主要gydF4y2Ba

IL-17家族细胞因子发挥免疫系统和许多监管职能是高度有效的促炎症介质。IL-17细胞因子,一方面,对于障碍组织内稳态,但是另一方面充当司机各种自身免疫性疾病gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。激活IL-17-induced信号级联导致诱导炎症趋化因子的网站。cystine-knot的IL-17家族细胞因子由六名成员组成:IL-17A-F,展览微分绑定特异性5受体,IL-17RA-E。最佳IL-17细胞因子,IL-17A IL-17F,是由辅助T 17 (TgydF4y2BaHgydF4y2Ba17)细胞和升高的炎症gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。因此,单克隆抗体抑制IL-17A的活动和IL-17RA IL-17A的受体和IL-17F美国fda批准的药物斑块性银屑病和其他自身免疫性疾病gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。另一个家庭成员,IL-25, 2型免疫的主要监管机构gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba并为T是一个重要的治疗目标gydF4y2BaHgydF4y2Ba2-driven障碍包括过敏性哮喘和过敏性皮炎gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

中的明确的匹配和活动中的信号组件的成分在这个家庭已经很难辨别由于不同使用的共享(IL-17RA)和ligand-specific受体亚基。IL-17A和IL-17F需要IL-17RA和IL-17RCgydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba信号,而只有IL-17RB IL-25绑定gydF4y2Ba18gydF4y2Ba但需要IL-17RA和IL-17RB(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba信号)体内gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。IL-17A, IL-17F IL-25信号通过适配器蛋白质和E3泛素连接酶ACT1(参考文献。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba通过同型的),这与IL-17R交互与海基会/ IL-17R SEFIR IL-17R领域gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。IL-17RA提出作为常见IL-17R与大多数其他IL-17R heterodimeric复合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。已报告结构与IL-17F不完整的IL-17RA 1:1复合物gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,IL-17A-IL-17F异质二聚体gydF4y2Ba25gydF4y2Ba和IL-17AgydF4y2Ba26gydF4y2Ba分别在细胞因子离开一个假定的“开放的脸”空置的第二受体结合形成1:2配体:受体信号复杂。还有一个IL-17F结构绑定到两个IL-17RC homodimeric复杂gydF4y2Ba23gydF4y2Ba信号的能力仍不清楚。一方面,细胞反应IL-17A和IL-17F信号已被证明需要IL-17RA老鼠gydF4y2Ba16gydF4y2Ba和人类gydF4y2Ba27gydF4y2Ba;另一方面,IL-17F已被证实在小鼠细胞缺乏IL-17RA上调IL-33gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。因此,机械基础如何IL-17家族的细胞外接触导致的细胞因子受体信号仍有待结构定义。gydF4y2Ba

图1:低温电子显微镜结构二进制和高阶IL-25-IL-17RB复合物。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba示意图显示IL-25信号所需的组件:IL-17RB, IL-25 IL-17RA。gydF4y2BabgydF4y2Ba凝胶过滤色谱和sds - page凝胶图像IL-25-IL-17RB复杂(RB-IL-25)。高亮显示的凝胶排阻层析法曲线下的面积代表的混合分数集中和陶瓷的低温电子显微镜。MW,分子量。gydF4y2BacgydF4y2Ba二元的,二维分类(2:2)IL-25-IL-17RB homodimeric复合物和高阶IL-25-IL-17RB(六)复合物。规模的酒吧,55岁(2:2 2 d类平均)和125年(6:6 2 d类平均)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,低温电子显微镜的地图2:2 IL-25-IL-17RB复杂。gydF4y2BaegydF4y2Ba,2:2 IL-25-IL-17RB模型复杂。虚线表示未建模连接器的跨膜区域受体。gydF4y2BafgydF4y2Ba低温电子显微镜的高阶IL-25-IL-17RB地图(六)复杂,组成的三聚物IL-25-IL-17RB为。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

我们阐明的组成和结构完整heterodimeric IL-17-IL-17R信号复合体使用低温电子显微镜的互补方法(低温电子显微镜),单分子成像和基于单元的结构与信号实验。的低温电子显微镜结构IL-25-IL-17RB non-signalling IL-25-IL-17RB-IL-17RA信号复合体,IL-25并不预期IL-17RB和IL-17RA heterodimeric复杂形式。相反,与IL-17RB IL-25 homodimeric复杂形式,新兵的绑定IL-17RB IL-17RA在heteromeric 2:2:2三元复杂的受体相互作用通过membrane-distal技巧。使用这些结构,我们执行structure-guided功能研究表明IL-25变构诱发的形成这IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂IL-25所需信号。我们进一步附加IL-17-IL-17R复合物进行了低温电子显微镜研究来确定这种不同寻常的建筑的共性,发现装配的翼展receptor-receptor模式延伸到其他IL-17-IL-17R。因此,IL-17RA作为组织中心调解IL-17家庭信号膜通过代理直接IL-17受体配体或为受体。gydF4y2Ba

IL-25-IL-17RB复合物结构gydF4y2Ba

我们中的IL-25和IL-17RB Expi293F GnTIgydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞,筛选了一个稳定的复杂超过凝胶过滤(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。二维粒子在这个示例揭示了对称bi-lobed分类结构(图gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba),符合2:2 homodimeric受体复杂。使用一个倾斜的收集策略,我们确定IL-25-IL-17RB复杂的结构使用单粒子低温电子显微镜(图3.18全球解决。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba,扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba无花果和扩展数据。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。结构,IL-25形式与IL-17RB homodimeric 2:2复杂,集中在位于IL-25从事两份IL-17RB在其两个受体结合面(无花果。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在2 d IL-25-IL-17RB分类数据集,我们观察到的高阶IL-25-IL-17RB结构的类(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。进一步分类和细化显示排列三的2:2 IL-25-IL-17RB模块。我们提炼这些粒子产生全球地图(图4.39解决。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba,扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)。高阶IL-25-IL-17RB复杂的由一个核心IL-25-IL-17RB为两侧为两侧。虽然有,但原则上,继续聚合除此之外排列形成的可能,我们没有看到超越三为类。这些IL-25-IL-17RB为连接由IL-17RB membrane-distal技巧之间的交互类型III纤连蛋白D1域(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。生理相关性的高阶三聚物为还不清楚,但是鉴于IL-17RB本身并不是能够支持的信号,我们推测,这不是一个积极信号组装。gydF4y2Ba

