亲爱的编辑,gydF4y2Ba

甲状腺激素释放激素受体(TRHR)是一种a类G蛋白偶联受体(GPCR)，是下丘脑-垂体-甲状腺轴的关键信号传感器gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．TRHR主要表达在垂体前叶，通过介导促甲状腺激素释放激素(pGlu-His-Pro-NH)的作用，调节促甲状腺激素和催乳素的合成和释放gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(皇室))。激活后，TRHR主要与GgydF4y2Baq / 11gydF4y2Ba蛋白质发挥其调节作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．在这里，我们报道了trh结合TRHR-G的高分辨率冷冻电子显微镜(cryo-EM)结构gydF4y2Ba问gydF4y2Ba信号复杂。结合细胞信号分析、三维变异性分析和分子动力学(MD)模拟，我们的结果揭示了配体识别和TRHR激活的分子基础。gydF4y2Ba

提高TRHR-G的表达，稳定TRHR-G的表达gydF4y2Ba问gydF4y2Ba复合物，我们结合了几种策略来组装复合物，包括一个工程构建的人类TRHR，其中BRIL融合到n端，c端截断Y348，广泛使用的主导阴性GαgydF4y2Ba问gydF4y2Ba嵌合体(GαgydF4y2Ba平方gydF4y2BaiN，以下简称GαgydF4y2Ba问gydF4y2Ba为简洁起见)和NanoBiT系留策略gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．TRHR-G的结构gydF4y2Ba问gydF4y2Ba通过单粒子冷冻电镜，该复合物的标称全局分辨率为2.7 Å，可以准确地模拟TRH、受体残基E13到N336，细胞内环3 (ICL3)和G的大多数残基gydF4y2Ba问gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；补充无花果。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaS3gydF4y2Ba和表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图1:配体识别和人TRHR激活。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

一个gydF4y2Batrh结合TRHR-G的冷冻电镜结构gydF4y2Ba问gydF4y2Ba复杂。TRH的密度如图所示。TRHR，石板蓝;GαgydF4y2Ba问gydF4y2Ba，粗壮的木头;Gβ，淡紫红色;Gγ，浅石板灰色;scFv16，红褐色。TRHR的解析n端以海绿色突出显示。gydF4y2BabgydF4y2BaTRHR扩展n端与ECL2的相互作用。gydF4y2BacgydF4y2Ban端截断(ΔN12和ΔN18)对trh诱导受体激活的影响。GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba采用NanoBiT法检测游离信号。gydF4y2BadgydF4y2BaTRH(橙色)与TRHR(石板蓝)的详细相互作用。氢键用绿色虚线表示。gydF4y2BaegydF4y2Batrh结合袋突变对trh诱导GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba通过NanoBiT分析显示解离信号。柱形表示计算TRH效力[pEC .]的差异gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]用于相对于野生型受体(WT)的代表性突变体。数据根据影响程度进行着色。gydF4y2BafgydF4y2Ba非保守S113的严密结构检查gydF4y2Ba3.40gydF4y2BaTRHR的“PIF”主题。更换S113gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba和我gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba与相邻残基R283gydF4y2Ba6.52gydF4y2Ba或F199gydF4y2Ba5.46gydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2BaS113的效果gydF4y2Ba3.40gydF4y2Batrh诱导的GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba分离信号。数据显示为均值±SEM，来自至少三个独立的技术重复实验。细胞表面表达和gydF4y2BaEgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba值归一化为WT TRHR。不确定，不重要。gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05;＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0。01;＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba经单因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett多重比较检验(multiple comparison test)与WT比较< 0.001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

与最近报道的两种trh结合TRHR-G结构进行了比较gydF4y2Ba问gydF4y2Ba复合物gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，我们的高分辨率重建提供了一个更准确的模板来描述TRHR的肽识别和激活。值得注意的是，我们的结构分解了受体的一个延伸的n端区域(残基13-21)，这在之前的两种结构中都没有观察到gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)．n端部分指向受体的细胞外环2 (ECL2)，并与保守β-发夹尖端的残基171-176广泛接触(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．TRHR的极端n端(残基1-12)在我们的低温em图中没有被解析，可能是由于其固有的灵活性。然而，截断n端12个残基(残基1-12;ΔN12)似乎损害了TRHR的激活(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba；补充表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．进一步删除与ECL2相连的n端残基(残基1-18;ΔN18)导致最大反应大幅减少50% (gydF4y2BaEgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)的TRH(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba；补充表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．然而，我们的MD模拟分析表明，ΔN12和ΔN18突变体都没有危及激动剂的结合，对TRH表现出相似的边际均方根偏差(RMSD)值~0.9 Å(补充图)。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)．这些结果表明TRHR的n端部分可能变构调控TRHR的激活。gydF4y2Ba

TRH在七跨膜(7TM)束中占据一个典型配体口袋，其c端Pro-NHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba位于受体核心，n端pGlu指向ECL3(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．与迄今为止解决的其他A类肽GPCR复合物相比，TRH与大多数A类肽激动剂一样深入7TM核心，除了神经紧张素和甘丙肽与配体口袋表面结合外gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)．然而，三肽TRH与7TM和ecl的胞外端形成的相互作用要少得多，显示出更小的界面(522 ÅgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)与其他肽激动剂的受体相比(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)．详细的相互作用分析表明，TRH与TRHR形成广泛的氢键或极性相互作用，涉及TM3/5/6/7和ECL2 (T102gydF4y2Ba3.29gydF4y2Ba, Y106gydF4y2Ba3.33gydF4y2Ba, Y181gydF4y2BaECL2gydF4y2Ba, R185gydF4y2Ba5.32gydF4y2Ba, Y192gydF4y2Ba5.39gydF4y2Ba, Y282gydF4y2Ba6.51gydF4y2Ba, N289gydF4y2Ba6.58gydF4y2Ba, R306gydF4y2Ba7.39gydF4y2Ba, Y310gydF4y2Ba7.43gydF4y2Ba，上标指的是巴列斯特罗斯-温斯坦编号gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba；补充表gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)．我们的细胞信号分析显示，大多数丙氨酸突变严重损害TRH活性(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba和表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．最引人注目的是一系列酪氨酸残基的突变(Y106gydF4y2Ba3.33gydF4y2Ba, Y181gydF4y2BaECL2gydF4y2Ba, Y192gydF4y2Ba5.39gydF4y2Ba, Y282gydF4y2Ba6.51gydF4y2Ba)消除了下游信号，突出了它们在TRH结合和受体激活中的重要作用(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS6b-dgydF4y2Ba和表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．此外，我们的功能试验也表明，W160残留gydF4y2Ba4.60gydF4y2Ba，这与他的强烈对抗gydF4y2Ba2gydF4y2BaTRH和酪氨酸贴片(Y106gydF4y2Ba3.33gydF4y2Ba, Y181gydF4y2BaECL2gydF4y2Ba和Y192gydF4y2Ba5.39gydF4y2Ba)，对TRH活性非常重要(图;gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS6cgydF4y2Ba和表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．与最近解决的结构相比gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，我们的结构定义了更精确的配体结合姿态和详细的相互作用(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba；补充表gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)．具体来说，由于分辨率有限，TRH的羧胺基团的密度在其他报道的图中没有观察到，并且在相应的结构中建模不同gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．我们的高质量低温电镜图足够清晰，可以在“向上”配置中对羧胺基团进行建模，为进一步的药物发现提供了更精确的模板(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS5agydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

解析的TRHR结构采用了a类肽GPCRs的经典活性态构象，与报道的胆囊收缩素a受体(CCK)高度相似gydF4y2Ba一个gydF4y2BaR)对于7TM bundle，其Cα RMSD值< 1 ÅgydF4y2Ba10gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2BaS7agydF4y2Ba)．与此同时，保守的“微开关”(Toggle switch, DRY, NPxxY, PIF motif)对A类GPCRs的激活至关重要，它们在TRHR和CCK之间表现出几乎相同的构象gydF4y2Ba一个gydF4y2BaR，提示TRHR存在保守激活机制gydF4y2Ba11gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2BaS7bgydF4y2Ba)．有趣的是，保守的IgydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba在P中gydF4y2Ba5.50gydF4y2Ba我gydF4y2Ba3.40gydF4y2BaFgydF4y2Ba6.44gydF4y2BaA类GPCRs基序被罕见的S113取代gydF4y2Ba3.40gydF4y2BaTRHR和TgydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba在CCKgydF4y2Ba一个gydF4y2BaR，分别为图;gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS7cgydF4y2Ba)．结构分析表明S113被取代gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba典型的IgydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba会与相邻残基R283产生空间位阻gydF4y2Ba6.52gydF4y2Ba或F199gydF4y2Ba5.46gydF4y2BaTRHR，这可能损害受体的激活(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．不出所料，更换S113gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba和我gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba显著降低trh诱导的受体激活，而S113gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba没有破坏局部残基构象的突变保留了与野生型受体相似的信号传导(图。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba；补充表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．对不同种TRHR的序列比对表明，其功能残基为SgydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba和一个gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba但我不是gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba高度保存在TRHR直系线中(补充图。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba)．与TRHR不同，T129的取代gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba和我gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba在CCKgydF4y2Ba一个gydF4y2BaR似乎增强了与V125的疏水相互作用gydF4y2Ba3.36gydF4y2Ba, L217gydF4y2Ba5.46gydF4y2Ba和F330gydF4y2Ba6.52gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2BaS7cgydF4y2Ba)．事实上，我们的细胞信号分析显示了T129的突变gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba和我gydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba在CCKgydF4y2Ba一个gydF4y2BaR明显增加了激动剂的效力(补充图。gydF4y2BaS7dgydF4y2Ba)．这些结果强调了A类GPCRs激活机制的共同性和多样性。gydF4y2Ba

的TRHR-GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba受体的TM2/3/5/6/7、ICL1/2、8号螺旋和G的α5-螺旋、β1、α n -螺旋、GβgydF4y2Ba问gydF4y2Ba，总界面面积1483 ÅgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2BaS9a bgydF4y2Ba)．报告的GPCR-G的结构比较gydF4y2Ba问gydF4y2Ba复合物显示GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba插入到由TMs和ICLs的细胞内末端形成的类似腔中，但旋转范围为15°(补充图。gydF4y2BaS9c-egydF4y2Ba)．为了深入了解TRHR与GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba，我们进一步利用最终粒子进行三维重建进行三维变异性分析。三维变异性分析显示TRHR-G的整体构象gydF4y2Ba问gydF4y2Ba复合物是稳定的，仅在受体的n端(~2.5 Å)， ECL2 (~3.0 Å)和螺旋8 (2.7 Å)中观察到轻微的运动，TRH激动剂(~0.8 Å)和耦合GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba(~1.2 Å)对于这两个组件(补充图。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，我们报道了trh结合的TRHR-G的高分辨率低温电镜结构gydF4y2Ba问gydF4y2Ba复合物，这为TRHR激活提供了分子上的见解。与最近两项相关研究进行了比较gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，我们的工作提供了额外的结构和功能细节。首先，我们的结构分解了TRHR的一个延伸的n端区域(残基13-21)，这可能通过变构调节受体的激活(图。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)．其次，我们的高分辨率结构定义了更精确的配体结合姿态和相互作用，为药物发现提供了精确的平台(图2)。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba；补充表gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)．第三，我们的结果揭示了非守恒SgydF4y2Ba3.40gydF4y2Ba或者一个gydF4y2Ba3.40gydF4y2BaPIF基序对TRHR的激活至关重要，并且在TRHR直方图中高度保留(图2)。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba；补充图。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba)．总的来说，这些发现，加上最近的研究gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，揭示TRH结合和TRHR活化的分子机制。gydF4y2Ba