阿斯加德古菌中的肌动蛋白细胞骨架和复杂细胞结构gydF4y2Ba

在发现古生菌作为细菌之外的一个独立谱系后不久，分子和系统发育研究表明，古生菌和真核生物之间存在深刻的共同进化后代gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．然而，直到最近才发现了第一个LokiarchaeotagydF4y2Ba^10gydF4y2Ba(现在LokiarchaeiagydF4y2Ba^11gydF4y2Ba)和在宏基因组分析中更广泛的Asgardarchaeota超门gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}证实了一种明显的关系，真核细胞可能直接出现于古菌。事实上，在大多数系统基因组学分析中，真核生物与Asgardarchaeota形成了直接的姐妹群，甚至出现在Asgardarchaeota内部gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

令人信服的是，所有asgardarchia的成员都携带着大量的基因，这些基因最初被认为是真核生物所独有的。gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．这些esp多与细胞复杂性较高的特征有关，如细胞骨架的形成、转运和膜的形成等。例如，观察到阿斯加德古菌基因组编码了一个完整的、功能性的泛素偶联ESCRT系统gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}暗示了复杂的胞内膜室的可能性gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．另一个值得注意的例子是基因编码真核细胞肌动蛋白的几个密切同源物。而在其他古生菌中也发现了类似f -肌动蛋白的组合gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}阿斯加德古菌也具有肌动蛋白相关蛋白(ARPs)，以及肌动蛋白结合蛋白。值得注意的是，Asgard profilins和凝胶蛋白被发现能够调节真核肌动蛋白的动力学gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}这表明存在一个复杂而动态的细胞骨架gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}．然而，古菌肌动蛋白的原位结构和功能尚不清楚。gydF4y2Ba

一项开创性研究gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba首次展示了阿斯加德古菌的富集培养。”gydF4y2BaCandidatusgydF4y2BaPrometheoarchaeum syntrophicum’，在与分子氢消耗生物的共生中缓慢生长到低细胞密度。为“gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum的细胞表现出长分枝突出，作者提出了真核发生的假设，其中原始的阿斯加德古菌与细菌内共生的前身密切相互作用，并最终内生化它gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}．这些观察结果与真核发生的逐步机制是一致的，该机制最初被提出为“由内而外”模型gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．到目前为止，Asgard esp的作用还不能在自然宿主中进行研究，因此很难进一步测试这些概念模型。虽然“gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '可转录ESPs，但其胞内结构特征尚不清楚。关于阿斯加德古菌中存在细胞骨架或内部分隔的基本问题仍然不清楚，细胞包膜的结构也不清楚。在这里，我们将实验上易于处理的阿斯加德古菌的富集与最先进的成像相结合，以揭示其大分子细节的细胞结构。gydF4y2Ba

考虑到lokiarchaeal生物和其他阿斯加德古菌可以在各种缺氧和海洋环境中找到gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}，我们从不同位置的浅水沉积物中筛选Asgard古菌16S rRNA基因的DNA，以选择合适且易于到达的采样点进行富集。来自斯洛文尼亚皮兰海岸附近一个定期从地中海接收水的小河口运河的沉积物被确定在13-16厘米深度层具有最高的相对丰度，在扩增子测序中显示高达4%的Asgard古菌16S rRNA基因(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

鉴定的样品被用来接种富集培养(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，使用不同组成和不同顶空条件的介质(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．使用lokiarchaea特异性引物进行定量PCR (qPCR)定期监测(扩展数据图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，在20°C条件下，在装有无菌过滤水的血清瓶中观察到生长，这些水来自原始来源，并添加了复杂的有机物(酪蛋白水解物、奶粉和氨基酸)。然而，在这种条件下进行两次转移后，无法再检测到生长，于是使用不同的培养基成分进行了第二轮筛选。利用已报道的培养基MK-D1的修饰来培养'gydF4y2BaCa。gydF4y2Bap . syntrophicum”gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba时，细胞生长恢复，丰度反复达到2-8%。然而，在这些条件下，并没有达到更高的浓缩。只有通过开发最小的培养基，主要是通过减少有机碳源对单一化合物的输入和增加抗生素浓度，lokiarchaeal相对丰度在几次转移后达到25%至80%之间。在含有酪蛋白水解物的最小化lokiarchaeal培养基(MLM)中获得了最高的富集(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，同时也观察到色氨酸、蛋白胨、奶粉、单氨基酸、葡萄糖或丙酮酸的生长(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对16S rRNA基因的扩增子测序分析显示，富集度最高的培养物(Loki-B35)由三个优势种和两个次要种组成:一个单一的Lokiarchaeon序列(79%)，一种硫酸盐还原细菌gydF4y2Ba脱磷孤菌属gydF4y2Ba属(10%)，一种加氢型甲烷菌gydF4y2BaMethanogeniumgydF4y2Ba天堂(6%)，以及一个gydF4y2BaHalodesulfovibriogydF4y2Ba它是gydF4y2BaMethanofastidiosalesgydF4y2Ba属(均在2%左右)(图;gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．值得注意的是,这两个gydF4y2BaHalodesulfovibriogydF4y2Ba而且gydF4y2BaMethanogeniumgydF4y2Ba同时也是‘gydF4y2BaCa。gydF4y2Bap . syntrophicum”gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba这源于地理上不同的深海环境。因此，似乎两种Lokiarchaea依赖于类似的代谢，包括肽发酵到HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和/或小有机酸。gydF4y2Ba

Loki-B35生长无迟滞期，最大细胞密度可达2.5 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每毫升细胞数，有时甚至是5 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba在50 - 60天内每毫升细胞(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)时，接种量为10%。然而，当接种物来自固定培养时，观察到90至120天的极长滞后期。估计生成时间为7 ~ 14天。与深海Lokiarchaeon相比gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '(最大细胞密度为10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每毫升细胞数，生成时间14-25天)gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba， Loki-B35生长得相当快，细胞密度也更高。gydF4y2Ba

