拇指大小的显微镜可以捕捉活动动物大脑深处的图像

当宗卫健(音译)盯着他自制的显微镜下令人眼花缭乱的绿色和蓝色脑细胞网格时，他觉得——有那么一刻——势不可挡。他说:“我觉得，如果我们能让(这台显微镜)工作，我们就能做任何我们想做的事情。”去年三月的那一刻，召开了一次临时实验室会议，并举行了一场庆祝活动。宗庆后是挪威特隆赫姆卡弗里系统神经科学研究所的一名光学工程师，在向同事们展示他的最新数据之前，他换上了白衬衫和领带。他说，从那一刻起，他的“玩具变成了工具”。

在这种情况下，玩具是一个拇指大小的双光子荧光显微镜。它可以照亮和记录活体组织的深度，这是传统荧光显微镜无法达到的。Mini2P的重量仅为2.4克，可以安装在老鼠的头上，在老鼠从平台上奔跑、攀爬和跳跃时，它可以跟踪数百甚至数千个神经元的活动¹．宗庆后和他的同事们在老鼠大脑的视觉、记忆和导航中心测试了这种设备，探测到半毫米以下的细胞。

通过一个定制的镜头，可以连续跟踪同一个细胞长达一小时，或在几周内多次，该仪器产生了更清晰的图像，可以捕捉到类似数量的细胞，如果不是更多的话，比头戴式单光子“迷你镜”，这是目前最先进的自由运动动物体内成像。瑞士苏黎世大学由物理学家转行的神经科学家Fritjof Helmchen表示，Mini2P的分辨率“几乎和台式双光子系统一样好”。它也是开源的部件列表和教学视频可在GitHub．12月，16名研究人员每人将支付约5500欧元(5370美元;在特隆赫姆的卡维里研究所举办的为期三天的研讨会上，他们建造了自己的双光子微型望远镜。

纽约西奈山伊坎医学院的神经科学家Denise Cai说，Mini2P项目——Zong因此获得了由挪威物理学会和Irma Salo j ' ger和第谷j ' ger基金会颁发的今年第谷j ' ger奖——“打开了通往科学探索领域的大门，这些领域以前很难，甚至不可能启动”。这一进展已经酝酿了数年。

荧光显微镜是基于一个简单的原理:当分子吸收能量时，它们会被电子激发;当分子“放松”时，它们就会释放光。大多数显微镜的设计使单个光子的光能足以引起这种反应。但这在较厚的组织中可能会出现问题:当光穿过细胞层时，它会被吸收和散射。双光子显微镜通过使用多个波长较长的光子来解决这个问题，这些光子可以穿透更深的组织(需要两个光子，因为单个波长较长的光子没有足够的能量激发分子)。但是双光子系统体积庞大，需要专门的光源和透镜。20多年来，研究人员一直致力于将这项技术缩小为一种足够轻、足够紧凑的仪器，以便用于行为自由的动物。

捕捉大脑电交响乐的新方法

Helmchen是早期的先驱。作为当时著名的贝尔实验室创新公司(Bell Labs Innovations，位于新泽西州默里山的一家研发公司)的博士后研究员，Helmchen和他的同事们制造了第一台便携式双光子显微镜。2001年，他们报告了他们的原理验证装置——一个超快脉冲激光器，用一根2米长的柔性缆绳连接到一个25克的显微镜，这个显微镜可以安装在一只老鼠的头上²．

该设计是第一个证明便携式双光子微型望远镜可以从单个神经元的分支突出(称为树突)记录钙信号(神经活动的视觉标记)的装置，但仅适用于麻醉、头部受限的大鼠。这个过程也极其繁琐。研究人员必须手动将钙敏感染料每次注入一个细胞，等待细胞亮起，然后将显微镜安装在老鼠的头上，在试图捕捉视频之前找到细胞。Helmchen说，在几个月的时间里，研究小组成功地成像了7个神经元，每次实验捕获一个细胞。

又过了8年，才有了一个头戴式双光子显微镜，可以在自由活动的动物体内成像钙信号。2009年，德国的研究人员建造了一个5.5克的便携式系统，一次可以追踪多达20个神经元。当老鼠沿着半圆形的轨道奔跑时，他们在老鼠的视觉皮层中捕捉到了神经元的图像，这些神经元中装载着钙的指示物^3.．但Helmchen说，由于系统的复杂性，这个设计并没有获得太多的吸引力。

一个光子成功

当时，宗庆后是北京大学工程专业大二学生，研究激光。但他真正想要的——他的“最终梦想”，他说——是“了解自然”。2012年，他开始跟随生物医学工程师程和平攻读博士学位。程在北京大学的实验室开发生物研究的荧光显微镜方法。

那时，单光子微缩镜越来越受欢迎。对于高度活跃的小鼠来说，这些设备足够轻便和坚固，可以一次成像数千个细胞，使研究人员能够解码整个神经回路，而不仅仅是一小部分细胞。他们还可以检测GCaMP6，这是一种超灵敏的钙传感器，是在最早的双光子原型问世后开发的。Helmchen说，单光子微缩镜已经被用于跟踪诸如空间记忆、歌声发声和睡眠等行为，“取得了巨大的成功”。

据加州山景城的生物技术公司Inscopix首席商务官马丁·费尔霍夫(Martin Verhoef)介绍，自2011年以来，该公司已向650多家实验室出售了约1500台单光子微型显微镜，报告使用该技术的工作的出版物“远远超过220份”。根据配置不同，这些设备的价格在5万到15万美元之间。

开源替代品包括来自加州大学洛杉矶分校(UCLA)的单光子微型摄像机，它在GitHub上附有文档、软件和汇编教程。如果批量购买这些部件，成本约为500美元，如果自己动手，则需要1200美元。从柏林的LabMaker和里斯本的Open Ephys Production Site等公司，可以以约2000美元的价格买到UCLA的完整组装迷你镜。

神经科学家Peyman Golshani在UCLA的实验室参与了该设备的开发，他说，自从该设备在大约十年前首次制造和分享以来，全球大约有500个实验室使用了UCLA的迷你显示器(现在是第四次迭代)。例如，研究人员已经用它来研究跨越时间的记忆编码神经元。

尽管单光子微缩镜功能强大，但通常不能成像深度超过几百微米的图像，而且产生的荧光失焦，会使图像模糊。卡弗里系统神经科学研究所所长爱德华·莫泽和梅-布里特·莫泽说，这在像海马体这样的大脑区域通常不是问题，因为那里只有一小部分细胞在活动，所以这些细胞足够稀疏，可以在浑浊的图像中识别出来。

然而，这个分辨率确实给莫泽实验室带来了一个问题。那里的研究人员研究网格细胞——一种专门存储位置、距离和方向信息的神经元。他们对这些细胞的发现为莫泽夫妇赢得了2014年诺贝尔生理学或医学奖。但是单光子显微镜“不足以”成像网格细胞，May-Britt Moser说。“你必须有两个光子的分辨率。”

微型示波器的合作

进入宗。2015年，他加入了一个由程领导的团队，该团队获得了一笔资金，用于建造一种设备，该设备结合了单光子微型摄像管的轻量级特性和大型台式双光子系统的亚细胞分辨率。

2017年，他们描述了一种快速、高分辨率的微型双光子显微镜，从被称为树突棘的微小神经细胞突起中记录下了一小时的神经活动⁴．该显微镜的分辨率几乎与大型台式双光子系统相当。

显微镜制造商把越来越大的生物样本放在聚光灯下

研究人员使用了一种定制的光子晶体纤维——类似于电信中使用的那种用快速、短脉冲光传输信息的光纤。这种纤维提供了920纳米的激光脉冲，这个波长可以激发GCaMP6。(早期的双光子微管设计传输800纳米的光，只限于灵敏度较低的钙传感器。)该团队增加了一个微型物镜，比早期设计的分辨率更高，并使用自定义扫描镜来提高成像速度。由此产生的装置可以将大脑活动成像到活跃小鼠的神经突触(神经元之间的连接)水平。

根据爱德华·莫泽的说法，这部迷你剧“已经是一场革命”。他说，这表明“你可以在移动的动物身上以高分辨率和高稳定性成像细胞”。“人们都惊呆了”——尤其是他自己。

爱德华·莫泽(Edvard Moser)于2017年10月在北京郊外的一个会议上第一次见到宗庆后。莫泽对双光子微型望远镜的潜力感到兴奋，他安排了一次参观程的实验室。宗被派去接他，然后开车送他过去。

在两个小时的旅途中，莫泽通过聊天了解了更多关于双光子微型摄像机的知识。他说:“分辨率非常高，显微镜的重量也不差。”但是由于视野很小(130 × 130微米)，微型显微镜只能成像几十个细胞，这对莫泽和他的同事来说太少了。“当你只有这么少的细胞时，你无法看到(神经放电)模式，”他说。相比之下，商用台式双光子显微镜的成像面积超过一平方毫米。

尽管如此，第一代设备还是比以前的双光子头戴式设计有了巨大的进步，莫泽说。它只是需要“一点额外的有用”。

六个月后，宗搬到挪威，加入了卡弗里研究所的莫泽夫妇，在那里他可以继续开发双光子微型显示器，并得到渴望使用它的生物学家的输入。莫泽实验室花了20多年的时间研究空间导航——动物在运动过程中跟踪位置和方向变化的能力。这种复杂的行为是由网格细胞网络控制的，当动物在开阔的空间航行时，网格细胞会有规律地放电。但要了解这些特殊神经元的活动是如何协调的，就需要对自由活动的动物进行仔细研究。

去年，宗庆后和他在中国的同事描述道⁵他们的迷你望远镜的第二个版本，具有扩大的视野和更大的工作距离，使研究人员可以扫描多个平面，并成像420 × 420 × 180微米的体积。这个第二代仪器足够坚固，可以连续数周记录同一大脑区域的神经元活动。

显微镜制造商

但这种增强是有代价的。显微镜更重，电缆更硬，这限制了老鼠的自由活动，May-Britt Moser说。此外，该设计还包括一个电动可调谐透镜，当研究人员上下移动它时，它会加热。这种加热引起了光学漂移，从而改变了光电池在视野中的位置。爱德华·莫泽说:“对于神经科学家来说，这是一场灾难，因为你无法长期监测同一细胞的活动。”

在特隆赫姆，宗庆后发现了另一种可调谐透镜，名为TLens，由挪威Skoppum的光学技术公司poLight生产。

宗庆后说，专为手机和智能手表相机设计的TLens似乎非常适合双光子微型摄像机。它体积小，速度快，而且多亏了一种完全不同的调节透镜光功率的机制，具有更好的热稳定性。它只需要进行两次调整。首先，宗庆后与位于中国福州的阳光科技公司合作，改变了TLens的光学涂层，使其与双光子激光波长兼容。其次，poLight的科学家们将四个经过改进的透镜叠加在一起，以扩大光学范围，并将其整合到新的迷你镜中¹．

TLens阵列允许Mini2P在多个平面上成像，基本上产生了一大块组织的图像。这使得研究人员可以记录的神经元数量增加到数千个——类似于单光子微透镜记录的数量。这是“一个重大进步”，Helmchen说。重要的是，这种微型透镜加上更灵活的电缆，可以让老鼠不受约束地移动——这是对体积更大的2021装置的一个重要改进。

以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所的神经科学家Yaniv Ziv说:“Mini2P的论文很好地展示了使用这种新版本显微镜的老鼠的行为与不携带显微镜的老鼠相似。”“在更自然的环境下进行的实验中，在老鼠更活跃的行为中，视野保持稳定，这一点也非常令人印象深刻和重要。”

NatureTech中心

Ziv是将在12月Kavli研究所的研讨会上构建自己的Mini2P的16名研究人员之一。他的实验室使用单光子微透镜来研究长期记忆是如何在海马体中编码的，但研究人员无法区分深层和表层的细胞。他说，Mini2P可能会成功，而单光子迷你摄像机则无法成功。另一名研讨会参与者、马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院(NIH)的神经科学家顾毅(Yi Gu)研究了大脑如何编码空间信息，他使用台式双光子显微镜记录细胞，同时固定头部的小鼠在虚拟线性轨道上导航。但这种实验装置不允许记录头向神经元等细胞，这些细胞能感知头部位置和运动的变化。Gu希望Mini2P能让她在真实环境中自由移动的老鼠身上进行这些实验。

复杂的构建

其他研究人员也在寻找更好的微型双光子显微镜。8月，在Kavli团队报告Mini2P的几个月后，由Golshani领导的一个独立团队从NIH的大脑研究通过推进创新神经技术(Brain)计划获得了400万美元的拨款，用于开发两个新的双光子迷你镜:一个具有800 × 800 μ m视野的小鼠镜——几乎是Mini2P的两倍大，可与工作台双光子装置相媲美;还有一种设备，可以让研究人员同时对老鼠和更大的动物的多个大脑层成像。宗伟表示，他和他的同事“肯定会继续开发”Mini2P，“让它更广泛、更快、更深入”。

可能更难实现的是社区吸收。Ziv说，对于开源工具的开发者来说，要使他们的系统既稳定又易于由非显微镜专家构建和修复，这是特别具有挑战性的，双光子显微镜尤其如此。这种方法需要激光器产生超快(百万分之一纳秒量级)的高功率光脉冲，成本高达20万美元。蔡说:“这个价格对许多研究小组来说是令人望而却步的。”双光子系统也比单光子系统复杂得多，因此构建和使用Mini2P需要相当多的专业技术。

但在特隆赫姆，Mini2P的开发仍在继续。三次迭代之后，“我们才刚刚开始”，Zong说。“每一项技术在发表时都已经过时了。”