IL-25三元结构复杂gydF4y2Ba

的目的,获得IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂的结构,我们混合过剩的纯化与纯化IL-25-IL-17RB IL-17RA在玻璃化低温电子显微镜(扩展数据图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。在初始二维分类,我们观察到类的粒子似乎IL-25-IL-17RB为与IL-17RA‘翅膀’(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。数据收集和细化导致C2-symmetric全球地图(图3.66解决。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba,扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba无花果和扩展数据。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)和证实,这些粒子确实是IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复合物(无花果。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

图2:低温电子显微镜的结构和建筑IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba二维分类三元IL-25-IL-17RB-IL-17RA复合物。酒吧,规模82(平均2 d类)。gydF4y2BabgydF4y2Ba,侧面C2-symmetric低温电子显微镜IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂的地图显示IL-17RA翅膀来自核心IL-25-IL-17RB复杂。gydF4y2BacgydF4y2Ba侧面的三元IL-25-IL-17RB-IL-17RA复杂模型显示这种D1 IL-17RA领域专门IL-17RB D1域的相互作用。虚线表示未建模连接器的跨膜区域受体。D2域的质量中心之间的距离。gydF4y2BadgydF4y2Ba顶视图IL-25-IL-17RB-IL-17RA复杂模型。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

三元复杂的由一个2:2 IL-25-IL-17RB homodimeric核心IL-17RA的两侧是两个副本(无花果。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba)。值得注意的是,不直接接触IL-25 IL-17RA分子,只与互动IL-17RB(无花果。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。D1域IL-17RA和IL-17RB互动membrane-distal技巧通过高度互补的表面(无花果。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。在这种几何,membrane-proximal IL-17RA和IL-17RB相距约94,而不是在附近其他类的二聚的信号受体细胞因子受体和rtk等。gydF4y2Ba

图3:Structure-guided IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂的功能研究。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、关键交互网站在三元复杂IL-17RB表面和IL-17RA突出显示。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba,关键要素参与IL-25-IL-17RB网站1 (gydF4y2BabgydF4y2Ba2),网站(gydF4y2BacgydF4y2Ba),网站2 b (gydF4y2BadgydF4y2Ba)和站点3 (gydF4y2BaegydF4y2Ba)所示。IL-17RB表面描述了光红色。唠叨,gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖。gydF4y2BafgydF4y2Ba,详细视图IL-17RA-IL-17RB翼展界面显示关键的二级结构,残留物和债券。浅紫色的IL-17RA表面被描述。gydF4y2BaggydF4y2BaIL-25突变体,减少了信号的功效。残留物被选为诱变基于关键角色IL-25-IL-17RB交互,所示gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba。NF-κB记者HEK293细胞与不同浓度的WT IL-25刺激或突变,然后化验转录活动。OD、光学密度。灰色虚线描绘了规范化的基线。gydF4y2BahgydF4y2BaIL-25点突变体gydF4y2BaggydF4y2Ba有能力受损引起IL-5从外周血单核细胞分泌。2、白介素2;TSLP,胸腺基质淋巴细胞生成素。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,基因缺失的基因编码IL-17RA(左)或IL-17RB(右)消除IL-25-induced NF-κB转录活动。淘汰赛(KO)生成的背景NF-κB HEK293转录记者线中使用gydF4y2BaggydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba。C11、B3, A2和B2 G12,代表不同的克隆。gydF4y2BajgydF4y2Ba记者,NF-κB HEK293细胞(IL-17RA和内源性IL-17RB)转染外源性WT IL-17RB或提示突变体,然后化验IL-25刺激转录活动。双突变体显示大大降低信号功效。提示突变界面的设计是基于分析gydF4y2BafgydF4y2Ba。数据gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2BahgydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba代表单个实验从三个独立的生物实验,而数据gydF4y2Ba我gydF4y2Ba来自实验一次。数据均值±道。gydF4y2BangydF4y2Ba= 2gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3gydF4y2BahgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

IL-25信号通过IL-17RB绑定gydF4y2Ba

有两种不同的中的和receptor-receptor接口协调复杂的装配:IL-25-IL-17RB IL-17RB-IL-17RA。我们审问IL-25-induced信号的每个接口的重要性。2:2 IL-25-IL-17RB复杂包含了三个不同的IL-25-IL-17RB互动网站每IL-25-IL-17RB共有6个地点(图二聚体。gydF4y2Ba3 a egydF4y2Ba)。站点1(埋表面积(BSA) = 499gydF4y2Ba2gydF4y2Bamembrane-distal尖端附近)是复杂的,包含IL-17RB D1域α1β7β8,和循环1和9日和IL-25β1β2,和循环(图2和4。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。在站点1,IL-17RB W34α1形式疏水口袋两边的循环回路1和9,L98和L101 IL-25循环2插入(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。网站2 (BSA = 636gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),附近的底部IL-17RB D1域,由IL-17RB D1β4,β5β7,和循环6和8和复合界面的N末端,3gydF4y2Ba10gydF4y2Ba螺旋、β1β2,β4 IL-25链和β3β4 IL-25链(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。关键站点2 residue-residue交互包括F135 IL-17RBβ7形成pi-stacking交互与Y106 IL-25β2第一链(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba),提示的Y94 IL-17RB循环6埋进槽由Y134和N136-NAGβ3 IL-25第二链(图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。网站3 (BSA = 760gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)是由螺旋链接器和IL-17RB D2域循环10、11、12、15和18和IL-25循环3 C第一链的末端,N末端,3gydF4y2Ba10gydF4y2Ba第二个链的螺旋循环2和3(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。在接口,一个IL-25链的N末端使IL-17RB螺旋链接器的接触(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba),而其他的C末端IL-25链线程通过螺旋链接器和D2域之间的缝隙IL-17RB(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