将Loki-B35的基因组通过短、长读测序组装成一个contig。它包含6035313个碱基对(bp)，编码5119个预测蛋白，3个16S和23S核糖体rRNA副本(其中2个在操纵子中)和34个tRNAs(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在封闭基因组中只存在一个rRNA操纵子。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '和两个HeimdallarchaeagydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}但Lokiarchaeota基因组高质量组装中的两个操纵子gydF4y2BaCandidatusgydF4y2BaHarpocratesius repetitus ' FW102(参考文献。gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba)，甚至在Loki-B35中发现了3个核糖体RNA操纵子，这表明存在可变性，这可能是基于菌株的生成时间或适应不断变化的环境条件的灵活性gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

与’相比gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophicum’，Loki-B35的基因组明显更大(大约1.6 Mb)，这也反映在2256个独特的蛋白质上(图5)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．正交群的功能注释显示Loki-B35的基因几乎在所有类别中都有富集，反映了其整体更大的基因组大小(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．值得注意的是，代表esp的蛋白质比例与基因组大小大致相关，在'中为5.5%。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '(218个esp)和Loki-B35(258个esp;根据最新的asCOG数据库计算gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)(补充表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．相比之下gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum’，Loki-B35的基因组中与膜运输和蛋白质运输相关的基因特别丰富(图5)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Loki-B35与’16S rRNA基因序列相似性分析gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '为95.3%，常见的同源蛋白具有58.4%的氨基酸同源性，这证明了分为不同属的合理性gydF4y2Ba^{34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}．这种分离是由大量独特的蛋白质所支持的，这些蛋白质占全部预测蛋白集的47.7%。两种培育的Lokiarchaea之间的进化距离在基因同向性比较中也变得明显，这表明大量的重排基因和基因组特异性区域分布在整个基因组中(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在一个基于23个保守的核糖体蛋白质的普遍系统发育中，来自所有三个生命领域的291个代表性物种，所有阿斯加德古菌形成了一个单系群，真核生物是它们的直接姐妹谱系(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．阿斯加德的系统发育(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，基于168个基因组，清楚地区分了门的所有描述类，并与最近的其他系统基因组学分析一致gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}，尽管内部分支节点根据分析和数据集的差异而有所不同。Loki-B35和'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophicum '和其他三个lokiarchaeal宏基因组组装基因组(MAGs)形成了Lokiarchaeia类的两个主要亚系之一(图2)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．在这些分析的基础上，我们提出了一个新的属和种，我们提出了名字:gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '菌株Loki-B35(词源见下文)。gydF4y2Ba

我们的下一个目标是识别个体gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum细胞，并利用显微镜对其进行表征。特异探针的荧光原位杂交(FISH)显示'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum的细胞呈现为不同大小的球体(0.3-1.0µm)，在富集过程中比其他生物小得多(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．FISH分析的细胞计数(图中未显示)证实，扩增子测序显示，在我们的最高富集度中，相对丰度可达近80%。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们将活培养的冷冻细胞插入电子显微镜(EM)网格上，使用冷冻电子断层扫描(cryo-ET)对它们进行近乎原生状态的成像。一个主要的挑战是低细胞密度和高易损性。gydF4y2BaCa。gydF4y2Ba这种细胞不允许我们进行任何加工步骤。因此，我们没有集中样本，而是通过记录二维(2D)概述图像对网格进行了广泛的筛选，然后对所选细胞进行冷冻et数据收集。这种方法揭示了三种具有不同形态和细胞包膜结构的一般细胞类型(图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．一类由圆形的细胞体组成，与复杂的异质突起有关。另外两种细胞类型分别为棒状细胞和球形细胞，没有突出物。他们的细胞包膜具有典型的革兰氏阴性和古菌细胞包膜特征，因此可能代表共培养的细菌和古菌(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．相比之下，细胞包膜gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum的候选者具有从单一膜突出的复杂无序密度。gydF4y2Ba

明确地识别"gydF4y2BaCa。gydF4y2Ba在L. ossiferum细胞中，我们最初试图将FISH与冷冻et相关联。然而，FISH涉及苛刻的样品制备步骤(化学固定、脱水、渗透和高温)，这并不允许保存脆弱的细胞超微结构。因此，我们转向了另一种方法，并假设'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum的细胞可以通过其核糖体的独特结构特征来识别。在阿斯加德古菌rrna中已经报道了超大型真核样扩增片段(ES9和ES39)，但在细菌和其他古菌中没有gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．因此，我们从56个核糖体层析成像中计算出4126个核糖体亚层析成像体积。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum的候选细胞体和突起并取平均值(图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．通过将大亚基rRNA位置与结构对接结果相关联，将euryarchaeotal 70S核糖体的平均和高分辨率结构进行比较，发现了额外的突出密度，我们将其确定为asgard特异性扩展片段ES9和ES39。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．重要的是，在共培养物种的大亚基rRNA序列中不存在扩展段(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这种细胞类型表现出特征可变的形态，具有长突起的细胞体和具有复杂表面蛋白质组的单膜，因此被确定为'gydF4y2BaCa。gydF4y2Bal . ossiferum”。这些细胞通常作为个体出现在FISH分析中(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)和电子显微镜成像(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．然而，有时候，”gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '被发现与共培养的物种聚集在一起(扩展数据图。gydF4y2Ba7 b, cgydF4y2Ba)．由于这些观察结果相当罕见，我们假设，尽管与共培养的物种之间的养分交换可能是菌株生长所必需的，但持久的细胞-细胞接触似乎并不是在其整个生命周期中所必需的。gydF4y2Ba

已经确定了身份和总体外观gydF4y2BaCa。gydF4y2Ba我们的下一步目标是通过扫描EM分析其整体组织。我们发现了具有表面结合的囊泡和广泛突出的小球虫细胞(图2)。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)．相比之下gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum’，这些长突起显得更加不规则，经常分支或扩张成球状结构。gydF4y2Ba

研究'的大分子结构gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum的细胞，我们扩展了冷冻et分析。与使用扫描电子显微镜(SEM)获得的数据相比，未固定细胞的膜性突起显示出更复杂的形状(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)．一些突起连接了多个较大的细胞体(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba(插图))，让人想起在其他古生菌中观察到的细胞桥gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}．虽然大多数细胞超过了冷冻et的厚度限制，但有些细胞足够薄，可以看到内部结构(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)，使我们不仅可以观察到核糖体等大型蛋白质结构，而且还可以观察到许多细长的、有时弯曲的细丝(卷积神经网络辅助分割如图所示)。gydF4y2Ba4 d, fgydF4y2Ba；补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在一些非常薄(<100 nm)的突出物中，这种纤维网络甚至可以更好地分解(图2)。gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，其中有时包含连接细胞不同部分的捆扎细丝。核糖体均匀分布于整个细胞体、细胞桥和突起(图。gydF4y2Ba四氟gydF4y2Ba)，有时可以观察到它们是膜相关的链(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．除了两个实例(扩展数据图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)，我们没有观察到内部膜结合室。gydF4y2Ba

我们扩展的冷冻et数据集还揭示了对细胞包膜结构的进一步了解。单膜不仅装饰着一层小的无序密度，而且还有大量的结构进一步从膜突出(图。gydF4y2Ba4个氯gydF4y2Ba(蓝色箭头))。一些密度连接了凸起网络的不同部分(图2)。gydF4y2Ba4 d, fgydF4y2Ba)，而另一些则形成了精细的组合，定位于高膜曲率的区域(图。gydF4y2Ba4 f、hgydF4y2Ba)．在细胞膜的细胞质一侧，我们很少(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)观察到的假定化学感受器阵列(图;gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)．与这一观察结果一致的是，'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '编码一组趋化蛋白。虽然不在。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '，其中许多也存在于其他Lokiarchaeia和Heimdallarchaeia中(在97个MAGs中有27个;扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．该基因集还包括15个接受甲基的趋化蛋白gydF4y2Ba农谢先生/ B / C / D / R / W / YgydF4y2Ba(补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．与大量的表面蛋白一起，它们可能介导细胞间的通讯、相互作用和运动。gydF4y2Ba

独特的细胞包膜在细胞体和突起之间大部分是连续的，即使过渡区表现出高度的变异性。一些表现为稳定的连接(图。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba)(势密度似乎稳定了“颈部”)，而其他的则形成了非常薄的收缩(图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)或只是松散地附着(图。gydF4y2Ba4 k, lgydF4y2Ba)．值得注意的是，单个细胞骨架丝经常穿过连接进入突起(图。gydF4y2Ba4 lgydF4y2Ba)．以类似的方式，纤维也连接着突出网络的不同部分，通常横跨狭窄的膜管(图2)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．这些观察表明，细胞骨架的功能是作为一个支架，以维持复杂的细胞结构。gydF4y2BaCa。gydF4y2Bal . ossiferum”。gydF4y2Ba

为了解决在低温断层摄影中最常观察到的细胞骨架纤维的身份(图。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，我们着手原位确定其结构，并开发了一个使用2d投影亚层析图螺旋重建的工作流程，然后进行亚层析图平均(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．二维分类显示双股纤维结构(图;gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．最终的分辨率为24.5 Å的重建使我们能够确定螺旋参数(每个亚基上升27.9 Å，每个亚基扭曲−167.7 Å)，这与真核生物F-actin高度相似，也与古细菌Crenactin高度相似gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．重要的是，f -肌动蛋白的尺寸gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba和CrenactingydF4y2Ba^23gydF4y2Ba与我们的重建图相一致(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

“gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum的基因组包含四种真核肌动蛋白同源物。这些同源物中的一个聚集在一组lokiactiins中，lokiactiins与真正的真核肌动蛋白和系统发育中的大多数arp形成姐妹群(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．其余三个同源物与来自真核生物和阿斯加德古菌的其他ARPs聚集在一起。它们的系统发育模式和分布表明了阿斯加德古菌内部的复杂进化，这似乎是由基因丢失、获得和复制所形成的。相比之下，Lokiactin代表了最保守的肌动蛋白同系物群。它存在于所有的阿斯加德血统中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba，表明它存在于整个门的最后一个共同祖先(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

检测细胞中的肌动蛋白样细胞骨架丝gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum’中含有Lokiactin，我们首先用qPCR与逆转录(RT-qPCR)检测了所有actin同源物的表达水平，发现Lokiactin的表达高出数倍(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．接下来我们生成了两种针对lokiactin特异性肽的抗体。使用这些抗体，通过western blotting检测lokiarchaeal细胞裂解液中的表达。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)，我们观察到整个过程中都有染色。gydF4y2BaCa。gydF4y2Ba免疫金标记实验中的L. ossiferum细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．在免疫荧光实验中，两种抗体都在细胞体中显示出丝状信号，特别是在突起中，这与冷冻断层摄影中观察到的大量丝状分布一致(图2)gydF4y2Ba5克,gydF4y2Ba)．因此，我们得出结论:gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '具有复杂的lokiactin基细胞骨架。为“gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '编码八种凝胶蛋白样蛋白和三种profilin样蛋白，这些蛋白已被证明影响肌动蛋白聚合动力学gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}，我们假设Lokiactin细胞骨架复合物的组装gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '可能受到肌动蛋白结合蛋白的动态调控。gydF4y2Ba

总之，我们相对快速生长的lokiarchaeal培养使我们能够在接近原生状态下研究其细胞结构。我们在阿斯加德古菌中发现了一个复杂的基于肌动蛋白的细胞骨架，这是长期以来的假设gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}，但尚未被可视化。gydF4y2Ba

细胞骨架可能是所有阿斯加德古菌的标志结构，因为Lokiactin在所有阿斯加德古菌类的基因组中都是保守的。这清楚地将Lokiactin与许多其他esp区分开来，这些esp显示出基因获得和损失的复杂进化历史，横向转移导致Asgard和其他古生菌的斑块分布gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．Lokiactin的高度守恒表明其功能受到强烈的约束。因此，由众多肌动蛋白相关蛋白和肌动蛋白结合蛋白调节的动态细胞骨架可能对阿斯加德古菌的出现、进化和多样化产生了重大影响。我们的冷冻et和免疫荧光数据显示在细胞的两个部分都有肌动蛋白丝。在细胞体中，丝状体通常分布在细胞的外围，在细胞的突起中，丝状体沿着纵轴排列。因此，我们提出Lokiactin作为Asgard古菌复杂细胞结构的支架，类似于真核细胞actin，这是真核细胞形状的主要决定因素gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

具有广泛膜性突出的精细细胞结构对阿斯加德的生理学和生态学具有多重意义。由于这些特征使细胞非常脆弱，这也可以解释为什么在沉积物中发现了最高丰度的阿斯加德古菌gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}而不是浮游生物。重要的是，我们的研究建立了能够在环境样本中以不依赖培养的方式对阿斯加德古菌成像的方法，并有可能根据独特的核糖体RNA扩增段在冷冻断层扫描图中识别阿斯加德细胞。gydF4y2Ba

复杂突起网络的大表面积，加上不寻常的细胞包膜缺乏高度秩序化的s层(在其他古生菌中常见)，但却显示大量的表面蛋白质，可能使真核生成所需的复杂细胞-细胞接触成为可能——考虑到培养的两种阿斯加德菌株的生活方式——可能涉及合成关系中的种间依赖关系gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba}．这些发现有力地支持了先前在inside-out假说和E3假说中提出的通过突出介导的细胞-细胞相互作用获得线粒体的渐进路径gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}．更多的实验数据——特别是来自不同阿斯加德古生菌的实验数据——将需要进一步测试这些模型，并排除其他观点gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}．重要的是，即使在没有内部细胞器样膜系统的情况下，细胞结构也可能使细胞过程分区化，这是基于第一个阿斯加德古菌基因组的假设gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

最后，我们的富集培养将作为一个模型系统来研究阿斯加德古菌的特殊细胞生物学，因为它生长到细胞密度和纯度，使其在实验上易于处理。错综复杂的细胞结构gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum’表明了大分子运输和组装、膜成形、细胞分裂和细胞骨架时空调节等过程的复杂机制，其中许多可能是由ESPs介导的，现在可以在原位研究。gydF4y2Ba

词源。gydF4y2BaLokiarchaeumgydF4y2Ba(Lo.ki.ar.chae 'um。N.L.中子弹。n。gydF4y2BaarchaeumgydF4y2Ba(源自Gr. masc.)adj。gydF4y2BaarchaiosgydF4y2Ba，古代)，古生菌;N.L.中子弹。n。gydF4y2BaLokiarchaeumgydF4y2Ba一种以挪威神话中的神洛基(Loki)命名的太古菌)。gydF4y2BaossiferumgydF4y2Ba(os.si 'fe.rum。l .中性粒细胞。pl. n。gydF4y2Ba骨gydF4y2Ba骨架;l . v。gydF4y2BaferogydF4y2Ba，携带;N.L.中子弹。adj。gydF4y2BaossiferumgydF4y2Baskeleton-carrying)。这个名字描述了一种携带骨骼的太古菌，属于临时类LokiarchaeiagydF4y2Ba^11gydF4y2Ba属于阿斯加达门。gydF4y2Ba

位置。gydF4y2Ba从斯洛文尼亚皮兰河口运河的浅层沉积物中分离出来。gydF4y2Ba

诊断gydF4y2Ba阿斯加达门的厌氧太古菌，与HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-消耗细菌和古生菌在20°C的有机介质。最大细胞密度达到5 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每毫升细胞相对富集高达79%。细胞生长广泛，通常带有泡的分枝突出，并表现出复杂的不规则表面结构。基因组比最近亲属的基因组大1,607,517 bp。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum’，氨基酸水平相似度为58.4%。gydF4y2Ba

样品采集与富集培养gydF4y2Ba

沉积物岩心样本(长度约60厘米)于2019年4月21日从斯洛文尼亚皮兰海岸(45°29′46.1”N 13°36′10.0”E)附近的浅咸淡运河(水深40厘米，19.5°C, pH值8)中提取。gydF4y2Ba

在厌氧帐篷(NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba每个馏分置于50ml锥形无菌离心管中，密封并在4℃下保存。从不同组分中提取约0.5 g沉积物用于DNA提取和随后针对lokiarchaeal 16S rRNA基因的qPCR分析(qPCR条件如下)。在13-16厘米深的沉积物层中，每毫升Lokiarchaea的16S rRNA基因拷贝相对于总DNA含量最高(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)用于进一步培养，在120 ml血清瓶中进行，用丁基橡胶塞子密封。以2 g沉积物作为接种物，测试不同的培养基和顶空条件;采用上述qPCR方法监测生长。140天后，在50 ml无菌过滤的半咸水中接种，其中含有酪蛋白水解物(0.1% (w/v))， 20种氨基酸(每种0.1 mM)和奶粉(0.1%)，在80:20 N的气氛下在20℃下培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba:有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(0.3条)。为了限制细菌生长，培养物中还添加了氨苄西林、卡那霉素和链霉素(50µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每个)。当检测到指数生长时(1-3个月之间)，将培养物转移到新鲜培养基中。在两次转移后，在这种设置下无法再观察到生长，下一次转移是在修改后的环境中进行的。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum ' MK-D1培养基gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．在这种条件下进行三次转移后，将培养基还原以进一步限制细菌生长，在最低培养基中进行五次转移后，达到了高浓缩。最终，培养基组成(每升)为:20.7 g NaCl, 5 g MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·6gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 2.7克NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 1.36 g CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·2gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.54 g NHgydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}Cl, 0.14 g KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}， 0.03 g NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaS·9 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.03 g半胱氨酸·HCl, 0.5 ml酸性微量元素溶液，0.5 ml碱性微量元素溶液，1 ml Se/W溶液，0.1%酪蛋白水解物(W /v)。含酸性微量元素溶液(每升):1.491克FeClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·4gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.062 g HgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， ZnCl 0.068 ggydF4y2Ba_{2，gydF4y2Ba}0.017 g CuClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba·HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.099 g MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·4gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.119 g CoClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·6gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.024 g NiClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·6gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和4.106 ml HCl(37%)。含碱性微量元素溶液(每升):0.017 g NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba搜索引擎优化gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 0.033 g NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba我们gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}， 0.021 g NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaMoOgydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}NaOH 0.4 g。培养基pH调至7.5，含氨苄西林、卡那霉素和链霉素(200µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每个)。顶空大气为80:20 NgydF4y2Ba_{2：gydF4y2Ba}有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(0.3 bar)， 20℃恒温培养，不摇晃。gydF4y2Ba

DNA提取和qPCR生长监测gydF4y2Ba

每14天采样2毫升培养物，在20000度下离心30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C。丢弃上清液，将得到的颗粒重新悬浮在700µl的SL1缓冲液中，该缓冲液来自NucleoSpin土壤DNA提取试剂盒(machery - nagel)。其余的程序是按照制造商的说明进行的。用于基因组测序的高分子质量DNA使用标准的苯酚-氯仿为基础的协议提取。根据制造商的说明，使用dsDNA HS试剂盒，用Qubit 2.0荧光计(Invitrogen)测量DNA浓度。gydF4y2Ba

使用ARB工具设计lokiarchaea特异性16S rRNA基因引物(LkF, 5 ' -ATCGATAGGGGCCGTGAGAG和LkR, 5 ' -CCCGACCACTTGAAGAGCTG)gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．所有检测均在CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad)上进行，并使用CFX Maestro (v.2.3)收集数据。反应混合物(20µl)包含:1× Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs)，每个引物0.5µM和5-10 ng模板DNA。循环条件为:95°C 1 min;然后在95°C下15秒，在60°C下1分钟，循环40次(退火和伸展)，每个循环后都有荧光读数。通过将温度从60°C增加到95°C，以0.5°C为增量持续5秒，生成熔化曲线，每次增量后都有荧光读数。以沉积物DNA扩增的Lokiarchaeal 16S rRNA基因片段为定量标准。为定量，三倍的标准十倍稀释范围为10至10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba每次试验都使用副本。这些反应的效率从90%到100%不等gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>值为0.99。引物特异性通过环境DNA扩增子测序(Illumina MiSeq)得到证实。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

RNA提取，cDNA合成和ARP RT-qPCRgydF4y2Ba

从培养物中提取20毫升，在20000度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟，4°C。然后将颗粒重悬在600µl mirVana miRNA分离试剂盒(Invitrogen)的裂解/结合缓冲液中。其余的程序是按照制造商的说明进行的。用TURBO DNase (Invitrogen)在37°C下孵育1小时，去除可能残留的基因组DNA。然后使用Lokiarchaeal 16S rRNA PCR测试来确认样品中没有DNA残留。根据制造商的说明，使用ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒生产cDNA。gydF4y2Ba

针对Lokiactin的引物(GenBank:gydF4y2BaUYP47028.1gydF4y2Ba， 8f, 5 ' -gcaggagaagatcagcctcg;337R, 5 ' -AACCGGATGTTCGCTTGGAT)和肌动蛋白同源物(GenBank:gydF4y2BaUYP44126.1gydF4y2Ba；82 f, 5 ' -TGGGGGAGAAAATGAGCCAC;443R, 5 ' -GGCCCCACGAACAGGATAAT)， GenBankgydF4y2BaUYP44711.1gydF4y2Ba(361 f, 5 ' -CCCTCCCAGACATTGCACAA;731R, 5 ' -TGCGGGATCGACAGAATCAG)和GenBankgydF4y2BaUYP47647.1gydF4y2Ba(305 f, 5 ' -CAAGGCTGGATCCCTTCAGA;591R, 5 ' -ATTGCGTGATATGGTGGCCT)采用genous Prime 2021.2软件(gydF4y2Bahttps://www.geneious.comgydF4y2Ba)．利用培养DNA进行温度梯度PCR，确定最佳退火温度，所有引物对的退火温度均为60℃。qPCR程序和循环条件与lokiarchaeal 16S rRNA基因扩增相同。以培养DNA扩增片段为标准。这些反应的效率从90%到100%不等gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>值为0.99。通过熔融曲线分析评价引物特异性。gydF4y2Ba

16S rRNA基因扩增子测序gydF4y2Ba

扩增子测序使用一般原核16S rRNA基因靶向引物对515f (5 ' -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806r (5 ' -GGACTACHVGGGTWTCTAAT)对提取的DNA进行扩增。gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba然后在维也纳生物中心核心设施(VBCF)使用Illumina Miseq (300 PE)平台对其进行条形码和测序。使用cutadapt处理原始读取gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba去除引物序列，然后使用QIIME2管道进行序列分析gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．简而言之，DADA2算法用于去噪数据以及去除低质量的读取和嵌合体。序列同一性100%的序列被聚为扩增子序列变体。扩增子序列变体的分类使用SILVA数据库(发行版138)和q2-feature-classifier插件进行分配gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

原位dna杂交链式反应gydF4y2Ba

细胞在添加2.5%甲醛的培养基中室温固定2 h。在此期间之后，它们在1×磷酸盐缓冲盐水中洗涤三次，然后在- 20°C的无水乙醇和1×磷酸盐缓冲盐水(1:1)的混合物中存储。本研究中使用的寡核苷酸探针是通用的细菌靶向EUB338(参考文献)。gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba)， Methanomicrobiales-targeting MG1200(参考文献。gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba)和lokiarchaea特异性DSAG-Gr2-1142(参考文献。gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba)(补充表格gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．dna杂交链式反应过程如前所述gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba使用Gryphax (v.1.1.8.153)在Eclipse Ni-U荧光显微镜(尼康)上对样品进行成像。图像处理使用ImageJgydF4y2Ba^62gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Illumina公司测序gydF4y2Ba

对于短读测序，我们使用Novogene的NovaSeq 6000(配对端，150 bp)平台对富集中不同时间点的三个样本的宏基因组DNA进行了鸟枪测序。使用Trimmomatic (v.0.36)处理测序数据gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba删除Illumina适配器和低质量读取(滑动窗口:5:20)。使用SPAdes (v.3.15.2)共同组装修剪后的读取gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba与gydF4y2BakgydF4y2Ba-mer长度从21到111不等，以及'——meta '选项。使用Binsanity将长度超过1,000 bp的Contigs清除gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba， MaxBin2 (ref.)gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba), MetaBATgydF4y2Ba^67gydF4y2Ba和编造gydF4y2Ba^68gydF4y2Ba然后使用DAS工具进行重复数据删除和分区优化gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba．使用CheckM评估mag的完整性和污染程度gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba采用GTDB-Tk (v.1.5.0;classify_wf)gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba．lokiarchaeal MAG(基因组长度，6,008,683 bp;完整性、90.9%;污染，7.9%)。gydF4y2Ba

纳米孔测序和碱基调用gydF4y2Ba

使用SQK-LSK109连接试剂盒进行ONT测序的文库构建，然后使用FLO-PRO002流细胞进行PromethION测序。Fast5文件使用高精度的ONT基调用器Bonito (v.0.3.6;gydF4y2Bahttps://github.com/nanoporetech/bonitogydF4y2Ba)使用dna_r9.4.1预训练模型(bonito basecaller——fastq dna_r9.4.1)。使用porrechop (v.0.2.4)执行长读解复用和适配器移除gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba．使用NanoFilt (v.2.8.0;纳滤-l 1000)gydF4y2Ba^72gydF4y2Ba．我们使用Flye (v.2.8.3-b1695)执行了长读取的初始宏基因组组装gydF4y2Ba^73gydF4y2Ba使用'——meta '选项。基于GTDB-Tk (v.1.5.0)分类工作流(classify_wf)对contigs进行分类分配gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba，我们在一个非环状contig中鉴定了一个总长6035157 bp的Lokiarchaeal基因组。为了获得完整的Lokiarchaeal基因组，应用了以下方法。长读映射到短读组装的MAG和长读组装的非圆形contig使用minimap2(参考。gydF4y2Ba^74gydF4y2Ba)使用' -ax map-ont '选项。映射读取使用samtools转换为BAM格式gydF4y2Ba^75gydF4y2Ba床具bamtofastqgydF4y2Ba^76gydF4y2Ba用于获取FASTQ格式的读取。使用SeqKit去除重复序列gydF4y2Ba^77gydF4y2Ba工具。在长读重复数据删除之后，使用flye(——nano-raw)组装剩余的读gydF4y2Ba^78gydF4y2Ba产生一个环状的基因组。使用四轮Pilon对Loki-B35基因组进行了抛光和验证gydF4y2Ba^79gydF4y2Ba作为之前提出的宏基因组组装验证管道的一部分gydF4y2Ba^80gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Phylogenomic树gydF4y2Ba

我们从NCBI和其他公共数据库中总共恢复了167个高质量的阿斯加德古菌基因组(完整性超过80%，污染小于10%)(补充表)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．为了重建生命的系统基因组树，我们总共收集了23个核糖体蛋白标记(补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)来自广泛的细菌、非阿斯加德古菌和真核生物(补充表gydF4y2Ba8gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在我们的Asgard基因组数据库中，23个核糖体标记的识别和检索是基于Prokka (v.1.14.6)进行的蛋白质组注释。gydF4y2Ba^81gydF4y2Ba．本研究重建了两棵系统基因组树:(1)带有来自细菌、真核生物、非阿斯加德古菌和94个阿斯加德基因组子集的核糖体标记的生命树(补充表)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）;(2)第二棵树仅使用我们数据库中存在的Thermoproteota和168个Asgardarchaeota基因组的序列。使用MAFFT的L-INSi算法对核糖体标记物进行比对(v.7.427)gydF4y2Ba^82gydF4y2Ba并使用默认参数使用BMGE进行修剪gydF4y2Ba^83gydF4y2Ba．两组核糖体标记分别进行了独立连接，得到了生命树和Thermoproteota + Asgardarchaeota数据集的2327和3285个氨基酸位点的两个多序列比对。用IQ-TREE 2进行系统基因组重建(参考文献)。gydF4y2Ba^84gydF4y2Ba)在LG + C20 + F + G模型下，使用UFBoot2(参考文献)进行1000次超快引导重复。gydF4y2Ba^85gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基因组分析和建立之间的正交群gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum ' and 'gydF4y2BaCa。gydF4y2Bap . syntrophicum”gydF4y2Ba

蛋白序列gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum ' and 'gydF4y2BaCa。gydF4y2Ba用Prokka (v.1.14.6)对P. syntrophum进行预测gydF4y2Ba^81gydF4y2Ba．使用HMM搜索对Pfam数据库进行注释(v.34.0)gydF4y2Ba^86gydF4y2BaKEGG Orthology使用BlastKOALA在线服务器进行分配gydF4y2Ba^87gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

蛋白质组gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum ' and 'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophum '被用作BLASTp搜索中的查询(gydF4y2BaegydF4y2Ba= 1 × 10gydF4y2Ba^{−10gydF4y2Ba})对比最近发表的Asgard同源基因簇集合gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba获取asCOG编号和注释。根据以下标准选择最佳匹配:如果BLAST对齐覆盖了查询的70%以上，序列标识大于25%，则分配最佳命中的asCOG注释;当最佳BLAST命中不满足70%阈值时，使用30%的较低查询覆盖率和至少25%的序列标识来注释蛋白质结构域。Asgard COG注释用于在前面描述的由505个ascog组成的精选ESP集的基础上识别ESPgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．'之间的平均氨基酸同源性gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum ' and 'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaP. syntrophicum '使用CompareM (v.0.1.2)计算(带有' aai_wf '参数)(gydF4y2Bahttps://github.com/dparks1134/CompareMgydF4y2Ba)．使用ISEScan识别插入序列元素gydF4y2Ba^88gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

使用OrthoMCL鉴定了这两个蛋白质组之间的同源蛋白簇(v.1.4)。gydF4y2Ba^89gydF4y2Ba根据司马岛管道gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba基于使用BLASTp搜索执行的所有与所有蛋白质比对。Synima也被用于识别基因链的同位基因。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum ' and 'gydF4y2BaCa。gydF4y2Ba基于DAGchainer软件的P. syntrophum 'gydF4y2Ba^91gydF4y2Ba．利用riddegraph构建了基因组同步性图gydF4y2Ba^92gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

肌动蛋白家族蛋白质的系统发育gydF4y2Ba

在lokiactiins BLASTp搜索的基础上鉴定了Asgardarchaeota基因组的actin样蛋白gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba作为对我们策划的阿斯加德基因组集(gydF4y2BaegydF4y2Ba= 1 × 10gydF4y2Ba^{−10gydF4y2Ba}，序列恒等式≥25%)。为了检索真核肌动蛋白序列列表，我们根据登录号IPR004000从UniProt下载了蛋白质，这对应于肌动蛋白家族中存在的肌动蛋白结构域。蛋白质用CD-HIT聚类gydF4y2Ba^93gydF4y2Ba(-c 0.99 -d 0 -g 1)删除高度相似的序列。lokiactiins被用作BLASTp查询，只有标识超过25%的序列被保留。真核细胞肌动蛋白和Asgard肌动蛋白样蛋白与细菌肌动蛋白同源物进行排列，这些同源物涉及细胞形状测定(MreB)、磁小体组织(MamK)和质粒分离(ParM)，基于使用MAFFT的DASH数据库中的同源物结构信息(v.7.490;——dash——localpair——originalseqonly)然后使用trimAl (-gappyout)进行修剪gydF4y2Ba^94gydF4y2Ba．系统发育树用IQ-TREE 2.0(参考文献)重建。gydF4y2Ba^82gydF4y2Ba)在ModelFinder选择的LG + R8型号下gydF4y2Ba^95gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

扫描电镜、常规透射电镜和免疫金定位gydF4y2Ba

对于SEM，富集培养'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '的制备方法如上所述gydF4y2Ba^96gydF4y2Ba．扫描电镜使用蔡司Auriga场发射扫描电子显微镜(Zeiss)，操作电压为2 kV。gydF4y2Ba

对于用于透射电镜(TEM)或免疫金定位的常规树脂包埋样品，分别使用徕卡HPM 100和AFS2系统进行高压冷冻和冷冻替换(徕卡)。冷冻替代培养基由含0.5%戊二醛的乙醇、0.5%甲醛和0.5%乙酸铀酰组成。冷冻替代程序，随后的Epon环氧树脂包埋和lokiactin特异性一抗(ab1，见下文)免疫金定位使用之前描述的方案进行gydF4y2BaPhaeodactylum tricornutumgydF4y2Ba^97gydF4y2Ba．一抗和二抗特异性的免疫金对照使用gydF4y2Ba鳗弧菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba海床furiosusgydF4y2Ba．对对照组和对照组的免疫金颗粒统计进行了估计。gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '(补充表gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．透射电子显微镜使用Zeiss EM 912 (Zeiss)系统进行，工作电压为80 kV，配备Tröndle 2k × 2k慢扫描CCD相机(TRS, Tröndle Restlichtverstärker Systeme)或JEOL F200 (JEOL)，工作电压为200 kV，配备XAROSA 2000万像素CMOS相机(EMSIS)。gydF4y2Ba

lokiactin特异性抗体的产生和western blottinggydF4y2Ba

Lokiactin抗体是针对Lokiactin特异性肽(ab1: CTFYTDLRVDPSEHPV;ab2: CSKNGFAGEDQPRSVF)，并使用Eurogentec服务通过ELISA检测进行验证。肽抗体由Eurogentec公司设计。gydF4y2Ba

在western blotting中，一种培养基的样品被离心到20,000gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下10 min，在不含酪蛋白水解物的MLM碱性介质中洗涤1次，在含1% (v/v) β -巯基乙醇的sds负载缓冲液(Bio-Rad)中溶解变性，温度95℃。样品在4-20% Tris-Glycine梯度凝胶(Bio-Rad)上运行，转移到PVDF膜上，用5%的乳粉在TBST中阻塞，并用一级和二级抗体(山羊抗兔HRP, Invitrogen, 31460)检测。采用增强化学发光(ECL)检测信号。gydF4y2Ba

免疫荧光成像gydF4y2Ba

该文化的一个变种被固定在poly上gydF4y2BalgydF4y2Ba-赖氨酸涂层的覆盖物，在氮气气氛下用4%的甲醛固定。用3% (w/v) BSA和0.1% (v/v) Triton X-100阻断和渗透覆盖层，随后用一级抗体(抗lokiactin, 1:100或1:500稀释)和二级抗体(驴抗兔AF647, Invitrogen A-31573, 1:50稀释;或山羊抗兔abberior STAR 580, abberior ST580-1002, 1:200稀释)并用10µg ml反染色gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}Hoechst 33342(赛默飞世尔科学公司，用于airscan成像)或SPY505-DNA (Spirochrome，用于STED样品)。封面上安装了vectasshield (Vector Laboratories, Airyscan样品)或extended Diamond (Thermo Fisher Scientific, STED样品)。使用蔡司LSM900 Airyscan 2探测器和×63/1.4 NA油浸物镜对样品进行成像。gydF4y2BazgydF4y2Ba-使用检测Hoechst信号和透射光的共聚焦成像轨道和检测Alexa Fluor 647信号的单独Airyscan轨道记录目标细胞堆栈。使用Zeiss LSM Plus处理函数对共焦堆栈进行反卷积，在ZenBlue (v.3.5)中使用Zeiss联合反卷积(jDCV, 15次迭代)对airscan图像进行处理。透射光通道的最小强度投影和单共焦/空气扫描切片的提取在斐济进行gydF4y2Ba^98gydF4y2Ba．使用配备×100/1.4 NA油浸物镜的徕卡SP8 STED获取STED图像。DNA和Lokiactin信号在堆叠顺序成像轨迹中检测到。用Huygens Professional (v.22.04;科学体成像;gydF4y2Bahttp://svi.nlgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

低温et样品制备gydF4y2Ba

样品在氮气气氛下从培养中取出，并以1:5的比例与10 nm bsa涂层的金珠混合。样品被保存在氮气气氛中直到骤降冻结。然后，将3.5µl的样品应用于发光放电的铜EM网格(R2/1, Quantifoil)，从背面自动吸干(一侧使用聚四氟乙烯薄片)gydF4y2Ba^99gydF4y2Ba5-7秒，浸入液态乙烷/丙烷中gydF4y2Ba^{One hundred.gydF4y2Ba}使用Vitrobot Mark IV(赛默飞世尔科学公司)gydF4y2Ba^101gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

冷冻et数据收集gydF4y2Ba

冷冻et数据是在Titan Krios G4(赛默飞世尔科学公司)系统上收集的，该系统工作在300千伏，配备了生物连续成像滤波器和K3直接电子探测器(Gatan)。数据采集使用SerialEM进行gydF4y2Ba^{102gydF4y2Ba，gydF4y2Ba103gydF4y2Ba}．由于非浓缩样品的细胞密度低，网格首先使用低放大倍率多边形蒙太奇进行广泛筛选(×2,250)。在目标识别后，使用剂量对称倾斜方案获得倾斜序列gydF4y2Ba^104gydF4y2Ba，覆盖角度范围为−60°至+60°，总电子剂量为140-160 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．倾斜序列的像素尺寸为4.51 Å，在标本水平上使用倾斜与目标离焦之间的2°角增量获得- 8 μ m，或在更高放大倍率(像素尺寸为2.68 Å)下获得3°角增量和离焦范围为- 3至- 6 μ m(用于核糖体的亚层析成像平均和细胞骨架纤维的重建)。本文所示的2D投影图像在×2,250(像素尺寸为39.05 Å)的放大倍率下记录，目标离焦为−200µm。gydF4y2Ba

层析图重建、数据处理和分割gydF4y2Ba

倾斜系列使用IMOD中的校准帧进行漂移校正gydF4y2Ba^105gydF4y2Ba在IMOD中采用加权后投影重建4×-binned层析图。为了增强显像和颗粒选取的对比度，层析图采用ctf反卷积和isonet滤波gydF4y2Ba^106gydF4y2Ba．在IMOD中使用mtfilter对二维投影图像进行低通滤波。分割是在蜻蜓(对象研究系统，2022;gydF4y2Bawww.theobjects.com/dragonflygydF4y2Ba)，如上文所述gydF4y2Ba^107gydF4y2Ba．简而言之，通过直方图均衡化和非锐化滤波对等距过滤的层析图进行进一步处理，并在5- 6层析图切片上训练5类U-Net (2.5D输入5片)，以识别背景体素、细丝、膜、细胞表面结构和核糖体。所有神经网络辅助分割在Dragonfly中清理，导出为二进制tiff，并在IMOD中使用tif2mrc转换为mrc。分割在ChimeraX中可视化gydF4y2Ba^108gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

核糖体亚层析图平均gydF4y2Ba

核糖体亚层析图平均使用RELION (v.4.0)gydF4y2Ba^109gydF4y2Ba．单个核糖体颗粒使用Dynamo手动挑选gydF4y2Ba^110gydF4y2Ba从56张断层摄影以4倍折入重建。将粒子坐标和原始倾斜序列导入RELION (v.4.0)中，以4(4126个粒子)的分折因子生成伪亚层析图。在核糖体参考下对颗粒进行3D分类处理(电子显微镜数据库:gydF4y2Baemdb - 13448gydF4y2Ba)，低通过滤到60 Å。来自良好类别的粒子(扩展数据图中的I类和III类)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)进行装箱因子为2的三维自动细化和三维局部分类。在binning factor为1的情况下，使用3D类别最好(class II)的粒子进行三维重建，经过三次Tomo CTF细化和帧对齐后，进一步提高了分辨率。核糖体的最终结构分辨率为11.7 Å，由1673个粒子重建(扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

识别'gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '的rRNA扩增片段gydF4y2Ba

核糖体亚层析图平均与Euryarchaeota核糖体的高分辨率结构进行了比较(PDB:gydF4y2Ba6 skfgydF4y2Ba，gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba^111gydF4y2Ba)使用ChimeraX中的fitinmap来识别独特的rRNA特征。为了可视化，在ChimeraX中使用molmap将高分辨率结构低通滤波到11 Å分辨率。'的大亚基rRNA二级结构gydF4y2BaCa。gydF4y2BaL. ossiferum '和gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba是用R2DT预测的gydF4y2Ba^112gydF4y2Ba(可以在gydF4y2Bahttps://rnacentral.org/r2dtgydF4y2Ba)识别asgard特异性rRNA扩增片段的位置gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba和位置映射到结构对接结果，定义亚层析图平均中的ES9和ES39。gydF4y2Ba

细胞骨架丝原位重建gydF4y2Ba

细丝的分析采用了以前报告中描述的类似策略gydF4y2Ba^{113gydF4y2Ba，gydF4y2Ba114gydF4y2Ba}并在扩展数据图中汇总。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．简而言之，在Dynamo中使用filentwithtorsion模型以4倍的折入因子重建断层图，手动选取单个细丝。在段间距离为32.13 Å的情况下进行纤维分割，结果ctf校正和剂量加权层析成像在分瓣因子为2时共获得10,031段。这些分段的子体积被用于细丝分析(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba(1)每个子卷先旋转，使螺旋轴平行于gydF4y2BazgydF4y2Ba轴基于方向计算从粒子坐标(或从发电机)，然后进一步中心对齐与无特征圆柱样参考。(2)重新定向的子体进一步旋转90°，使粒子平行于gydF4y2BaxygydF4y2Ba飞机。(3)沿段的中心切片gydF4y2BazgydF4y2Ba轴的提取和投影，生成二维投影数据集。(4)对二维投影图像进行RELION螺旋重建分析gydF4y2Ba^115gydF4y2Ba参考肌动蛋白(gydF4y2Baemdb - 11976gydF4y2Ba) low-pass过滤到60 Å。(5)将二维投影图像的方向映射回相应的子体中，并根据相同灯丝上的片段的方向验证灯丝的极性，同时使用relion_refine对二维投影图像的3D模型进行对齐，在3D空间中细化片段的c中心。在重建过程中没有应用极性投票结果，因为分辨率不足以进行明确的极性确定。然后对定向细化后的片段进行第二次细丝分析，其中RELION分析中的参考数据从2D投影图像更新为3D模型。gydF4y2Ba

经过三次细丝分析迭代后，最后一次迭代进行不采样的二维分类，只选择二维分类中具有可见特征的粒子。然后对颗粒进行三维螺旋细化，优化工艺中的螺旋参数。总共使用了3161个来自子体的2D投影来确定一个分辨率为31 Å的重建地图，其中细化的螺旋参数为28.56 Å(上升/亚单位)和−168.50°(扭曲/亚单位)。为了进一步提高地图质量，我们接下来使用RELION (v.4.0)进行亚层析图平均gydF4y2Ba^109gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在Dynamo中手动从56张断层扫描图中选取单个细丝，并用段间距离32.13 Å进行分割。将13569个丝段的坐标和原始倾斜序列导入RELION (v.4.0)，以2的折边系数生成伪亚层析图。在不施加螺旋对称的情况下对颗粒进行三维自细化处理，然后应用于不进行角度采样的三维分类。选取三维分类良好的颗粒(I类和IV类)进行下一轮三维细化，细化过程中应用之前获得的二维投影模型中的螺旋参数并进行优化。分辨率为24.5 Å的最终结构是由12,585个粒子用改进的螺旋参数(上升= 27.9 Å，扭曲=−167.7°)重建的。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba