摘要
betstrophin -2 (BEST2)是钙激活阴离子通道的betstrophin家族的一员，在眼部生理中起着关键作用1，2，3.，4．在此，我们发现了BEST2对谷氨酸的定向通透性，并发现谷氨酰胺合成酶(GS)是眼睛睫状体中BEST2的结合伙伴，并解决了BEST2 - GS复合体的结构。BEST2通过将GS拴在细胞膜上降低胞质GS的活性。GS在胞内谷氨酸缺失的情况下，将BEST2的离子传导通路通过其中央空腔延伸，抑制BEST2通道功能，但使BEST2对胞内谷氨酸敏感，促进BEST2的开放，从而缓解GS的抑制作用。我们证明了BEST2在传导氯和谷氨酸方面的生理作用以及GS在非色素纤毛上皮细胞中的影响。总之，我们的研究结果揭示了一种通过BEST2-GS释放谷氨酸的新机制。
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数据可用性
bBEST2-bGS复合物的原子模型和低温- em重建被存入蛋白质数据库(8 ecy)及电子显微镜资料库(emd - 28025)．所有资料均可向通讯作者索取。
参考文献
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确认
我们感谢W. Hendrickson和C. Hartzell对论文的评论;A. Hsu帮助净化bGS;协助建立定量PCR;M. Ben-Johny和P. J. del Rivero Morfin帮助建立FRET;哥伦比亚大学蛋白质组学和大分子晶体学共享资源的R. Soni，帮助质谱分析;R. Bruni在膜蛋白生产和分析中心(COMPPÅ)提供了细菌表达载体，以及哥伦比亚大学眼科预防失明研究(RPB)的无限制拨款。低温电子显微镜数据是在哥伦比亚低温电子显微镜核心中收集的。A.P.O.项目获得NIH资助项目R01GM107462和F31EY030763, K.Y.项目获得NIH资助项目R01EY014852和R01GM132598, T.Y.项目获得NIH资助项目R01GM127652和R24EY028758, Irma T. Hirschl/Monique wel - caulier研究奖(CU20-4313)和Schaefer研究奖。
作者信息
作者和隶属关系
贡献
A.P.O.设计研究，进行蛋白质纯化和低温电子显微镜实验，分析数据，制作图表，并撰写论文。K.Y.和J.W.设计研究，进行膜片钳记录，分析数据并制作数字。A.K.设计研究，生成结构，进行牛纤毛裂解物下拉，免疫印迹和GS活性实验，分析数据，制作图表，并帮助撰写论文。y.z和T.Y.设计研究、进行实验、分析数据、制作图表并撰写论文。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有竞争利益。
同行评审
同行评审信息
自然感谢C. Lee和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所作的贡献。
额外的信息
出版商的注意施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。
扩展的数据图和表
图1质谱法鉴定bBest2-GS相互作用。
（一个，b)点图显示纤体裂解物下拉样品的质谱分析阳性命中的信号强度。X轴为bBest2下拉样本中的信号强度;Y轴，减去对照下拉样品(牛纤毛裂解液，空Ni)的信号强度计算的信号强度变化+珠子)从bBest2下拉样本。表示bGS的点在总数(一个)和高强度(b)数据集。
图2 HEK293细胞中Best2和GS的免疫印迹。
（一个表明Best2-YFP-His和GS-CFP-Myc结构共表达，并用输入的抗gfp抗体检测(左)和免疫共沉淀(正确的)样品。IP凝胶上的最后一层是在20 mM谷氨酸存在的情况下进行的。（b)用抗gfp抗体检测WT hBest2-YFP-His和hGS-CFP-Myc单独表达或共表达时的整体、胞质和膜结合蛋白水平。（c)用抗gs抗体检测HEK293细胞中的外源性hGS- cfp - myc和内源性hGS。（d)用抗gfp抗体检测共表达时指示的hBest2-YFP-His和hGS-CFP-Myc结构的胞质和膜结合水平。（e) hBest2- yfp - his和hGS- cfp - myc分别与hBest2 siRNA和hGS siRNA或scramble siRNA共转染，并用抗gfp抗体检测(左)．β肌动蛋白(正确的)作为同一印迹上的加载控制。每个实验都进行了三次生物复制，得到了相似的结果。
图3获得bBest2-GS共结构的Cryo-EM单粒子分析处理流程。
（一个)典型的运动校正显微照片。（b)为感兴趣复合体选择后的代表性二维类平均值。bBest2-GS-Best2三明治在低温电子显微镜中被蛋白过表达解决，而只有一个Best2与GS在生理上相关，因为Best2是一种膜蛋白，GS是一种细胞质蛋白，在没有Best2的情况下在溶液中形成聚合物(包括十聚体)。（c3DFSC曲线。（d)垂直于结合界面的共结构的密度图和模型，顶部为bBest2(棕色)(标记为R197)，底部为bGS(蓝色);局部过滤地图显示在sigma 7.0。（e) FSC曲线进行最终细化，并施加D5对称。（f)视角分布。
图4 bGS的催化区域不受bBest2结合的影响。
（一个) bBest2-GS离子传导途径的内部视图，被描述为一个表面，并按元素(N =蓝色，O =红色，C =灰色)着色，显示亲水性表面。盒子1代表活性和atp结合位点，盒子2代表bGS亲水性中心腔。（b)离子渗透路径半径随bBest2和bGS中轴距离变化的HOLE图。（c)面板上盒子1对应的Cryo-EM密度一个描述了无ATP/ adp活性位点的模型;局部滤波映射显示在sigma 6.8。（d)面板上盒子2对应的Cryo-EM密度一个用红色表示与水分子密度对应的水化亲水中心腔;局部滤波映射显示在sigma 6.8。（e)从bBest2(棕色)光圈内部从膜向bGS(蓝色)看。（f) bGS活动站点的侧视图，bBest2位于顶部。黑盒子表示bBest2的R197与bGS相互作用。bGS的一个原聚体是粉红色的，β抓握是暗粉色的。从原PDB 2OJW中提取的一个ADP分子(绿色)被放置在两个相邻bGS原聚体界面的活性位点内，说明了活性位点与bBest2结合位点的位置。
扩展数据图5来自hBest2变体的阴离子电流和hGS的影响。
（一个-c)柱状图显示了HEK293细胞在+100 mV时的稳态电流密度，该细胞瞬时表达指示的hBest2和hGS结构，1 μM [Ca2 +］我在不同情况下:(一个) Cl−作为主要的内外阴离子;从左到右的组，N分别为9、5、7、7、5、8、5、6;＊p分别为0.04、7E-3、2E-3和2E-3，与单独表达WT hBest2的细胞电流相比。（b)内谷氨酸和外氯−作为主要的阴离子;从左至右的组，N分别为5、8、9、11、7、11、5、6;＊p分别为3E-4, 9E-4, 0.01和0.02，与仅表达WT hBest2的细胞电流相比。（c)内部Cl−而外源谷氨酸为主要阴离子;从左至右的组，N分别为6、6、12、7、6、8;＊p与单独表达WT hBest2的细胞电流相比，从左到右的组分别为5E-4, 6E-6和0.047。所有误差条以平均值+/−SEM表示;p值由双尾未配对的Student 's计算t测试。
图6 Best2-GS交互界面残基的贡献。
（一个)柱状图显示瞬时转染指示hBest2和hGS结构的HEK293细胞的全细胞裂解物中的GS活性;每组N = 3。（b) FRET双杂交分析的相互作用的hGS和金星标记的hBest2结构。柱状图显示1/Kd,滚开相互作用的;每组N = 3;＊pwt -突变对与WT-WT对相比，从左到右分别为0.01、0.01、0.02和0.01。（c)柱状图显示短暂转染指示hGS结构的HEK293细胞的胞浆裂解物中的GS活性;每组N = 3;＊p与WT hGS转染的细胞相比，未转染和hGS R299E转染的细胞分别为9E-3和0.02。（d) hBest2在存在hGS G23A或K52A突变体(品红三角形，每组n = 7)时的种群稳态电流密度-电压关系，而没有(黑色三角形，n = 9)或WT hGS(红色圆圈，n = 5)时的hBest2在1 μM [Ca2 +］我瞬时转染HEK293细胞;＊p= 0.04，与仅表达hBest2的细胞电流相比。所有误差条以平均值+/−SEM表示;p值由双尾未配对的Student 's计算t测试。
图7 hBest2变异体的反转势和hGS的影响。
（一个-b)柱状图显示瞬时表达hBest2和hGS结构的HEK293细胞在1 μM [Ca]时的逆转电位2 +］我在不同情况下:(一个)内谷氨酸和外氯−作为主要的阴离子;从左至右的组，N分别为5、8、9、11、7、11、5、6;＊p与仅表达WT hBest2的细胞电流相比，3A和K208A的电流分别为0.04和0.02。（b)内部Cl−而外源谷氨酸为主要阴离子;从左到右的组N分别为6、6、12、7、6、8、9、6和6。p从左到右分别为3E-5, 3E-4, 0.01, 2E-3和2E-7，与单独表达WT hBest2的细胞电流比较。所有误差条以平均值+/−SEM表示;p值由双尾未配对的Student 's计算t测试。
图8 hGS对hBest2对谷氨酸和谷氨酰胺渗透性的影响。
（一个，b)反转电位(一个)和谷氨酸与Cl的相对离子渗透率比−（b)瞬时表达hBest2的HEK293细胞与140 mM外谷氨酸和不同浓度的1 μM内谷氨酸[Ca2 +］我；从左到右的组，N分别为6、9、9、11、11和9。（c)瞬时表达hBest2和WT(红色，n = 8)或突变(蓝色，n = 11和7，分别为G12D和G12W) hGS的HEK293细胞在1 μM时的群体稳态电流密度-电压关系[Ca2 +］我内源性谷氨酸和外源性氯−作为主要的阴离子;＊p与WT GS相比，G12D和G12W都是0.03。（d)在1 μM瞬时表达hBest2(黑色，n = 10)或hBest2 + hGS(红色，n = 9)的HEK293细胞中，群体稳态电流密度-电压关系[Ca2 +］我内源性谷氨酰胺和外源性氯−作为主要的阴离子。（e)格式与d但与外谷氨酰胺和内氯−作为主要的阴离子;每组N = 11;＊p= 7E-3与hBest2单独比较。（f)计算的反转势d，e．所有误差条以平均值+/−SEM表示;p值由双尾未配对的Student 's计算t测试。
图9人NPE细胞中hBest2和hGS的敲除。
用qRT-PCR方法分析经scramble、hBest2特异性siRNA和hGS特异性siRNA处理的细胞中hBest2和hGS的相对mRNA水平，并与未处理的细胞归一化;每组N = 3;＊phBest2-和hGS-特异性siRNA处理的细胞中hBest2和hGS mRNA水平分别为5E-4和2E-3，与双尾未配对Student 's的scramble siRNA处理的细胞中hBest2和hGS mRNA水平比较t测试。所有误差条以平均值+/−SEM表示。
补充信息
权利与权限
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关于本文
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Owji, a.p.， Yu, K, Kittredge, A。et al。betstrophin -2和谷氨酰胺合成酶形成复合物释放谷氨酸。自然(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05373-x
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DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05373-x