目视检查和比萨的分析gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba被用来选择几个关键IL-25残留物(Y92、L98 L101, Y106, Y134和M176)丙氨酸替代验证接触IL-25之间的接口和IL-17RB细胞表达IL-17RA IL-17RB(无花果。gydF4y2Ba3中gydF4y2Ba)。IL-25突变削弱了能力驱动基因表达在一个ACT1-expressing NF-κB记者细胞系,反映在增加half-maximal有效浓度(ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)值与野生型相比(WT) IL-25(无花果。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。一个突变,这个网站2突变Y92A,大大降低功效ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba超过3 log-fold转移相对于WT(无花果。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。网站2和网站3突变体也有能力受损2型细胞因子分泌刺激对人体外周血单核细胞(图gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IL-17RB-IL-17RA介导的信号gydF4y2Ba

审问IL-17RA-IL-17RB交互的角色在IL-25信号,我们生成的gydF4y2BaIL17RAgydF4y2BaCRISPR淘汰赛细胞系携带NF-κB-inducible记者问是否gydF4y2BaIL17RAgydF4y2Ba淘汰赛(保留内生IL-17RB表达式)可以应对IL-25。的gydF4y2BaIL17RAgydF4y2Ba淘汰赛中有一个完整的信号刺激时损失IL-25(无花果。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。我们还要求IL-17RA是否能够激活信号没有IL-17RB通过生成gydF4y2BaIL17RBgydF4y2Ba淘汰赛记者细胞系,观察到,他们也失去了应对IL-25(图的能力。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。这些结果提供强大的遗传证据表明对于IL-25 IL-17RB和IL-17RA都是至关重要的信号转导,独立证实了早些时候的发现gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

通过翼展IL-25信号接口gydF4y2Ba

IL-17RA IL-17RB专门进行交互,而不是IL-25,因此比直接的方式共同受体细胞因子受体(无花果。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。IL-17RA-IL-17RB接口(BSA = 570gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)是由互补表面由IL-17RAα1和循环1、3、6和8,IL-17RB 3gydF4y2Ba10gydF4y2Ba螺旋循环1和2、4、7和9(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。接口是由核心稳定中心附近的疏水相互作用,其主要交互由IL-17RAα1埋进槽由3gydF4y2Ba10gydF4y2Ba螺旋1和循环2和9的IL-17RB(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。同样,3gydF4y2Ba10gydF4y2Ba螺旋1-loop 4 IL-17RB埋成互补槽由IL-17RAα1和循环1和8(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。IL-17RA-IL-17RB接口由广泛的氢键网络进一步稳定和盐桥(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

关键界面残留选择基于视觉检查和比萨的突变分析。我们生成IL-17RB双突变体L40A; R46E D75A; R79E因为这些残留物形成的核心接口和/或接口上的盐桥周边(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba),我们也生产单一E148R电荷反转突变,我们预计会扰乱R140gydF4y2Ba类风湿性关节炎gydF4y2Ba-E148gydF4y2BaRBgydF4y2Ba盐桥的边缘复杂(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。在NF-κB转录记者细胞转染与WT或突变IL-17RB(无花果。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba),外生WT IL-17RB增强最大效应(gydF4y2BaEgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba由内生IL-17RB水平),而E148R单一突变了gydF4y2BaEgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba保持不变,双突变体的大大抑制(外生WT > E148R≈模拟转染>双突变体)。此外,NF-κB活动的等级次序gydF4y2BaEgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba支持并发EC的转变gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值,排序的功效:外生WT > E148R >模拟转染>双突变体(无花果。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

单分子成像的复合物gydF4y2Ba

了解相关的二元和三元低温电子显微镜结构在细胞环境中,我们量化homodimerization heterodimerization IL-17RB和IL-17RA活细胞的质膜。我们进行了双色荧光标记的单分子co-tracking IL-17RA IL-17RB用全内反射荧光显微镜(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5模拟gydF4y2Ba)。这些研究表明,IL-25诱发IL-17RB的形成为独立于IL-17RA,符合稳定IL-25-IL-17RB二聚体发现体外。单分子强度分析表明,高阶集群形成观察体外,但在一个相当低的水平(co-diffusing分数小于10%;扩展的数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。这种低水平的高阶集群是一致的价值观在低温电子显微镜样品,大约18%的粒子形成高阶集群。同样,我们观察到健壮IL-25-induced IL-17RA-IL-17RB复合物的形成(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),尽管水平大大低于IL-17RB homodimerization。这个结果是符合我们的三元复杂的结构模型和相对较低的亲和力与IL-25-IL-17RB IL-17RA交互复杂。在IL-17RB面前,IL-25还弱刺激homodimerization IL-17RA-IL-17RA同意2:2:2复杂结构(图观察。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。与此同时,没有改变IL-25-induced homodimerization IL-17RB被观察到IL-17RA(扩展数据图的存在。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。这些结果支持我们的模型IL-17RA招募到IL-25-IL-17RB复杂,而不是争夺直接IL-25绑定。轻微增加固定部分与分级减少扩散常数(扩展数据图。gydF4y2Ba5克,gydF4y2Ba)支持定义良好的复合物的形成与我们预测的结构化学计量学研究gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

图4:定量交互分析体外和活细胞显示IL-25-induced IL-17RB-IL-17RA绑定通过翼展界面。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba在质膜量化,IL-17RB-IL-17RA交互live-cell单分子成像。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,不同的受体标签计划用来审问IL-17RB (RB)和/或IL-17RA (RA) homodimerization和heterodimerization单分子co-tracking(上)。盒子,须情节显示相对二聚作用水平由单分子co-tracking homodimerization和heterodimerization IL-17RA和IL-17RB IL-25的缺失和存在(底部)。数量的细胞实验,分别是25和图4,49岁,4、22和2,21和2,51和5,48和5,23岁,2,和24和2列,从左到右。gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba,Heterodimerization IL-17RA-IL-17RB (gydF4y2BabgydF4y2Ba)和homodimerization IL-17RB (gydF4y2BacgydF4y2Ba)与IL-17RB IL-17RA-IL-17RB突变界面。数量的细胞实验,分别是22和2,21岁,2、12和1,13和1,19岁,2,18 - 2,18 - 1,17日和1的每一列gydF4y2BabgydF4y2Ba,25 - 4,49岁,4,26和2、29和2,17岁,2,28和2,18 - 1,18 - 1的每一列gydF4y2BacgydF4y2Ba,从左到右。统计数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba进行了使用两个示例Kolmogorov-Smirnov测试(不显著(NS);* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001和* * * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)。盒子,晶须的阴谋gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba显示5号数据的总结:至少,第一四分位数、中位数、第三个四分位数,和最大值。gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2BaSPR sensorgrams透露,IL-17RB复合物IL-17RA IL-25绑定。分析物的浓度范围gydF4y2BadgydF4y2Ba是一个双重的连续稀释µM从20到0.156。分析物的浓度范围gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BafgydF4y2Ba是双重的连续稀释µM从40到0.156。离解常数(gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Basensorgrams)表示。SPR sensorgrams代表的是单一的实验(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1)gydF4y2BadgydF4y2Ba和两个独立的实验之一(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BafgydF4y2Ba。ND,不确定;俄文、响应单元。gydF4y2BaggydF4y2Ba,IL-25-IL-17RB-IL-17RA信号通路模型推断从我们的结构,信号和生物物理数据。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

我们还利用单分子co-tracking评估IL-25信号的能力不足IL-17RB突变体(L40A; R46E D75A; R79E和E148R)我们化验(无花果。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba)相互关联和IL-17RA。符合细胞信号的实验中,我们观察到显著降低细胞因子诱导heterodimerization WT IL-17RA突变IL-17RB, L40A; R46E D75A; R79E双突变体消除IL-25-IL-17RA-IL-17B复杂的形成,而E148R单突变体保留低水平的IL-17RB-IL-17RA协会(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。相比他们的大影响IL-17RA-IL-17RB heterodimerization, E148R D75A; R79E IL-17RB突变体有轻微或检测不到影响细胞因子诱导IL-17RB-IL-17RB homodimerization,而L40A; R46E双突变体也显著减少self-association(无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。这些研究结果突出的相关性预测IL-17RA-IL-17RB界面IL-17RA的招聘IL-25-induced IL-17RB-IL-17RB homodimerization。减少IL-17RB L40A二聚作用;R46E变异可以解释这些残留导致的形成高阶IL-25-IL-17RB数组。gydF4y2Ba

IL-25质数IL-17RB IL-17RA绑定gydF4y2Ba

连同我们的低温电子显微镜结构和突变信号的数据,我们的单分子跟踪数据支持一个装配模型的绑定IL-25与IL-17RA IL-17RB诱发IL-17RB协会,以及高阶IL-17RB的形成低聚物(无花果。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)。直接测试这个模型,我们进行了表面等离子体共振(SPR)绑定的研究来评估是否IL-25绑定IL-17RB增强的亲和力IL-17RB IL-17RA或IL-17RB。我们发现IL-25使IL-17RB结合固定化IL-17RA(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba),如IL-17RB独自没有绑定到固定化IL-17RA(无花果。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。此外,IL-25没有直接与IL-17RA交互(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba),符合缺乏IL-25-induced IL-17RA-IL-17RA协会在我们的单分子跟踪数据(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。我们还发现,IL-25-bound IL-17RB复杂,但不是IL-17RB孤独,可以绑定到固定化IL-17RB(扩展数据图。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba)。然而,我们观察弱的相互作用gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba与固定化IL-17RB -IL-17RA(扩展数据图。gydF4y2Ba6 jgydF4y2Ba),尽管低亲和力(13.8µM)比IL-25-IL-17RB复杂绑定固定化IL-17RA(5.2µM)。尽管疲软的gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba-IL-17RB -gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba-IL-17RA交互检测到SPR,我们没有检测到一个IL-25-independent IL-17RB-IL-17RA交互使用单分子live-cell成像(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。我们评估的影响也表现SPR IL-17RB L40A; R46E D75A; R79E突变体IL-25-IL-17RB复合物IL-17RA或IL-17RB绑定。我们没有检测绑定这些突变体复合物固定化IL-17RA(扩展数据图。gydF4y2Ba6 b, cgydF4y2Ba)或IL-17RB(扩展数据图。gydF4y2Ba6小时,我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总的来说,我们的结构(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba),细胞信号(图。gydF4y2Ba3 g-jgydF4y2Ba)和生物物理(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)数据模型支持的绑定IL-25间接IL-17RB启动信号,也许变构,提高IL-25-IL-17RB-IL-17RA形成三元复合物通过IL-17RB-IL-17RA翼展接口。原则上,活跃的三元复杂的装配路径可以通过两个途径进行:(1)形成IL-25-IL-17RB homodimeric,或(2)高阶IL-25-IL-17RB复合物,其次是招募IL-17RA通过翼展接口生成信号复杂(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)。这些数据符合的要求IL-17RA和IL-17RB IL-25信号体内gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并提供一个机械的解释IL-25信号通过IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂。gydF4y2Ba

守恒的翼展架构gydF4y2Ba

我们进行了低温电子显微镜研究IL-17A-IL-17RA IL-17A-IL-17RA-IL-17RC复合物。我们中的包含IL-17A co-purified复合物,IL-17RA IL-17RC。这些分子在单分散高峰co-eluted凝胶过滤IL-17A-IL-17RA有一个明显的1:1化学计量学,和IL-17RC sub-stoichiometric在sds - page(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)。使用单粒子低温电子显微镜,我们决定从2.51解决3 d重建IL-17A-IL-17RA二聚体相互作用的技巧IL-17RA分子(图。gydF4y2Ba5模拟gydF4y2Ba,扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba七氟gydF4y2Ba)。我们还确定一个3 d重建未成年人口的类包含IL-17A-IL-17RA二聚体与单个IL-17RC绑定到IL-17A(图3.01的决议。gydF4y2Ba5 e, fgydF4y2Ba,扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba七氟gydF4y2Ba);这个结构包含一个完整的副本IL-17RA-IL-17A-IL-17RC异质二聚体。翼展接口IL-17A-IL-17RA和IL-17A-IL-17RA-IL-17RC结构中添加与IL-17RB-IL-17RA翼展IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂界面和IL-17RB-IL-17RB翼展界面的高阶IL-25-IL-17RB复杂(图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba),揭示大型守恒IL-17RA-IL-17RA之间的间距和IL-17RA-IL-17RB membrane-proximal域,这有可能影响细胞内的组装ACT1下游信号分子,可以支持。gydF4y2Ba

图5:翼展架构是守恒的低温电子显微镜结构IL-17A-IL-17RA IL-17RA-IL-17A-IL-17RC复合物。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba边的地图视图(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和模型(gydF4y2BabgydF4y2Ba)IL-17A-IL-17RA翼展二聚体。IL-17-IL-17RA复合物的结构由化学活性彼此通过IL-17RA-IL-17RA翼展接口。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba前视图的映射(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和模型(gydF4y2BadgydF4y2BaIL-17-IL-17RA的)gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba边的地图视图(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和模型(gydF4y2BafgydF4y2Ba)的一个IL-17A-IL-17RA复杂的绑定到一个IL-17RA-IL-17A-IL-17RC异质二聚体通过IL-17RA-IL-17RA翼展接口。gydF4y2BaggydF4y2Ba,叠加IL-17A-IL-17RA翼展二聚体的翼展组件IL-25-IL-17RB-IL-17RA复杂和高阶IL-17RB-IL-17RB数组显示,翼展架构在IL-17-IL-17R复合物是守恒的。虚线表示未建模连接器的跨膜区域受体。的质量中心之间的距离membrane-proximal域所示gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba和gydF4y2BaggydF4y2Ba。gydF4y2BahgydF4y2Ba信号的共享IL-17-IL-17R机制模型,对转导IL-17 IL-17RA的间距是重要的信号。RC, IL-17RC。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

这项研究提供了一些结论,提供进一步的洞察IL-17家族的受体生物学。首先,IL-17RA具有非同寻常的能力作为受体,细胞因子参与IL-25复杂,或直接参与细胞因子受体更传统的角色,正如我们所看到的在IL-17A IL-17F复合物。第二,我们的研究结果进一步支持了这种观点,即IL-17RA是中央信号中心的信号需要家人和大多数已知IL-17家庭成员。共享信号受体的使用也是一个JAK-STAT细胞因子的功能,例如,常见IL-17RAγ链是一个类似的角色。然而,与常见的γ链,这是成对的异质二聚体ligand-specific受体亚基,IL-17RA的上下文中可以信号直接与细胞因子或作为受体。gydF4y2Ba

第三从我们的研究发现,翼展二聚体组装可能代表一个结构性的组织原则IL-17家庭成员聚集到信号复合物。翼展受体的建筑出现在我们的低温电子显微镜结构IL-17RA-IL-17RA二聚体(无花果。gydF4y2Ba5模拟gydF4y2Ba),另一个IL-17RA-IL-17RA翼展二聚体与IL-17RC绑定到一份IL-17A(无花果。gydF4y2Ba5 e, fgydF4y2Ba)。这些IL-17A-containing结构重合的翼展接口上排列IL-25-IL-17RB和IL-25-IL-17RB-IL-17RA(图三元结构。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。我们也调查了电子密度地图IL-17RA-IL-17F的晶体结构gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,IL-17RA-IL-17AgydF4y2Ba26gydF4y2Ba和IL-17RA-IL-17A / FgydF4y2Ba25gydF4y2Ba复合物,发现IL-17RA-IL-17RA翼展接口在所有的晶体(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。IL-25的能力的基础上提高IL-17RB IL-17RA绑定,我们假设IL-17A绑定稳定IL-17RA membrane-distal提示,使IL-17RA-IL-17RA二聚(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。此外,翼展接口是缺席的晶体结构homodimeric IL-17F-IL-17RC复杂gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,可能由于带负电荷的9个氨基酸的插入循环IL-17RC membrane-distal提示的(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结合IL-25 IL-17RB和IL-17A IL-17RA导致翼展二聚在站点配体结合的远端站点,暗示受体的细胞因子诱导的启动通过变构效应。这种交互的unliganded IL-17RA不形式,并利用SPR,我们表明,IL-25-bound IL-17RB具有较高的亲和力IL-17RA比独自IL-17RB(扩展数据图6 a、d j)。从这些观察中,我们得出结论,结合配体诱导结构稳定或重排,也许简单点灵活的循环,导致“启动”的翼展结合位点(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。通常,在中的二聚的系统,如JAK-STAT细胞因子,细胞因子作为一个二聚体和一个细胞因子之间的桥梁形式直接接触与受体亚基作为交联剂。对于IL-17A IL-17F,他们似乎有能力形成公认的non-signalling homodimeric复合物(例如,使用IL-17RC)和heterodimeric信号复合物(例如,IL-17RA-IL-17RC)。假定的不称职的二进制信号复合物之间的平衡和信号主管三元配合物,在IL-25和IL-17A / F,可能是由质量决定的行动作为配体浓度的函数和细胞表面受体表达水平,突出IL-17家族的受体生物学的复杂性。gydF4y2Ba

的signalling-competent heteromeric IL-17-IL-17R复合物采用的几何IL-17RA跨膜域间隔远,而假定的non-signalling IL-25-IL-17RB和IL-17F-IL-17RC homodimeric受体复合物有很近的跨膜域(无花果。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)。配体的间距IL-17RA与先前的研究结果显示,在我们的结构是一致的IL-17RA间距增加配体结合后,也许是为了适应细胞内蛋白激酶的大小gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba。我们假设翼展体系结构提供了最优安排IL-17R胞内域所需的同型的IL-17R-SEFIR-ACT1相互作用和信号转导(无花果。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)。还需要进一步的研究来确定翼展架构曲调IL-17-IL-17R复合物的间距和几何和ACT1信号。gydF4y2Ba

使用anti-IL-17A单克隆抗体拮抗剂secukinumab ixekizumab,以及anti-IL-17RA单克隆抗体brodalumab,块大多数IL-17家族细胞因子,已成功治疗严重的斑块性银屑病gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。的结构特点IL-17R翼展交互与小分子针对兼容,例如,抑制异常IL-25信号在哮喘或牛皮癣。IL-17家族细胞因子信号的结构和组织原则提供了一个蓝图受体激动剂和拮抗剂疗法的发展。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

蛋白表达和纯化gydF4y2Ba

表达的蛋白质结构研究是Expi293 GnTIgydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞(热费希尔)。结合研究和功能研究,蛋白质在Expi293F细胞(热Fisher)表示。所有的蛋白质都表达在37°C在湿润环境中含有5%股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。细胞培养上清液被收割3 - 4天post-transfection和个体蛋白质复合物和纯化使用Ni-NTA从上层的亲和色谱法在20毫米消息灵通的pH值7.4和150毫米氯化钠(HBS 20/150 pH值7.4)50 mM咪唑咪唑(洗)和200毫米(洗脱)。蛋白质由凝胶排阻层析法进一步纯化使用Superdex增加200 10/300 GL列(Cytiva)在哈佛商学院20/150 pH值7.4。gydF4y2Ba

本研究使用人类细胞因子和受体序列。IL-25氨基酸30至177(30 - 177)表示一个Igκ信号肽和c端HRV3C-protease-cleavable (3 c) Avitag-6×盯住他的标记BacMam向量gydF4y2Ba33gydF4y2Ba或血凝素(HA)信号肽和c端Avitag-6×他标签EF-1α启动子的控制下,土拨鼠肝炎病毒转录后的反应元素(WPRE)慢病毒载体。IL-17A(24 - 155)表达HA信号肽和c端3 c-avitag-6×他标签pD649向量(亚)。IL-17RB(1 - 288)与c端表示3 c-proteinc-8×他标签pVLAD6向量gydF4y2Ba34gydF4y2Ba或与c端Avitag-6×他标签pD649向量。IL-17RA(1 - 317)与c端表示3 c-proteinc-8×他标签pVLAD6向量或c端3 c-proteinc-8×他标签EF-1α启动子的控制下,WPRE慢病毒载体。IL-17RC(1 - 468)(同种型2)(Uniprot标识符Q8NAC-2)表达与c端3 c-proteinc-8×他标签pVLAD6向量。gydF4y2Ba

生物素酰化,蛋白质与Avitags网站使用生物素生物素化的连接酶BirA并使用凝胶排阻层析法纯化。gydF4y2Ba

SPRgydF4y2Ba

绑定研究进行Biacore T100 (Cytiva)。SPR数据收集使用Biacore T100 2.0.4版本控制软件。大约,300响应单位(俄文)网站的生物素化的IL-17RA, IL-17RB或无关的负控制参考蛋白质被固定到一系列年代传感器芯片SA (Cytiva)。为每个绑定周期,2 M MgCl的再生条件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba是使用。数据处理采用Biacore T100评价软件,2.0.4版本(Cytiva)。离解常数计算了稳态关联分析。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

细胞系来源如下:海拉细胞为单分子成像是来自德国的微生物和细胞培养GmbH 57 (ACC);费舍尔Expi293F细胞(热);Expi293F GnTI——(热费希尔);IL-17C HEK-Blue NF-kB记者细胞(Invivogen)。细胞系验证如下:海拉细胞(德国的微生物和细胞培养GmbH), Expi293F细胞(热费希尔)Expi293F GnTIgydF4y2Ba−gydF4y2Ba(热费希尔)和IL-17C HEK-Blue NF-κB记者细胞(Invivogen)担保的供应商和没有额外的身份验证是由本研究的作者。海拉细胞为单分子成像测试负支原体(PCR)。Expi293F细胞(热费希尔)和Expi293F GnTIgydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞(热费希尔)用于蛋白质生产没有检测支原体污染,这项研究的作者。的IL-17C HEK-Blue NF-κB记者细胞(Invivogen)是由制造商和检测支原体污染的没有额外的测试是由本研究的作者。gydF4y2Ba

NF-κB转录记者分析gydF4y2Ba

IL-17C HEK-Blue记者细胞(Invivogen)稳定表达人类IL-17RA ACT1, NF-κB-inducible胚胎分泌碱性磷酸酶(SEAP)报告基因和内源性IL-17RB被用来确定NF-κB活动刺激IL-25或IL-17RB突变体。表面的表达外源IL-17RB变异是通过细胞外公顷标记的抗原决定基染色量化和显示重叠,但小的差异表达。双突变体显示大大降低信号功效,这不是用表面表达的差异来解释。IL-25化验,乘25000细胞在一夜之间被播种到96 -微型板块的不同剂量的IL-25 (WT或突变)。IL-17RB化验,细胞转染质粒编码WT或突变IL-17RB,然后播种到96孔板的WT IL-25 24 h post-transfection。隔夜的刺激后,SEAP活动决心使用Quanti-BLUE试剂根据制造商的方向(Invivogen)和阅读在640 nm的吸光度SpectraMax范式板读者使用SoftMax Pro v7.1(分子设备)。根据制造商的指示细胞被维护。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaIL17RgydF4y2Ba淘汰赛细胞系gydF4y2Ba

IL-17C HEK-Blue记者细胞(Invivogen)与单导RNA转染12-well板块的定位gydF4y2BaIL17RAgydF4y2Ba或gydF4y2BaIL17RBgydF4y2Ba和Cas9核酸酶(Synthego)使用Lipofectamine CRISPRMAX Cas9转染试剂(热费希尔)。五天post-transfection,细胞被播种到10厘米的菜肴在限制稀释。2 - 3周后,布置得井然有序单菌落(通过克隆光盘)转移到24-well盘子,然后扩大筛查IL-25受体表达和响应能力的损失。gydF4y2Ba

人类标本收集gydF4y2Ba

外周血单核细胞(PBMCs)从斯坦福大学获得血液中心从健康的捐赠者。书面知情同意之前从捐赠者获得组织收集和伦理监督保证了斯坦福血液中心。gydF4y2Ba

大部分PBMC IL-5分泌物化验gydF4y2Ba

PBMCs从健康的捐赠者从斯坦福大学获得血液中心。人类PBMCs孤立使用聚蔗糖密度梯度离心法从捐赠者LRS钱伯斯(Cytiva)和低温贮藏直到时间的使用。试验是改编自ref。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba以下修改:PBMCs刺激在96 -与不同浓度的IL-25圆底板块(WT或突变体)在1纳米MSA-hIL-2 ng和0.7海里(约10毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)rhTSLP (Peprotech)。72 h后,收集上清液和IL-5的浓度是由ELISA(研发系统)在450 nm的吸光度SpectraMax范式板读者使用SoftMax Pro v7.1(分子设备)。gydF4y2Ba

单分子成像和分析gydF4y2Ba

细胞表面标记,IL-17受体氨基端融合使用pSems合适的标签向量包括Igκ的信号序列(pSems-leader)gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。IL-17RA(24 - 866)是融合荧光单体的GFP (mXFP)gydF4y2Ba37gydF4y2Ba;IL-17RB(18 - 502)是ALFA-tag融合gydF4y2Ba38gydF4y2Ba。57岁的海拉细胞(ACC DSMZ德国)是培养和暂时性的转染如前所述gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。Anti-GFP和anti-ALFAtag nanobodies网站专门标记与488年阿,Cy3b,通过c端半胱氨酸Rho11或阿643gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba被添加的浓度2和2.5 nM,分别成像之前至少10分钟。gydF4y2Ba

单分子成像是由dual-colour全内反射荧光显微镜使用一个倒置显微镜(IX71,奥林巴斯)配备了光谱图像分配器(DualView、光学Insight)和一个黑色背景电子倍增CCD相机(iXon DU897D,和或技术)。荧光体被同时兴奋照明561 nm激光(CrystaLaser;W约32厘米gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba)和642 nm激光(ο:约22厘米gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba)。150帧的图像栈记录每次每个单元解决32每帧女士,至少有10个细胞记录在每个实验。配体在孵化前15分钟成像。所有成像实验在室温下进行。gydF4y2Ba

Dual-colour延时图像评估使用一个内部开发的MATLAB软件(SLIMfast4C,gydF4y2Bahttps://zenodo.org/record/5712332gydF4y2Ba详细)如前所述gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。与基准标记根据校准通道登记后,分子是局部使用多目标跟踪算法gydF4y2Ba39gydF4y2Ba。固定发射器被时空聚类分析过滤掉gydF4y2Ba40gydF4y2Ba。逐帧co-localization co-tracking,截止半径100海里内应用跟踪硝唑发射器使用utrack紧随其后gydF4y2Ba41gydF4y2Ba。分子co-diffusing 10帧或更多被确定为二聚体。相对水平homodimerization和heterodimerization基于硝唑粒子的分数决定的gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。扩散性质测定从单一轨迹汇集使用平均平方位移分析的所有轨迹一生大于10帧。扩散常数测定的平均平方位移线性回归。gydF4y2Ba

低温电子显微镜gydF4y2Ba

整除3μl IL-25-IL-17RB IL-25-IL-17RB-IL17RA或IL-17RA-IL-17A-IL-17RC复合物被应用到仪Quantafoil或AuUltrafoil(1.2/1.3)网格。IL-25-IL-17RB, IL-25-IL-17RB-IL-17RA网格涂抹1 - 2 s在100%湿度的抵消−15和冻结陷入液态乙烷使用Vitrobot Mark IV(热费希尔)。IL-17RA-IL-17A-IL-17RC复合物,0.01%氟辛基maltoside (Anatrace)添加在玻璃化;3.5秒在100%湿度的网格被玷污的抵消−1和冻结陷入液态乙烷使用Vitrobot Mark IV(热费希尔)。IL-25-IL-17RB和IL-25-IL-17RB-IL-17RA网格成像300 keV泰坦克里奥尔语低温电子显微镜(热费希尔)配备了K3相机(Gatan)斯坦福低温电子显微镜中心(cEMc)和IL-17RA-IL-17A-IL-17RC网格成像300 keV泰坦克里奥尔语低温电子显微镜(热费希尔)配备了K3相机(Gatan)霍华德·休斯医学研究所(日前Janelia低温电子显微镜研究校园设施。视频收集在一个校准放大对应0.8521的每个物理像素cEMc和1.06 Janelia每个物理像素。剂量将总共50-53每一个电子gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。自动化数据采集进行了使用SerialEM名义散焦范围设定在0.8−−2.2μM之间的增量。所有网格成像阶段0°倾斜。IL-25-IL-17RB网格是另外的阶段倾斜成像40°和IL-25-IL-17RB-IL-17RA电网另外成像阶段35°倾斜。gydF4y2Ba

低温电子显微镜图像处理gydF4y2Ba

视频处理使用cryoSPARC v3.1.0或v3.2.0 (ref。gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。视频运动校正,对比传递函数确定,粒子使用cryoSPARC住处理功能。在此处理过程中,他们用显微图来物理像素大小。gydF4y2Ba

低温电子显微镜数据处理gydF4y2Ba

所有的2 d进行了分类和3 d重建使用cryoSPARC v3.1.0或v3.2.0。IL-25-IL-17RB 2:2的二进制复杂,粒子被倾斜状态,保持分开reference-free 2 d进行分类,把1125580个粒子在明确定义的类。从这里的一个子集51000 0°倾斜粒子和83439 40°倾斜粒子被选来生成一个从头开始的模型。这个从头开始模型被用于两轮迭代异构细化对垃圾类,使用1125580 -粒子堆栈。这导致一个类有712571粒子,3.53一项决议的精制时非均匀细分gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。慷慨的面具在2:2复杂在当地使用细化与一个支点中心质量,导致3.43重建。粒子运动再次纠正使用每个粒子运动校正。运动校正后,当地精致又跑了,导致3.18重建。这张地图是然后使用DeepEMhancer磨gydF4y2Ba44gydF4y2Ba在宇宙gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba网络服务器。gydF4y2Ba

IL-25-IL-17RB 6:6二进制复杂,最初的处理是在2:2复杂生成初始二维平均水平。此时,untilted和倾斜粒子结合re-extracted在一个更大的盒子大小的2.3倍。二维分类运行和类包含明显的特定复杂的选择,留下297300个粒子。选择粒子生成三个从头开始模型,然后处理一轮异构提纯。这导致一个类有131696粒子,4.39一项决议的精制时非均匀细分gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。这张地图是然后使用DeepEMhancer磨gydF4y2Ba44gydF4y2Ba在宇宙gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba网络服务器。gydF4y2Ba

为IL-25-IL-17RB-IL-17RA 2:2:2三元复杂,粒子被他们的倾斜状态保持分开,reference-free 2 d进行分类和的一个子集42208 0°倾斜粒子和55376 35°倾斜粒子被选来生成一个从头开始的模型使用C2对称。这个从头开始模型被用于四个轮迭代异构细化对垃圾类,使用1287497 -粒子堆栈。这导致一个类有509311粒子,3.86一项决议的精制时非均匀细分gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。粒子运动再次纠正使用每个粒子运动校正。运动校正后,再次运行不均匀细化,导致3.66重建。这张地图是然后使用DeepEMhancer磨gydF4y2Ba44gydF4y2Ba在宇宙gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba网络服务器。gydF4y2Ba

IL-17A-IL-17RA 2:2的二进制复杂,reference-free 2 d进行分类和323298 0°倾斜的一个子集粒子被选来生成一个从头开始的模型。这个模型被用于四个轮迭代异构细化对垃圾类和一个类代表三元复杂,使用6529311个粒子。这导致一个类有2986310粒子,2.51一项决议的精制时非均匀细分gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。这张地图是然后使用DeepEMhancer磨gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为IL-17-RA-IL-17A-IL-17RC 2:2:1三元复杂,reference-free 2 d进行分类和98949 0°倾斜的一个子集粒子代表不同的三元观点被选来生成一个从头开始的模型。这个模型被使用在6轮迭代异构细化对垃圾类和一个类代表二进制复杂,使用6529311个粒子。这导致一个类有542344粒子,3.01一项决议的精制时非均匀细分gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。这三元地图定向排列被认为有更多的偏见和各向异性相比二进制复杂,可能由于问题排序二元和三元类之间在特定角度。这张地图是然后使用DeepEMhancer磨gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

模型细化和结构分析gydF4y2Ba

一般来说,晶体结构的模型,或Alphafold低温电子显微镜结构gydF4y2Ba46gydF4y2Ba模型手动对接UCSF妄想或UCSF ChimeraX低温电子显微镜图gydF4y2Ba47gydF4y2Ba。与凤凰模型然后使用刚体精制提纯gydF4y2Ba48gydF4y2Ba细化与伊索尔德紧随其后gydF4y2Ba49gydF4y2Ba迭代手册,进一步建设和改进的傻瓜gydF4y2Ba50gydF4y2Ba和凤凰。gydF4y2Ba

高阶的二进制复杂,精制IL-25-IL-17RB二进制复杂模型被停靠到高阶地图和精制中使用真实空间细化凤凰。地区的高阶模型,没有相应的密度被移除和聚糖不是模仿。gydF4y2Ba

IL-25-IL-17RB-IL-17RA三元复杂,IL-25-IL-17RB二进制的IL-17RA晶体结构复杂和蛋白质数据库(PDB) ID 3 jvf停靠进地图,精致的手工和在凤凰使用真实空间细化。由于质量密度的D2域IL-17RA, D2域3 jvf停靠进地图,不接受手工精致。gydF4y2Ba

IL-17-IL-17RA-IL-17RC三元复杂,IL-17-IL-17RA二进制复杂和IL-17RA晶体结构从PDB标识6 hg9停靠进地图,精致的手工和在凤凰使用真实空间细化。由于电子密度的质量D3、D4 IL-17RC域,D3、D4域6 hg9停靠进地图,不接受手工精致。gydF4y2Ba

接口进行了分析使用比萨,ChimeraX PyMOLgydF4y2Ba51gydF4y2Ba(薛定谔)。使用ChimeraX所有结构数据。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

样本大小没有预先确定使用统计方法。调查人员没有盲实验样本的身份。单分子数据检测正常,由于non-normality的一些样本,非参数两个示例Kolmogorov-Smirnov测试是用来计算样本之间的差异。数据绘制和统计计算使用棱镜9 (GraphPad)。标准框和须情节用于单分子成像数据显示5号数据的总结:至少,第一四分位数、中位数,第三四分位数和最大值。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数据值表示为:*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001和* * * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。低温电子显微镜和细化统计数据提供了扩展的数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba