质量的启动模型，可以通过分子动力学模拟或时间分辨低温电磁进一步探索释放。gydF4y2Ba

接下来，我们检测了d -环(残基39-51)和肌动蛋白丝链内(或纵向)界面羧基端核苷酸状态依赖性构象迁移率gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}．当前高分辨率MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin结构与之前重建的结构基本一致gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba在“年轻”的atp结合丝中有开/闭d环构象的混合，在“年老”的ADP-F-actin中有主要的闭合d环排列(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaF-actin结构，我们可以通过聚焦分类方法分离两个链内构象(扩展数据图。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba)．第一个构像(约37%的粒子，2.32 Å分辨率)代表开放的d -环，其中d -环向外弯曲并与相邻肌动蛋白亚基的扩展C端相互作用。在第二种构像(约63%的粒子，2.32 Å分辨率)中，C端保持延伸，但远离向内折叠的闭合d环(扩展数据图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba在f -肌动蛋白中，C端形成一个紧凑的折叠α-螺旋，d端主要是闭合的gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-F-actin结构类似于Mg的扩展的C端和闭合的d环构象gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们分析了核苷酸结合袋中的构象变化是如何传递到丝表面的。令人惊讶的是，我们无法确定D-loop和核苷酸结合位点之间的直接通信路径(扩展数据图)。gydF4y2Ba8汉英gydF4y2Ba)．因此，我们的结构不能解释为什么在Mg的ATP状态下，链内界面可以采用两种构象gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}肌动蛋白。然而，我们能够识别出C端核苷酸依赖构象的结构基础。ATP水解后，ADP-P中核苷酸结合袋中的Q137向上移动约0.4 ÅgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba状态，使其位于P的3.1 Å之内gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．Q137的向上运动触发了SD1的一系列小运动;富脯氨酸环(残基108-112)略微向前移动，触发E107-R116盐桥的重新定位，这使得倒数第二的残基C374翻转成疏水袋，允许R116与c端残基F375的羧基相互作用(图1)。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．总的来说，这些变化导致了一个紧凑的，折叠的c端螺旋，然后当Q137在P后向下移动时再次展开gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba发布(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．总之，我们的数据表明Q137及其周围残基代表了一个能够感知核苷酸状态并将其传递到外周的主要区域。gydF4y2Ba

有人提出，链内界面是cofilin等ABPs感知F-actin核苷酸状态的主要位点。Cofilin通过插入C端和d环之间，结合并改变肌动蛋白丝的螺旋扭曲gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}，可能被开放的d -环构象所抑制gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．在CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin时，我们观察到与Mg相似的链内界面排列gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin，除了Ca中较少采用开放d环构象gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaF-actin(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．因此，我们提出，如果D-loop排列代表了主要的识别信号，cofilin可以有效地结合和切断CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin，而不考虑核苷酸状态。为了评估这一点，我们培养了cofilin-1和MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}——或CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-结合的f -肌动蛋白在三种核苷酸状态和测量的cofilin依赖的丝切断。测定结果表明，与MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin, cofilin-1只能实质上切断ADP状态，而不能切断ADP- befgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba绑定CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-F-actin(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．因此，D-loop构象并不代表cofilin-1结合的唯一传感器。cofilin还利用什么其他机制来感知核苷酸状态?我们的结构表明，BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba与SD1的S14分子形成氢键作用;以及SD3的G158和V159的主干(扩展数据图)。gydF4y2Ba10个碳氢键gydF4y2Ba)．因此，γ-磷酸盐部分形成了两个子结构域之间的桥梁，这在ADP状态下是不存在的。先前的研究表明，科菲林与f -肌动蛋白的紧密结合需要改变丝的螺旋捻度gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba，这涉及到SD1和2的旋转(参考。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba；扩展的数据图。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba)．这种旋转涉及到S14环的运动，当S14与ATP或ADP-P中的核苷酸的γ-磷酸盐氢键结合时，这是不可能的gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba-F-actin(扩展数据图。gydF4y2Ba10我gydF4y2Ba)．因此，我们的结果支持先前提出的模型，即当γ-磷酸盐部分存在时，cofilin不能与F-actin形成强络合物gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba它还能感知灯丝的机械性能。这与许多生物化学观察一致，ADP/cofilin蛋白只能切断肌动蛋白丝gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba或性能试验gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba是否从活动站点删除gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

F-actin在2.2 Å分辨率下的结构显示了其丝结构和核苷酸结合袋的排列，其细节无与伦比，这使我们能够修改有关F-actin灵活性和稳定性的某些说法。传统上，f -肌动蛋白的结构被描述为多态的gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba，而“老化”的ADP-F-actin被认为是一种结构不稳定的纤维形式gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．相比之下，我们的结构在所有解出的核苷酸状态中都非常相似，这表明ADP-F-actin不应被视为不稳定的，而是一种“引物状态”，它在丝端表现出更快的解聚速度，并对由于缺少γ-磷酸盐部分而导致的cofilin结合和分离非常敏感。该模型与最近的一项研究高度一致，该研究表明核苷酸状态影响灯丝的弯曲和力学性能，而不是大的氨基酸重排gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．我们进一步说明了ATP水解f -肌动蛋白的机制和钙的缓慢聚合速率gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-actin依赖于水分子的位置，强调高分辨率结构对于解释灯丝组装和老化的这些重要方面至关重要。我们优化的低温- em工作流程现在也为结合ABPs的f -肌动蛋白的高分辨率结构铺平了道路，这将增强我们对细胞骨架重构的理解。最后，我们设想我们的f -肌动蛋白的溶剂分子可视化结构可以作为开发肌动蛋白结合小分子的高质量模板，这可能是为成像定制的，甚至可能是治疗应用gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

蛋白质纯化gydF4y2Ba

骨骼α-肌动蛋白是从兔肌肉丙酮粉中通过前面描述的建立的方案纯化的gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}．共0.5 g冰冻肌肉丙酮粉解冻，重新悬浮在10 ml g -buffer (5 mM Tris pH 7.5, 0.2 mM CaCl)中gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 0.2 mM ATP, 0.5 mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP)， 0.1 mM NaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)，在4°C搅拌25分钟。然后过滤悬浮液，再将颗粒重悬在10ml G-buffer中，并进行相同的搅拌过程。过滤后，将过滤后的20 ml溶液在10万下超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟，以清除任何残留的碎片。收集上清，加入2 mM MgCl聚合肌动蛋白gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}和100 mM KCl(最终浓度)在室温下放置1小时。为了去除与肌动蛋白结合的ABPs，在溶液中加入固体KCl，使KCl浓度达到800 mM，在室温下孵育1 h。然后在10万的超离心下将肌动蛋白丝成粒gydF4y2BaggydF4y2Ba在5ml G-buffer中重新悬浮。肌动蛋白在1 l g -缓冲液中透析解聚2 d，每天换一次缓冲液。这确保了CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}为G-actin活性位点的二价阳离子界。第三天，溶液在10万的温度下进行超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba培养30分钟，上清中提取G-actin。肌动蛋白聚合、高盐洗涤和g缓冲液透析解聚的2 d过程再次重复一次，以确保去除所有杂质和ABPs。解聚后，将纯化的G-actin以浓度为28µM的50µl等份速冻在液氮中，保存在−80°C中待用。gydF4y2Ba

如前所述，人类cofilin-1被纯化gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

f -肌动蛋白在不同功能状态下的重构gydF4y2Ba

对兔骨α-肌动蛋白进行了结构研究，发现其氨基酸序列与人骨α-肌动蛋白相同。g -肌动蛋白等分解冻并在10万温度下超离心1小时gydF4y2BaggydF4y2Ba去除总量。对于用Mg确定的结构gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}作为核苷酸相关阳离子，G-actin(28µM)与0.5 mM EGTA和0.2 mM MgCl混合gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}交换CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}为毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}聚合前5-10分钟。在随后的所有步骤中，缓冲区都包含了aclgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}用钙分离f -肌动蛋白gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}如二价阳离子或MgClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}用Mg分离f -肌动蛋白gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}二价阳离子。加入100 mM KCl和2 mM氯化钙可诱导肌动蛋白聚合gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}/ MgClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(最终浓度)。肌动蛋白在室温下聚合2小时，然后在4℃下过夜。第二天早上，丝状细胞在10万温度下通过超离心分离gydF4y2BaggydF4y2Ba2 h。gydF4y2Ba

对于老化的ADP-F-actin状态，丝球在FgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba缓冲:5毫米Tris pH 7.5, 100毫米KCl, 2毫米CaClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}/ MgClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 2 mM NaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 1 mM二硫苏糖醇(DTT)。颗粒重悬1 h后用F-actin制备低温电镜样品。gydF4y2Ba

在选择用于结构研究的ATP类似物时，我们考虑到我们团队之前的工作表明，广泛使用的不可水解ATP类似物AppNHp(也称为AMP-PNP)是F-actin的次优配体，因为它的降解产物是ADP类似物AppNHgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}，对f -肌动蛋白具有较高的亲和力gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba因此在灯丝制备过程中积累在活性部位gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．因此我们选择使用ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaATP的模拟物。得到这些ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2BaF-肌动蛋白的状态，衰老的adp结合丝在FgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba缓冲补充0.75 mM BeFgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}和5 mM NaF。因为BeF的on-rategydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba对ADP-F-actin的反应相对缓慢gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba在低温- em样品制备前，细丝在该缓冲液中孵育>6小时，以确保BeF饱和gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

分离ADP-P中的f -肌动蛋白gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba状态下，我们将肌动蛋白颗粒重悬在FgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba磷酸缓冲液:5 mM Tris, 50 mM KCl, 2 mM CaClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}/ MgClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 2 mM NaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 1mm DTT, 50mm磷酸钾pH 7.5。为了去除任何潜在的磷酸钙和磷酸镁沉淀，我们在使用前直接过滤缓冲液。细丝在FgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在低温电镜样品制备前6小时，>的磷酸盐缓冲液。gydF4y2Ba

低温电子显微镜网格准备gydF4y2Ba

共2.8µl的F-actin样品(3-16µM)被移至发光放电的R2/1 Cu 300目孔碳网格(Quantifoil)上。在孵育1-2秒后，将多余的溶液吸干，并使用Vitrobot Mark IV(赛默飞世尔科学公司)将网格插入液态乙烷或液态乙烷/丙烷混合物中冷冻。Vitrobot在13°C下操作，印迹力为−25，印迹时间为9 s。gydF4y2Ba

Cryo-EM网格筛选和数据收集gydF4y2Ba

网格预先筛选在200千伏的Talos北极显微镜(赛默飞世尔科学公司)上，配有猎鹰III探测器(赛默飞世尔科学公司)。通常，使用EPU(赛默飞世尔科学公司)收集低倍率网格概况(地图集)。然后，每个网格方格大约两个孔在高倍镜下成像，共5个网格方格以可视化f -肌动蛋白。然后从显微镜中取出显示最佳灯丝浓度和分布的网格，并存储在液氮中的自动网格盒(Thermo Fisher Scientific)中，直到进一步用于高分辨率数据收集。gydF4y2Ba

所有数据集都收集在一台配备K3探测器(Gatan)和柱后能量滤波器(狭缝宽度为15 eV)的300千伏Titan Krios显微镜(Thermo Fisher Scientific)上。视频以超分辨率模式获得，像素大小为0.3475 Å，不插入物镜孔径。所有的数据集都是在同一个显微镜上采集的，倍率为×130,000，以确保得到的低温-电磁密度图可以直接进行比较，而不会因为像素大小的差异而产生问题。使用EPU，我们在60-80帧的数据集中收集了大约10,000个视频，总电子曝光约为72 - 90egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．在EPU中设置的离焦值范围为−0.7 ~−2.0µm。在使用TranSPHIRE采集过程中实时监测数据质量gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．如有必要，调整显微镜以确保最佳成像条件。每个数据集使用的集合设置的概述可以在补充表中找到gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

低温电子显微镜图像处理gydF4y2Ba

对于每个数据集，在TranSPHIRE中实时执行视频预处理gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba，超分辨率视频被分类两次(结果像素大小为0.695 Å)，增益校正和运动校正使用UCSF MotionCor2(参考。gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba)，对比传递函数(CTF)估计使用CTFFIND4.13(参考文献。gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba)和f -肌动蛋白片段采用SPHIRE_crYOLO中的丝挑选程序进行挑选gydF4y2Ba^{55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba}使用每27.8 Å 40像素的盒子距离和每个灯丝至少6个盒子的数量。得到的粒子被提取在一个384 × 384像素盒中，并进一步加工到螺旋SPHIRE v.1.4的管道中。gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba)．每个数据集提取的粒子数量不同，范围从1,296,776 (MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP数据集)到3,031,270 (CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba数据集)粒子。对于每个数据集，使用ISAC2对颗粒进行二维分类，每批为20,000个颗粒。gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba) (sp_isac2.py)。然后将所有类别的棉条拉到一起，进行人工检查，并丢弃那些代表非丝挑丝和冰污染的棉条。剩下的粒子被创建了一个虚拟的子堆栈(sp_pipe.py isac_substack)，粒子被进行三维螺旋细化gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba使用美丽殿α。SPHIRE中的这种细化方法强加了针对螺旋样品的螺旋约束，以促进细化过程，但不应用螺旋对称。因此，可以避免细化过程中的对称工件。在穷尽搜索过程中，我们通过限制倾斜角度(——theta_min 90 -theta_max 90 -howmany 10)来优化F-actin结构，并使用140像素的细丝宽度(97.3 Å)和27.5 Å的螺旋上升来限制大于一个亚基的位移，以防止粒子重复。对于第一个处理的数据集，EMD-11787(参考。gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba)的低通滤波到25 Å并作为初始模型提供。每个数据集的第一次子午线alpha精化是在没有蒙版的情况下进行的;得到的这个改进的三维密度图，然后使用sp_mask.py创建一个软蒙版，覆盖大约85%的灯丝(在z方向上326个像素)。然后使用相同的设置重复全局优化，但使用蒙版。这些隐藏的细化产生了f -肌动蛋白在2.6-3.0 Å分辨率的重建。然后这些粒子被转换为与Relion兼容gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba使用sp_sphire2relion.py。在Relion 3.1.0中，粒子经过贝叶斯抛光处理gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba改进由光束诱导运动引起的粒子运动轨迹估计;以及CTF精制gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba估计每个粒子的离焦值，并校正光束倾斜、三倍(三叶)散光、Cs和四倍(四叶)散光和各向异性放大。然后，我们在不进行图像对齐的情况下进行三维分类(8类，25次迭代，tau2fudge 4)，以去除对重建没有贡献高分辨率信息的粒子。通常情况下，选择一个或两个包含最多粒子的高分辨率类，而丢弃其他低分辨率类。最后，在去除重复项后，这组粒子通过溶剂压平傅里叶壳相关(FSCs)进行掩模细化，并使用映射(低通过滤到4.0 Å)在Relion中进行局部搜索(初始采样0.9°)，掩模和从SPHIRE确定的粒子方向。根据金标准FSC = 0.143准则，这些细化产生了分辨率为2.15-2.24 Å的低温-电磁密度图。最后用负b因子锐化，用K3探测器的调制传递函数校正。在Relion进行了局部分辨率估计。gydF4y2Ba

分离Mg中封闭和开放的d环构象gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-BeFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba重构后，该数据集的228,553个良好粒子在Relion中进行聚焦分类，而不进行图像对齐。我们在f -肌动蛋白间接触点周围创建了一个软掩膜，包括中央肌动蛋白亚基的d -环和正上方亚基的C端。最初试图用单一密度图作为初始模型将d -环构象分成两类，但没有成功，因为所有的粒子最终会在一个封闭/开放d -环种群混合的单一类别中结束。因此，我们根据两个参考资料将粒子分为两类;jasplakinolide-bound,毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP-PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(内部结构)和MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP结构分别作为开环和闭环d环构象的模板。选择粒子分离为两类和两个初始参考点，因为在通过所有2,228,553个良好粒子计算的精炼、非锐化重构中，闭合和开放d环的两种构型是可见的。只有少量的f -肌动蛋白粒子采用的d -环的潜在替代构象无法通过我们的分类策略进行区分。在优化tau2fudge参数后，由于掩码相对于完整盒子的尺寸较小，需要较高的值，这种不需要图像对齐的分类(两个类，25次迭代，tau2fudge = 500)产生了两个类，清晰可区分的D-loop构造。然后选择属于每一类的粒子(834110为开d环，13394443为闭d环)，分别在Relion中精制，使用混合d环构象图(过滤到8.0 Å， d环构象难以区分)作为参考，spire -掩膜覆盖85%的细丝，用溶剂压平FSCs精制。这些优化是使用默认的tau2fudge = 1执行的，以防止任何过拟合。在不进行图像对齐的分类过程中使用的高tau2fudge值仅用于粒子排序，不用于进一步的地图处理和分析。开放d -环(2.32 Å)和封闭d -环(2.32 Å)粒子的结果图分别显示了用于聚焦分类区域的预期开放和封闭d -环构象。图中肌动蛋白亚基的d环构象仍然是开放和封闭的混合，没有用于聚焦分类。gydF4y2Ba

模型的建立、细化和分析gydF4y2Ba

为了在高分辨率的密度图中建立F-actin模型，F-actin的结构在复合体中带有optojaspgydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba状态gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba(PDB 7AHN)刚体拟合到F-actin Ca图谱中gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}adp的状态。我们在每个图中模拟了五个肌动蛋白亚基，以捕获丝内的整个相互作用界面，因为中心亚基与四个相邻的前体相互作用。图中的中央肌动蛋白亚基是在Coot中手工重建的gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba以中心亚基为主链，采用非结晶对称的方法在Coot中调整其他肌动蛋白亚基。然后使用Coot(手动)和phoenix实空间精炼迭代优化结构gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba有非晶体对称约束但没有任何几何约束。所有其他状态的结构都通过Ca的刚体拟合得到gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-ADP结构在地图中属于每个F-actin状态，然后在Coot中手动调整。这些结构然后通过类似的Coot和phenix的迭代循环协议进行优化。所有的溶剂分子(离子和水分子)都被人工放置在中央肌动蛋白亚基的Coot中，然后使用非晶体对称将其放置在其他亚基中。由于每个F-actin重建的局部分辨率在图的中心最高，在图的外围较低，我们在最终的凤凰细化之前手动检查了每个结构中的所有水分子;相应的低温-电磁密度较低的水分子被去除。补充表中提供了每个结构的细化质量摘要gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．在结构分析中，除非另有说明，否则使用结构中的中心肌动蛋白亚基。采用castp3.0 web服务器对结构中的溶剂腔进行计算gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．所有描述低温-电磁密度图和蛋白质结构的数据都是在UCSF ChimeraX中准备的gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．螺旋参数在补充表中报告gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba是根据原子模型的五个连续的子单元独立地拟合到前面所描述的地图来估计的gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Cofilin切断化验gydF4y2Ba

制备不同核苷酸状态的f -肌动蛋白用于低温-电磁实验(见上文)。取5 μM的F-actin与5、10和20 μM的cofilin在室温下孵育30 min，然后在12万离心，在20 μl的体积下进行切割gydF4y2BaggydF4y2Ba在TLA120.1转子4℃下加热15分钟。离心后，用sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上清和颗粒部分的等分，用Image Lab软件v.6.0.1 (Bio-Rad)进行密度分析，并用GraphPad绘图。数据点可以通过gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

关于研究设计的进一步信息可在gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba