r环衍生的细胞质RNA-DNA杂交激活免疫反应

(a) Western blot显示siRNAs靶向的敲除效率对于SETX而且乳腺癌易感基因1海拉细胞。(b)分别使用DAPI和全细胞染色作掩膜，显示HeLa细胞核室和细胞质室分割的图像。比例尺为20 μm。(c)显示在固定的HeLa细胞上缺乏GFP蛋白结合的图像。比例尺为10 μm。(d) Western blot显示siCtrl和sisetx处理的HeLa细胞分别以Lamin B1和GAPDH为标记，分裂为可溶性核室和细胞质室。(e) cytoDRIP印迹显示随后HeLa细胞的细胞质杂化积累对于SETX使用第二个siRNA敲除。下拉前进行体外RH处理。(f) cytoDRIP印迹显示sisetx处理的HCT116细胞中细胞质杂化积累。下拉前进行体外RH处理。(g) cytoDRIP blot显示sibrca1处理的HCT116细胞中细胞质杂化积累。下拉前进行体外RH处理。(h) cytoDRIP blot显示plab处理的HeLa细胞(500nM, 3h)细胞质杂化积累。下拉前进行体外RH处理。(i) Western blot显示siRNAs靶向的敲除效率XPG而且XPF海拉细胞。(j) cytoDRIP blot显示XPG和XPF在细胞质杂交产生后的作用对于SETX或乳腺癌易感基因1在海拉细胞中敲除。(k)左，海拉细胞后的图像对于SETX而且XPG或XPF固定后用GFP-dRH蛋白敲除，mock或RH预处理。比例尺为10 μm。右，定量细胞质GFP-dRH强度;p值显示;双面曼惠特尼U检验:从左到右的n值:611,573,659,686。中线，中间;方框限制，75和25百分位，胡须，最小值和最大值。(l)在(k)中，但在(k)之后乳腺癌易感基因1在海拉细胞中敲除。双面曼-惠特尼U检验:从左到右的n值:526、502、633、653。中线，中间;盒子限制，75和25个百分位;胡须，最小值和最大值。(m) XPG生长素诱导脱氢酶(AID)体系示意图。(n)蛋白印迹显示XPG击倒后降解对于SETX(左)和乳腺癌易感基因1(右)在HCT116细胞中。(o) cytoDRIP印迹显示敲除蛋白后细胞质杂种的积累对于SETX或乳腺癌易感基因1以及生长素诱导的XPG降解对HCT116细胞的影响。

(a) cytoDRIP染色显示模拟或PlaB处理(500 nM, 3 h)的细胞质杂种伯灵顿^−−/贝克^−−/体外RH处理或不处理HeLa细胞。(b) BrdU孵育后异步或血清饥饿MCF10A细胞的流式细胞术分析。根据DNA含量(碘化丙啶染色)和BrdU强度对细胞进行分割。表示G1、S和G2/M的细胞百分比。每种条件下至少定量5万个细胞。(c) Western blot显示异步(异步)和血清饥饿(饥饿)MCF10A细胞分别以Lamin B1和GAPDH作为标记，分为可溶性核室和细胞质室。(d)来自异步或血清饥饿MCF10A细胞的RT-qPCR显示PlaB处理后未剪接mRNA增加(500 nM, 3小时)。所示为三个独立生物重复(n = 3)的平均值±s.d.， p值示于图中;未配对,双尾t以及。(e)与(c)相同，但用于包皮成纤维细胞。(f) EdU掺入后包皮成纤维细胞高含量成像的细胞周期定量，使用DAPI染色检测DNA含量。所示为三个独立生物重复(n = 3)的平均值±标准差。(g)同(d)，但用于包皮成纤维细胞。(h) cytoDRIP印迹显示，在DMSO或PlaB处理(500 nM, 3 h)后，从等量异步或血清饥饿的包皮成纤维细胞中提取的细胞质杂种，并在拉下前进行模拟和RH处理。(i)如在(b)，但对于伯灵顿^−−/贝克^−−/MCF10A细胞。(j) Western blot显示异步和血清饥饿的分离伯灵顿^−−/贝克^−−/分别以Lamin B1和GAPDH为标记，将MCF10A细胞转化为可溶性核室和细胞质室。(k) cytoDRIP印迹显示异步和血清缺乏的细胞质杂种伯灵顿^−−/贝克^−−/DMSO或PlaB处理MCF10A细胞(500 nM, 3 h)。每个样本体外RH处理，以确认杂交IP的特异性。(l)左，实验工作流程。右图，印迹显示从siCtrl或sisetx处理的HeLa细胞的细胞质或核质中分离出的杂交细胞，在收获前用mock或LMB处理(3小时，5 nM)。(m)左，实验工作流程。中，western blot如(c)所示，来自载体对照(DMSO)或PlaB处理过的HeLa细胞(500 nM, 3 h)。右，印迹显示(i)中的杂交，但在用LMB处理的HeLa细胞中(2小时，5 nM)，然后再用PlaB + LMB处理3小时。(n)用LMB(5小时，5 nM)或载体对照(ethh)处理的固定HeLa细胞中cyclin B1定位的代表性图像。比例尺为10 μm。(o)来自HeLa细胞的RT-qPCR显示，PlaB (500 nM)处理后未剪接mRNA增加。 Shown is the mean ± s.d. from three independent biological replicates (n = 3). (p) As in (o) but cells were treated with PlaB (500 nM, 3 h) and then fresh media was added following PlaB withdrawal for the times indicated. Shown is the mean ± s.d. from four independent biological replicates (n = 4).

(a)在cytodrop - seq siCtrl(左)和siSETX(右)复制之间显示高重复性的散点图;Pearson相关性:R分别为0.96和0.95;P < 1e-16(机器精度极限)。(b) Bar blot显示在cytoDRIP-seq样本中映射到细胞核和线粒体(mito)基因组的重复测序reads的比例。显示了来自两个生物重复的数据。(c) RH处理(RHR DRIP)后胞滴- seq、核滴- seq和核滴- seq峰值特征表。显示了峰的数量(峰数)、峰覆盖的基因组空间(峰面积)、峰的大小(平均值和中位数)、峰覆盖的基因组百分比(覆盖率)。IQR是四分位范围。(d) siCtrl和siSETX cytoDRIP-seq样品中鉴定的峰所占基因组区域的维恩图(以兆碱基为单位)。(e)条形图显示，相对于IgG, S9.6下拉后qPCR扩增了细胞质杂交位点。OPN3只在细胞核中发现;其他位点位于细胞核和细胞质中。所示为三个独立生物重复(n = 3)的平均值±标准差。(f) HeLa细胞耗竭后的cytoDRIP-qPCR对于SETX在cytoDRIP-seq位点和核R-loop形成位点。在杂交下拉之前，在体外进行RH处理。“Nuc+ Cyto+”位点存在于细胞核和细胞质中，而“Nuc+ Cyto-”位点仅存在于细胞核中。基因名称显示;IG1- - - - - -IG5是基因间位点。所示为4个独立生物重复(n = 4)的平均值±标准差;p值如图所示，未配对的双尾t以及。(g)散点图显示，在耗尽时，cytoDRIP-seq信号增加对于SETX在基因位点(上)和基因间位点(下)。虚线表示x = y。(h)基因(上)和基因间(下)cytodrop - seq位点的基因组浏览器视图。归一化轨道从上到下依次为:IgG、siCtrl(2个重复)、siSETX(2个重复)、nuclear DRIP-seq、nuclear DRIP-seq + RH。红色为负链信号，蓝色为正链信号。

(a)细胞滴注峰值在基因上的分布直方图。标记了转录起始位点(TSS)和转录结束位点(TES)的位置。(b)蓝色直方图显示了所有核R-loop峰中重复元素与随机采样的峰集(在大小和数量上与cytoDRIP峰匹配)之间的预期重叠。红色虚线表示观察到的cytoDRIP峰重叠。(c) (b)中计算的重叠的z值;各个p值显示在右边。(d)核滴滴- seq和细胞滴滴- seq读数与rDNA一致区域、着丝粒α卫星和端粒重复序列的比例。每个条件的数据来自两个独立的生物重复(n = 2)，黑线表示平均值。(e)柱状图显示细胞DRIP峰值重叠核DRIP和/或RNase H抗性杂交(RHR)位点的比例。(f)比较cytoDRIP-seq (siSETX条件)(Cyto)和核DRIP-seq (Nuc)峰的峰值长度直方图。 (g) Scatter plot correlating nuclear DRIP–seq signal at cytoDRIP regions with cytoDRIP–seq signal, Pearson’s correlation: R = 0.24. (h) Scatter plot correlating nascent transcription by global run-on sequencing at cytoDRIP regions with cytoDRIP–seq signal, Pearson’s correlation: R = 0.14. (i,j) Genome browser views showing lack of cytoDRIP signal at sites with robust nuclear R-loop formation (i)ACTB(j)RPL13A．归一化轨道从上到下依次为:IgG、siCtrl(2个重复)、siSETX(2个重复)、nuclear DRIP-seq、nuclear DRIP-seq + RH。红色为负链信号，蓝色为正链信号。(k) Western blot显示HeLa细胞稳定表达gfp标记的XPG。GAPDH是加载控件。(l)敲除HeLa细胞后的GFP ChIP-qPCR对于SETX和/或XPG，显示GFP-XPG在杂交位点结合。“Nuc+ Cyto+”位点存在于细胞核和细胞质中，而“Nuc+ Cyto-”位点仅存在于细胞核中。基因名称显示;IG1而且IG2是基因间位点。所示为三个独立生物重复(n = 3)的平均值±标准差;未配对的双尾t以及;p值显示出来。

(a)放线菌素D处理后的核滴漏- qpcr。核r -环站点具有短、平均和长半衰期²¹以及cytoDRIP位点。R-loop^负的表示一个r -环丰度较低的核遗址。标记了基因名称。IG1是一个基因间位点。所示为三个独立生物重复(n = 3)的平均值±标准差。寿命较短或中等的核位点与细胞drip位点之间的P = 9.81e-12(双尾Mann Whitney U检验)。(b)放线菌素D处理后的核滴漏- qpcr显示指数衰减的例子，以得出RNA-DNA混合半衰期。所示为三个独立的生物重复(n = 3)的平均值。(c)体外低RH(红色)或高RH(紫色)处理后，细胞drip区域周围显示核DRIP-seq信号的聚集图。输入信号为灰色。每一行是1762个基因峰的平均值(n = 1762)。误差带代表平均值的95% CI。(d)先前识别的基因组浏览器视图²¹长寿命的核R-loop基地。归一化轨道从上到下依次为:IgG、siCtrl(2个重复)、siSETX(2个重复)、核滴- seq、核滴- seq +。红色为负链信号，蓝色为正链信号。

(a)在cytoDRIP峰值处的趋同转录模型。RNA-DNA杂化是在非模板链上高gc -歪斜区域的正义和反义转录的结果。示例核苷酸序列，适合观察到的歪斜模式显示。(b)细胞DRIP (n = 2911)和核DRIP (n = 65,541)区域AT含量(左)和GC含量(右)的小提琴图，细胞DRIP和核DRIP区域之间的双尾Mann Whitney U: p = 3.6e-8(左)，p = 3.5e-16(右)。中线，中间;方框限制，75和25百分位，胡须，最小值和最大值。(c)基因核DRIP区域(n = 56,433)周围的聚集图显示GC歪斜(左)和AT歪斜(右)。误差带代表平均值的95% CI。(d)基因siCtrl细胞drip区域周围的聚集图显示GC歪斜(左)和AT歪斜(右)。显示了282个峰值(n = 282)的均值; error bands represent 95% CI of the mean. (e) Aggregate plots around genic siCtrl cytoDRIP regions showing cytoDRIP–seq signal (left), nuclear DRIP–seq signal (middle) and nuclear RHR signal (right). Means of 282 peaks (n = 282) are shown; error bands represent 95% CI of the mean. (f) Violin plots of AT content (left) and GC content (right) for siSETX (n = 2629) and siCtrl (n = 282) cytoDRIP regions, two-tailed Mann Whitney U between cytoDRIP and nuclear DRIP regions: p = 0.003 (left), p = 0.003 (right). Centre line, median; box limits, 75 and 25 percentiles, whiskers, min and max values.

(a) PlaB处理HeLa细胞后pIRF3的Western blot (500 nM)。GAPDH是加载控件。(b) Western blot显示第二个siRNA的敲除效率乳腺癌易感基因1．GAPDH作为加载控件。(c)蛋白印迹显示敲除蛋白后的pIRF3水平对于SETX或乳腺癌易感基因1在海拉细胞中使用第二种siRNA。(d) PlaB处理(500 nM, 3 h)对HCT116细胞中pIRF3的影响。(e)上:核定位信号(NLS)标记的野生型(WT)或催化非活性(D210N) RNase H1的示意图。HBD =混合绑定域，CD =连接域。下图:gfp标记的NLS-RNaseH1 WT/D210N的细胞定位。比例尺，20 μm。(f)敲除IRF3效应器后的RT-qPCR测量对于SETX或乳腺癌易感基因1MCF10A细胞。(g)生长素诱导XPG降解后pIRF3的Western blot检测对于SETX在HCT116细胞中敲除。GAPDH是加载控件。(h) Western blot检测敲除C-PARP水平对于SETX或乳腺癌易感基因1MCF10A细胞。(i) Western blot显示生长素诱导的XPG降解对siSETX或sibrca1处理的HCT116细胞中C-PARP的影响。同样的GAPDH印迹，即加载控制，在扩展数据图中使用。1 n．(j)左，RT-qPCR显示的敲除效率肿瘤坏死因子α海拉细胞。没错，免疫印迹显示C-PARP的水平肿瘤坏死因子α在sisetx处理的海拉细胞中。(k) Western blot显示敲除蛋白后的pIRF3水平对于SETX或乳腺癌易感基因1在伯灵顿^−−/贝克^−−/海拉细胞。(l)上:核输出信号(NES)标记的RNase HI示意图。下图:海拉细胞中gfp标记的RNase HI-NES的细胞定位。比例尺，20 μm。(m)敲除后细胞质杂交的cytoDRIP印迹对于SETX或乳腺癌易感基因1在模拟处理的HeLa细胞和稳定表达nes标记RNase HI的HeLa细胞中。柱状图为3个独立生物学重复(n = 3)的平均值±标准差(非成对双尾t检验，CI = 95%)。P值显示在图的顶部。

(a) Western blot显示sirna介导的敲除蛋白后pIRF3水平对于SETX,要么RIG1或MDA5海拉细胞。GAPDH是加载控件。(b) RT-qPCR显示的敲除效率瑞吉而且MDA5海拉细胞。(c) Western blot显示HeLa细胞中两种不同TLR3 siRNAs的敲除效率。(d) IRF3效应子的RT-qPCR测定TLR3用sisetx处理的两种不同sirna敲除伯灵顿^−−/贝克^−−/海拉细胞。(e)和(f) Western blot显示两个阴性对照(阴性)克隆和任意一个克隆的pIRF3水平注册会计师敲除克隆(e)或TLR3敲除克隆(f)在海拉细胞中使用CRISPR-Cas9系统生成。C1 =克隆1,c2 =克隆2。GAPDH作为加载控件。(g)在单独或联合抑制/敲除cGAS和IRF3效应物时的RT-qPCR测量TLR3对照组和siseetx处理的海拉细胞。(h)在(g)，但在伯灵顿^−−/贝克^−−/海拉细胞。(i)敲除蛋白后Caspase 3活性测定对于SETX,要么XPG敲除或cGAS抑制和TLR3.可拆卸的。(j) sirna介导的敲除cGAS和TLR3蛋白水平TLR3或注册会计师海拉细胞。(k)显示DNA (60 nt)和RNA (60 nt)寡核苷酸的琼脂糖凝胶可以退火形成DNA-RNA杂化体。(l) cGAS与双链DNA (dsDNA)结合(左)和TLR3与双链RNA (dsRNA)结合(右)的凝胶位移分析。(m)凝胶位移分析显示，人RNaseH1 D210N催化活性突变体和GFP蛋白分别与RNA-DNA杂交体结合，分别作为阳性和阴性对照。NP代表无蛋白质。柱状图为来自三个独立生物学重复(n = 3)的平均值±标准差(非成对双尾t检验，CI = 95%)。P值显示在图的顶部。

源数据

(a)用western blot方法检测用于S9.6 co-IP的细胞质部分的纯度。(b)来自细胞质部分的S9.6 co-IP显示在我们的方法中LysRS与细胞质杂种结合。据报道，LysRS与细胞质杂种相互作用，并作为阳性对照。(c)来自细胞质部分的S9.6 co-IP显示cGAS和TLR3与从sibrca1处理的细胞中分离出来的RNA-DNA杂交产物相关，以及IP步骤前37°c无酶模拟对照和体外RNase H处理的影响。RNase H处理，50 U ml⁻¹在37°C下放置1小时。(d)在IP反应中，来自S9.6 co-IP的细胞质部分显示，在siSETX诱导下，cGAS与杂种的结合被1 μM杂化竞争对手破坏;在IP反应中，TLR3与杂种的结合被3 μM杂化竞争对手破坏。Hyb =杂交。(e) Western blot验证TLR3 IP在实验中的有效性，通过执行TLR3 IP后再执行S9.6 IP检测TLR3相关细胞质杂种(图。4 h)．(f) Western blot检测对照或对照组HA免疫沉淀分离后的内溶酶体部分纯度对于SETX-耗尽HA-TMEM192 HEK293T细胞。用Flag-TMEM192 HEK293T细胞作为LysoIP的阴性对照。标记溶酶体(Lyso)、高尔基体(Golgi)、内质网(ER)和线粒体(Mito)的蛋白质。(g) Western blot显示对于SETX在HA-TMEM192 HEK293T细胞中，如在HeLa细胞中观察到的那样。这一结果表明，该细胞株适合于研究r -环诱导的免疫激活。本实验为LysoIP的对照(图。4我)．(h) cytoDRIP印迹显示敲除蛋白后细胞质杂交种水平升高对于SETXHA-TMEM192 HEK293T细胞。体外RNase H消化以确保IP的特异性。本实验也是LysoIP的对照。(i)敲除后细胞质杂交的cytoDRIP印迹对于SETX在HA-TMEM192 HEK293T细胞中敲除或不敲除XPG．(j) co-IP测试flag标记cGAS与内源性TLR3之间的相互作用。(k) co-IP测试内源性TLR3和cGAS之间的相互作用。(l)工作模式。左图:在野生型细胞中，核r -环被RNase H或RNA-DNA解旋酶有效地分解，如SETX。只有少量的r -环被XPG处理并转化为细胞质杂交，因此细胞质杂交水平低于IRF3信号通路激活所需的阈值。右:在某些扰动下，包括SETX/BRCA1的缺失，或在r -环去调控的病理条件下，可能无法有效分解的核r -环子集被XPG处理，导致RNA-DNA杂化在细胞质中积累。然后这些杂交体被细胞质和内溶酶体中的cGAS和TLR3识别，激活irf3介导的免疫信号和凋亡。

(a) RT-qPCR显示XPG siRNA在AOA2患者源性成纤维细胞中的敲除效率。(b) cytoDRIP印迹显示对照和AOA2患者来源的成纤维细胞的细胞质杂种，无论是否敲除XPG．(c) cytoDRIP印迹显示对照和AOA2患者来源的成纤维细胞的细胞质杂种，在混合IP之前无论是否进行了体外RNase H处理。(d) RT-qPCR显示的敲除效率TLR3在AOA2患者来源的成纤维细胞中。(e) RT-qPCR检测单独或联合抑制和敲除cGAS时的免疫效应物TLR3，分别在对照组和AOA2患者源性成纤维细胞中表达。(f) RT-qPCR显示SETX siRNA在对照成纤维细胞中的敲除效率。(g) RT-qPCR测定干扰素β和isg的击倒对于SETX对照成纤维细胞。(h) Western blot显示UWB1.289和UWB1.289+BRCA1细胞分别以Lamin B1和GAPDH为标记，分为可溶性核室和细胞质室。(i) cytoDRIP印迹显示，在混合IP之前，无论有无体外RNaseH处理，UWB1.289和UWB1.289+BRCA1细胞的细胞质杂种。(j) gfp标记的NES-RNaseHI在UWB1.289和UWB1.289+BRCA1细胞中的细胞定位。比例尺，20 μm。(k) RT-qPCR检测稳定表达GFP (mock)或nes标记RH (RH- nes)的UWB1.289和UWB1.289+BRCA1细胞中的免疫效应物。(l) RT-qPCR显示SAMHD1 siRNA在HeLa细胞中的敲除效率。(m) cytoDRIP blot显示对照组和samhd1缺陷的HeLa细胞在体外RNase H处理或未处理时的细胞质杂交。(n) cytoDRIP印迹显示对照和缺乏samhd1的HeLa细胞的细胞质杂交XPG可拆卸的。(o)左:蛋白印迹显示敲除蛋白后的pIRF3和C-PARP水平XPG在sisamhd1处理的HeLa细胞中。右图:蛋白印迹显示敲除后的pIRF3和C-PARP水平SAMHD1在模拟和RH-NES HeLa稳定细胞系中。siSAM = siSAMHD1。柱状图为来自三个独立生物学重复(n = 3)的平均值±标准差(未配对，双尾t检验，CI = 95%)。P值显示在图的顶部。

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