简介gydF4y2Ba

宿主-微生物群的相互作用在激活先天免疫系统中起着重要作用。然而，尽管这种相互作用的失调导致了广泛的免疫介导性疾病gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，骨细胞-微生物群相互作用对骨骼和免疫细胞激活的影响尚不清楚。骨细胞寿命长，功能多，是嵌入骨基质中数量最多的骨细胞。它们是由骨表面的成骨细胞分化而来的终末分化细胞gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．在骨髓炎，据报道gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba定植于小鼠和人骨的骨细胞腔隙-管系统gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba，说明细菌可以直接与细菌感染骨内的骨细胞相互作用。然而，尚不清楚细菌病原体是否直接刺激体内的骨细胞，如果是，骨细胞上的什么类型的先天免疫受体被用于响应特定的细菌病原体相关分子模式(PAMPs)。此外，虽然已知骨细胞会产生多种细胞因子和信号分子，以响应外界刺激gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba在体内，骨细胞来源的炎症介质对骨稳态和免疫细胞调节的影响仍在很大程度上未得到证实。另一方面，前人对骨细胞选择性受体激活核因子-κB配体(RANKL)的研究gydF4y2BaTnfsf11gydF4y2Ba基因缺陷小鼠的研究表明，骨细胞的基本特征之一是在骨重塑过程中，通过直接向骨表面的破骨细胞前体提供RANKL来控制破骨细胞的发生gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．骨细胞衍生的RANKL对骨破坏的重要性也在小鼠牙周炎模型中被提出gydF4y2Ba11 gydF4y2Ba但口腔细菌诱导RANKL表达引起牙槽骨溶解的骨细胞受体及其下游信号通路尚未被确定。gydF4y2Ba

toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)是一类模式识别受体，参与宿主防御入侵细菌病原体的初始阶段gydF4y2Ba12gydF4y2Ba．髓系分化初级反应88 (MYD88)是除TLR3外的所有TLRs下游信号的必需的适配器蛋白。TLR-MYD88通路的激活向下游NF-kB和MAPK通路发出信号，导致促炎细胞因子的产生gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．先前的细胞培养研究表明，细菌PAMPs刺激TLR2和TLR4可诱导成骨细胞RANKL表达gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba．然而，在成骨细胞谱系细胞中，TLR-MYD88信号通路在体内调节破骨细胞形成和骨吸收的作用尚不明确。因此，骨细胞激活在骨感染中的病理后果从未在体内研究过。此外，TLR-MYD88通路调节骨细胞RANKL表达的分子机制尚不清楚。因此，揭示细菌激活骨细胞对骨骼的影响，识别细菌激活骨细胞导致RANKL表达的分子途径，对于治疗与骨感染相关的骨溶解具有重要意义，如牙周炎和骨髓炎，因为骨细胞是最丰富的主要产生RANKL的骨细胞gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．此外，发现骨细胞中调节RANKL表达的新分子可能导致新的治疗策略，以治疗骨质疏松和类风湿性关节炎中发生的破骨细胞生成增加导致的过度骨吸收。gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现，在pamps驱动的小鼠骨溶解模型中，MYD88的靶向缺失(主要在骨细胞中)可以完全防止骨破坏。值得注意的是，骨细胞中MYD88的选择性恢复足以在模型中引起骨溶解和炎症。在体外，当TLR2和TLR4激动剂刺激骨细胞时，骨细胞表达RANKL的能力明显高于其前体细胞成骨细胞。激活MYD88通路可通过激活cAMP响应元件结合蛋白(CREB)和转录信号转导和激活因子3 (STAT3)，增强这些转录因子的蛋白质稳定性，从而诱导骨细胞中RANKL的表达。E3泛素连接酶F-box和富亮氨酸重复序列蛋白19 (FBXL19)和PDZ和LIM结构域2 (PDLIM2)分别参与了CREB/CREB结合蛋白(CBP)和STAT3蛋白降解的机制。翻译，给药MYD88抑制剂可防止口腔感染小鼠的牙槽骨丢失gydF4y2BaPorphyromonas gingivalisgydF4y2Ba（gydF4y2BaPggydF4y2Ba)．这些结果表明骨细胞是骨中重要的细菌传感器，在骨感染中通过将MYD88信号整合到RANKL调控机制中直接调控骨溶解。因此，目前的研究揭示了MYD88通路在骨骼系统中的功能，并为开发治疗感染性骨溶解的新方法提供了遗传基础，该方法针对骨细胞中的MYD88和下游rankl调节分子。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

骨细胞和成熟成骨细胞中MYD88的靶向缺失可防止PAMPs诱导的颅骨骨溶解gydF4y2Ba

为了确定骨细胞和成熟成骨细胞中TLR2/4-MYD88信号的激活是否影响PAMPs引起的骨吸收，我们使用牙质基质蛋白1 (gydF4y2BaDmp1gydF4y2Ba）gydF4y2BacregydF4y2Ba在确认TLR2、TLR4和MYD88在这些细胞中的表达后，启动子被表达。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们也证实了gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba无明显脱靶现象gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba免疫和造血组织中的基因缺失可能是RANKL和炎症介质的来源(补充图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了诱导骨溶解，Pam3CSK4(以下称为Pam3)或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)衍生的脂多糖(LPS)注射到gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠。显微ct分析显示gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba与对照组相比，小鼠的骨溶解明显减少gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba(图5)gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．TRAP染色显示，小鼠的破骨细胞数量减少gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)．表达水平gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在骨组织中被下调gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而骨保护素(OPG，编码于gydF4y2BaTnfrsf11bgydF4y2Ba基因)水平比较，导致的gydF4y2BaRankl /功能gydF4y2Ba比率是评估骨中破骨细胞发生的一个参数。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．Pam3下降gydF4y2Ba功能gydF4y2Ba无论是否存在MYD88缺失，其在骨中的表达水平(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．此外,gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba当小鼠被挑战时，破骨细胞生成减少，防止骨溶解gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba-源性脂磷选择酸(LTA)，gydF4y2BaPggydF4y2Ba-衍生的LPS，或活的gydF4y2BaPggydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba−4 hgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba5−dgydF4y2Ba)．骨细胞和成熟成骨细胞RANKL缺失gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaRanklgydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠在颅骨注射模型中阻断了骨侵蚀和破骨细胞形成(补充图。gydF4y2Ba6 a -gydF4y2Ba)．相反，白细胞介素-1受体(IL-1R)的缺失gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaIl1r1gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠没有挽救骨侵蚀或增加破骨细胞发生和gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba7 jgydF4y2Ba)．总之，这些结果表明，骨细胞和成熟成骨细胞中TLR2/4-MYD88-RANKL轴的激活与PAMPs诱导的骨溶解有关。股骨骨特性无明显变化gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba生理条件下的小鼠(补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)表明，当骨细胞/成熟成骨细胞MYD88通路被细菌激活时，该通路对骨吸收非常重要。gydF4y2Ba

图1:骨细胞和成熟成骨细胞中缺乏MYD88可挽救Pam3CSK4注射液诱导的颅骨骨溶解。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba头颅的显微ct图像。每组雄性小鼠的代表性图像(gydF4y2BangydF4y2Ba≥5 /组)。gydF4y2BabgydF4y2Ba小牛的侵蚀面积、BS/BV和BV/TV (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5, 5, 5, 8, 7, 11在男性，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4, 6, 4, 4, 7, 9, 10女性)。gydF4y2BacgydF4y2Ba颅骨TRAP染色。每组雄性小鼠的代表性图像(gydF4y2BangydF4y2Ba≥4 /组)。比例尺= 100 μm。gydF4y2BadgydF4y2Ba颅骨表面破骨细胞的组织形态学分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4, 7, 7, 10男性，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4, 6, 9, 10女性)。gydF4y2BaegydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 6、3、7、5、4、4、7、5gydF4y2BangydF4y2Ba= 6, 3, 6, 5, 6, 3, 7, 6女性)，gydF4y2Ba功能gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 7, 6, 7, 5, 7, 6, 7, 5，男性，gydF4y2BangydF4y2Ba= 6, 3, 7, 6, 6, 3, 7, 6)和它们的比例(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6、3、7、5、4、4、7、5gydF4y2BangydF4y2Ba= 6、3、6、5、6、3、7、6女性)在皮肤和颅骨组织中。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2BaPam3 = Pam3CSK4。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。＊gydF4y2BapgydF4y2BaTukey-Kramer检验单因素方差分析< 0.05。Ns =不显著。每个数据点代表一只生物上独立的老鼠。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

骨细胞和成熟成骨细胞中MYD88的靶向缺失保护牙周炎患者的牙槽骨吸收gydF4y2Ba

T和B淋巴细胞是牙周炎中已知的RANKL细胞来源gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba．因此，这些细胞在口腔诱导的牙槽骨丢失中起作用gydF4y2BaPggydF4y2Ba调查感染情况。值得注意的是，缺乏rag1的小鼠(gydF4y2BaRag1gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)缺乏T/B淋巴细胞对牙槽骨丢失没有明显的保护作用(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．我们接下来检查了骨细胞和成熟成骨细胞中TLR2-MYD88轴是否直接控制gydF4y2BaPggydF4y2Ba因为已知TLR2信号在gydF4y2BaPggydF4y2Ba牙周炎模型gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba牙槽骨骨细胞/成熟成骨细胞表达TLR2和MYD88(补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．我们发现两者gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaTlr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠感染gydF4y2BaPggydF4y2Ba牙釉质交界处(CEJ)与牙槽骨嵴(ABC)之间的距离减小，牙槽骨损失明显减少gydF4y2BaPggydF4y2Ba来华的gydF4y2BaTlr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠(图;gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．这种减少伴随着牙槽骨表面破骨细胞形成的抑制(图。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)．同时,gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba牙槽骨组织的水平降低gydF4y2BaPggydF4y2Ba来华的gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaTlr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠(补充图;gydF4y2Ba9 b, cgydF4y2Ba)．支持以前的报告gydF4y2Ba11 gydF4y2Ba牙槽骨丢失和破骨细胞形成增多被阻断gydF4y2BaPggydF4y2Ba来华的gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaRanklgydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠(补充图;gydF4y2Ba9 d, egydF4y2Ba)．的gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba树上的老鼠gydF4y2BaRag1gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba背景显示牙槽骨保护。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)，但缺乏IL-1R信号对牙槽骨丢失没有影响(补充图。gydF4y2Ba9 fgydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明，骨细胞和成熟成骨细胞中TLR2-MYD88-RANKL轴的激活与牙周炎中的牙槽骨吸收有关gydF4y2BaPggydF4y2Ba．此外，数据表明，骨细胞和成熟的成骨细胞是RANKL的主要来源gydF4y2BaPggydF4y2BaT/B淋巴细胞的RANKL对牙周炎模型的破骨细胞生成影响不大。重要的是,gydF4y2BaPggydF4y2Ba在牙槽骨的骨细胞腔隙-管系统中发现了这种成分。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)，表明骨细胞中的TLR2-MYD88轴直接被激活gydF4y2BaPggydF4y2Ba-来源的PAMPs诱导RANKL表达，导致牙槽骨吸收。gydF4y2Ba

图2:骨细胞和成熟成骨细胞中的TLR2-MYD88轴调节牙龈卟啉单胞菌感染引起的牙周炎的骨溶解。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba上图:右上颌骨显微ct图像。每组雄性小鼠的代表性图像(gydF4y2BangydF4y2Ba≥5 /组)。颊侧视图。下:右上颌磨牙CEJ-ABC与右上颌第二磨牙下牙槽牙槽BV/TV的总距离。gydF4y2Ba一个gydF4y2BangydF4y2Ba= 8, 5, 5, 6男性。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5, 5, 8, 6女性。gydF4y2BabgydF4y2BangydF4y2Ba男性= 5,5,7,6。gydF4y2BangydF4y2Ba= 4, 6, 7, 7女性。gydF4y2BacgydF4y2BaCEJ-ABC:gydF4y2BangydF4y2Ba= 7, 9, 17, 13男性。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5, 8, 4, 11女性。BV /电视:gydF4y2BangydF4y2Ba= 7, 8, 16, 10男性。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5, 8, 4, 11女性。gydF4y2BafgydF4y2BangydF4y2Ba男性= 5,5,5,7。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3, 6, 3, 8女性。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba上图:牙槽骨TRAP染色。每组雄性小鼠的代表性图像(gydF4y2BangydF4y2Ba≥4 /组)。比例尺= 100 μm。下:牙槽骨表面破骨细胞的组织形态学分析。gydF4y2BadgydF4y2BangydF4y2Ba= 4, 5, 7, 6的男性。gydF4y2BangydF4y2Ba= 4, 7, 7, 7女性。gydF4y2BaegydF4y2BangydF4y2Ba= 5、6、15、11名男性。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5, 6, 4, 9女性。gydF4y2BaggydF4y2Ba免疫荧光图像gydF4y2BaPggydF4y2Ba牙槽骨中检测到的成分(绿色，箭头所示)。细胞核:DAPI(蓝色)。牙槽骨。牙周韧带。三个独立实验的代表性图像。比例尺= 100 μ m。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2BaPggydF4y2Ba=gydF4y2BaPorphyromonas gingivalisgydF4y2Ba．gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。＊gydF4y2BapgydF4y2BaTukey-Kramer检验单因素方差分析< 0.05。Ns =不显著。每个数据点代表一只生物上独立的老鼠。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

骨细胞和成熟成骨细胞中MYD88的靶向恢复足以引起骨溶解gydF4y2Ba

已知骨细胞和成骨细胞可表达炎性细胞因子gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba．因此，我们假设，这些细胞中MYD88通路的细菌激活可能足以引起炎症性骨溶解。我们雇佣了gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠，其中MYD88功能活跃只在gydF4y2BaCregydF4y2Ba曝光gydF4y2Ba29gydF4y2Ba并证实了gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba显示无法检测到gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba免疫细胞和造血组织中的基因恢复(补充图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．的gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠注射Pam3或感染gydF4y2BaPggydF4y2Ba显示骨溶解类似于gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba+/+gydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．在两种骨溶解模型中，破骨细胞诱导和gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba观察到骨组织的升高gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)．H&E染色显示pam3注射后的头颅有大量炎症细胞浸润gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．pam3注射后，覆盖头颅的皮损中炎性细胞因子的表达水平升高gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠的牙龈gydF4y2BaPggydF4y2Ba来华的gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba与老鼠相比gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba用Pam3或gydF4y2BaPggydF4y2Ba，分别见图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．皮肤病变的免疫组化染色和qPCR分析显示pam3注射后的颅骨病变gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠体内含有大量Ly6G或F4/80阳性的免疫细胞。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．这些结果表明，骨细胞和成熟成骨细胞中MYD88通路的特异性激活足以触发破骨细胞对骨的吸收，并通过招募炎症细胞(主要是中性粒细胞和巨噬细胞)在骨表面进展炎症。gydF4y2Ba

图3:骨细胞和成熟成骨细胞中MYD88通路的靶向激活足以引发颅骨骨溶解和牙槽骨丢失。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba上图:头颅的显微ct图像。每组注射Pam3CSK4 (gydF4y2BangydF4y2Ba≥6 /组)。底部:侵蚀面积(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7,10,3,8,8,6)， bs / bv (gydF4y2BangydF4y2Ba= 7,9,3,8,8,6)，及BV/TV (gydF4y2BangydF4y2Ba= 7, 9, 3, 8, 8, 6)gydF4y2BabgydF4y2Ba上图:右上颌骨显微ct图像。每组雄性小鼠接种的代表性图像gydF4y2BaPggydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba≥3 /组)。颊侧视图。下:右上颌磨牙CEJ-ABC与右上颌第二磨牙下牙槽牙槽BV/TV的总距离。gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,4,3,4,3,5。gydF4y2BacgydF4y2Ba上图:颅骨TRAP染色。每组注射Pam3CSK4 (gydF4y2BangydF4y2Ba≥5 /组)。比例尺= 100 μm。左下:颅骨表面破骨细胞的组织形态学分析。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5,7,3,7,5,6。右下:qPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在颅骨骨组织中。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5,7,6,8,7,7。gydF4y2BadgydF4y2Ba上图:牙槽骨TRAP染色。每组雄性小鼠接种的代表性图像gydF4y2BaPggydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba≥3 /组)。比例尺= 100 μm。左下:牙槽骨表面破骨细胞的组织形态学分析。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,4,3,4,3,5。右下:qPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在牙槽骨组织中。gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,5,6,4,3,5。gydF4y2BaegydF4y2Ba冠状线和矢状线交点皮肤组织的H&E染色。每组注射Pam3CSK4 (gydF4y2BangydF4y2Ba≥3 /组)。比例尺= 100 μm。gydF4y2BafgydF4y2Ba头盖骨和牙龈组织皮肤组织炎症因子的qPCR分析。皮肤gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 5,3,3,9,3,4).皮肤gydF4y2Ba白细胞介素6gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,3,3,9,3,4).牙龈gydF4y2Ba肿瘤坏死因子,Il1bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba白细胞介素6gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,3,3,4,3,3)。gydF4y2BaggydF4y2Ba左图:颅骨皮肤组织中性粒细胞和巨噬细胞免疫组化染色。有代表性的图像来自三个独立的实验，结果相似。比例尺= 100 μm。右图:大头颅皮肤组织巨噬细胞和中性粒细胞标记基因qPCR分析。gydF4y2BaLy6ggydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,3,3,8,3,4)。gydF4y2BaAdgre1gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 5,3,3,8,3,4)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba数据来自雄性小鼠。雌性小鼠也表现出类似的结果。Pam3 = Pam3CSK4。gydF4y2BaPggydF4y2Ba＝gydF4y2BaPorphyromonas gingivalisgydF4y2Ba．gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。＊gydF4y2BapgydF4y2BaTukey-Kramer检验单因素方差分析< 0.05。gydF4y2Ba＃gydF4y2BapgydF4y2Ba双尾未配对时< 0.05gydF4y2BatgydF4y2Ba-test被使用(gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba)．ns =方差分析不显著。每个数据点代表一只生物上独立的老鼠。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

骨细胞对pamp的反应中，RANKL的表达量明显高于成骨细胞gydF4y2Ba

骨细胞和成骨细胞都是RANKL形成破骨细胞的细胞来源gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba．为了研究骨细胞的RANKL诱导能力是否与成骨细胞不同，采用胶原酶和EDTA连续消化法从10周龄小鼠颅骨中分离出骨细胞富集细胞群(Ocy)和成骨细胞富集细胞群(Ob)gydF4y2Ba31gydF4y2Ba接着是造血细胞的耗竭(补充图。gydF4y2Ba11得了gydF4y2Ba)．硬化蛋白阳性细胞的百分比与体内骨细胞的百分比相当gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2BaOcy中角化瘤阳性细胞污染较少，骨细胞标记基因和硬化蛋白表达明显高于Ob，说明骨细胞在Ocy中高度富集(补充图。gydF4y2Ba11 d-fgydF4y2Ba)．同样，Ob中成骨细胞高度富集gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba是否在报告小鼠的骨细胞和成骨细胞中都显示出活性gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，我们发现它消耗MYD88、TLR2和RANKL，并恢复MYD88，对Ocy具有显著特异性(补充图。gydF4y2Ba11 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Pam3刺激Ocy，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS, Pam2CSK4，热杀死gydF4y2BaPggydF4y2Ba,或gydF4y2BaPggydF4y2Ba培养上清，但没有鞭毛gydF4y2Ba鼠伤寒沙门氏菌gydF4y2Ba(FLA-ST)或单链RNA, RANKL蛋白或mRNA的表达明显高于Ob，而基础gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba据报道，Ocy的水平更高gydF4y2Ba9gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba12个一个gydF4y2Ba)．的gydF4y2BaRanklgydF4y2BaOcy组的诱导速度快于Ob组。值得注意的是，Pam3的刺激，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS或Pam2CSK4引起双相gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba海拔在8和48小时达到峰值。MYD88的遗传缺失和药理阻断阻断了Ocy中RANKL mRNA和蛋白的诱导(补充图。gydF4y2Ba12个罪犯gydF4y2Ba)．Ocy与来自骨髓的破骨细胞前体共培养gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠在Pam3或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS比Ob以rankl依赖性的方式引起更显著的破骨细胞形成(图。gydF4y2Ba四氟gydF4y2Ba)．当中和抗体阻断RANKL时，Ocy共培养中破骨细胞相关基因的表达增加被抑制(补充图。gydF4y2Ba12 egydF4y2Ba)．这些刺激不能诱导RANKL的可溶性形态(补充图。gydF4y2Ba12 fgydF4y2Ba)．这些数据表明，在细菌pamp存在的情况下，骨细胞比其前体成骨细胞有更大的能力支持破骨细胞的发生，并表明骨细胞MYD88通路的激活通过诱导RANKL膜结合形式驱动骨吸收。考虑到研究发现gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba在Ocy中选择性地删除和恢复MYD88，可以想象，骨细胞中的MYD88通路而不是成骨细胞中的MYD88通路在调节颅骨骨溶解过程中PAMPs诱导的破骨细胞形成中起主要作用gydF4y2BaPggydF4y2Ba驱动牙周炎模型。gydF4y2Ba

图4:与成骨细胞富集的细胞群相比，PAMPs在成骨细胞富集的细胞群中诱导RANKL表达更强烈。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3CSK4 (100 ng/mL)刺激的成骨细胞富集细胞群(Ob)和成骨细胞富集细胞群(Ocy)，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS (100 ng/mL)，或PBS每24小时。PBS处理0 h后Ob细胞的平均表达量设为1。具有代表性的数据来自5个具有相似结果的独立实验，每个实验有3个重复(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BabgydF4y2Ba用Pam3CSK4刺激Ob和Ocy的细胞裂解物对RANKL进行Western印迹，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS或PBS。代表图像来自五个独立实验，结果相似。gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba骨髓来源的m - csf依赖性巨噬细胞的共培养gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba从野生型分离出Ob或Ocy雄性小鼠(gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba+/+gydF4y2Ba) C57BL/ 6j雄性小鼠。Pam3CSK4刺激细胞，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用LPS或PBS治疗7天。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2BaTRAP +多核细胞(MNCs)的形成及每孔TRAP +多核细胞的数量。具有代表性的图像和数据(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6/组)从三个独立实验中得到相似的结果。比例尺= 100 μm。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba在RANKL中和抗体存在和不存在7天的情况下，每孔TRAP + MNCs的数量。三个独立实验的代表性数据均有相似的结果(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6 /组)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2BaPam3 = Pam3CSK4。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba＃gydF4y2BapgydF4y2Ba双尾不配对< 0.05gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba＃gydF4y2BapgydF4y2Ba双尾不配对< 0.05gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。＊gydF4y2BapgydF4y2Ba单因素方差分析+ Tukey-Kramer检验< 0.05。Ns =不显著gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba＊gydF4y2BapgydF4y2BaTukey-Kramer检验单因素方差分析< 0.05。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

MYD88-ERK通路激活CREB和STAT3调节骨细胞中RANKL的诱导gydF4y2Ba

TLR2信号通路仅由MYD88介导，而TLR4信号通路同时由MYD88和toll样受体适配器分子1 (TICAM1，也称为TRIF)介导gydF4y2Ba39gydF4y2Ba．为了研究MYD88通路在Ocy中诱导RANKL的机制，我们使用Pam3激活Ocy。Pam3刺激增加了Ocy中ERK、JNK、p38和NF-kB p65的磷酸化水平。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba) 8小时。非细胞毒性剂量的MEK抑制剂的治疗，而不是JNK, p38或IKK抑制剂的抑制gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在pam3刺激的Ocy中表达到基础水平(PBS处理无抑制剂)，且呈剂量依赖性(图1)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)，表明ERK信号通路起主导作用gydF4y2BaRanklgydF4y2BaOcy中MYD88下游的转录。ERK信号的具体影响gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在转染MEK1/2 sirna的MLO-Y4细胞中证实了其诱导作用。gydF4y2Ba13 a、bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图5:在骨细胞富集的细胞群中，激活MYD88通路通过ERK-CREB/STAT3轴诱导RANKL。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba对Pam3CSK4或PBS刺激的Ocy中磷酸化的(p)和总ERK、JNK、p38和NF-kB p65蛋白进行Western印迹分析。Min . =分钟。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba．在Pam3CSK4或PBS刺激8小时之前，Ocy先用浓度增加的抑制剂或载药(DMSO)预处理2小时。具有代表性的数据来自三个结果相似的独立实验，每个实验有三个重复(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BadgydF4y2Ba用Pam3CSK4或PBS刺激的Ocy中磷酸化(p)和总CREB和STAT3蛋白的Western blotting。Min . =分钟。gydF4y2BaegydF4y2Ba左图:磷酸化(p)和总CREB和STAT3蛋白的Western blotting。用MYD88抑制剂T6167923(20µM)或载药(DMSO)预处理Ocy 2 h，然后用Pam3CSK4或PBS刺激8 h。右图:ImageJ对p-CREB/CREB和p-STAT3/STAT3比值的密度分析。gydF4y2BafgydF4y2Ba左图:磷酸化(p)和总CREB和STAT3蛋白的Western blotting。用MEK1/2抑制剂U0126(20µM)或载药(DMSO)预处理Ocy 2小时，然后用Pam3CSK4或PBS刺激8小时。右图:ImageJ对p-CREB/CREB和p-STAT3/STAT3比值的密度分析。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba图表由三个独立实验的数据创建(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BaggydF4y2Ba用Pam3CSK4或PBS刺激Ocy 8小时，CUT & RUN测定CREB和STAT3。诱导CREB和STAT3结合到gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba启动子和增强子通过qPCR相对于同型对照IgGs进行定量(倍数富集)。具有代表性的数据来自三个结果相似的独立实验，每个实验有三个重复(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。该图显示了鼠标gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3CSK4刺激Ocy中启动子和增强子位点以及CREB和STAT3的结合位点。转录起始点。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2BaPam3 = Pam3CSK4。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba来自三个以上独立实验的代表性图像。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba＊gydF4y2BapgydF4y2BaTukey-Kramer检验单因素方差分析< 0.05。Ns =不显著。gydF4y2BaggydF4y2Ba＃gydF4y2BapgydF4y2Ba双尾不配对< 0.05gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

RanklgydF4y2Ba转录受多种转录因子(tf)的结合控制，包括CREB、STAT3/5、c-Fos和Runx2，以刺激和细胞类型特异性的方式与十种调控增强子结合gydF4y2Ba40gydF4y2Ba．增加gydF4y2BaRanklgydF4y2BaCREB和STAT3抑制剂使表达减弱，而STAT5、c-Fos或Runx2抑制剂则没有减弱(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)，表明CREB和STAT3是重要的转录因子gydF4y2BaRanklgydF4y2BaMYD88和ERK下游的诱导。CREB和STAT3的关键作用gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在转染CREB或STAT3 sirna的MLO-Y4细胞中进行了验证。gydF4y2Ba13 c, dgydF4y2Ba)．与实验结果一致的是，Pam3处理增强了CREB和STAT3的磷酸化水平(图1)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．存在剂量依赖的相关性gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在Pam3缺失的情况下，CREB抑制剂的抑制表明CREB的本构激活对维持骨细胞中RANKL的基础水平很重要。我们发现，T6167923或U0126治疗和MYD88通路的遗传消融阻断了CREB和STAT3的磷酸化，证实了在pam3刺激的Ocy中，MYD88- erk通路激活了CREB和STAT3(图1)。gydF4y2Ba5 e, fgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba13 egydF4y2Ba)．最后，CUT和RUN试验表明，Pam3增加了CREB和STAT3与D2/D4/D5/T3和D2/D5/D6增强子的结合gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba基因，分别(图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．同样的,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS激活ERK-CREB/STAT3通路增加gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba14模拟gydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明MYD88-ERK通路介导的CREB和STAT3激活在早期起调节作用gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3刺激Ocy 8 h诱导。gydF4y2Ba

骨细胞中FBXL19和PDLIM2通过CREB/CBP和STAT3泛素化调控RANKL的表达gydF4y2Ba

接下来，我们试图确定Pam3增加的机制gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba8小时后的转录时间点较晚。我们发现，在12小时后，通过T6167923阻断MYD88通路显著降低了Ocy中的CREB、CBP和STAT3蛋白，但没有降低mrna(图1)。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．同样，在Ocy中，基因缺失MYD88抑制了这些转录因子的蛋白水平，但没有抑制mRNA水平(图1)。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．MG132存在时CREB、CBP和STAT3蛋白水平的恢复，而leupeptin不存在，表明这些tf的不稳定是由泛素-蛋白酶体通路介导的(图。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图6:MYD88通路调节骨细胞富集细胞群中CREB、CBP和STAT3蛋白的稳定性。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaWestern blot检测野生型Ocy中CREB、CBP和STAT3蛋白的表达gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba+ l +gydF4y2Ba)雄鼠。每24 h用T6167923或载药(DMSO)处理Ocy。图显示了在0 h时相对于dmso处理过的Ocy的蛋白条带的强度(%)。图表由三个独立实验的数据创建(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。β -肌动蛋白归一化。gydF4y2BabgydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaCreb1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba海关与边境保护局gydF4y2Ba,gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba在男性gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba+ l +gydF4y2BaOcy加或不加T6167923 (20 μ M) 48 h。每24 h加入T6167923。具有代表性的数据来自三个结果相似的独立实验，每个实验有三个重复(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BacgydF4y2BaWestern blotting检测从Ocy中分离出的指示蛋白gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba雄性老鼠。图表显示了蛋白质带的强度gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠相对于那些来自gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Baβ-肌动蛋白归一化小鼠(%)。图表由三个独立实验的数据创建(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BadgydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaCreb1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba海关与边境保护局gydF4y2Ba,gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba在Ocy分离gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba雄性老鼠。来自三个独立实验的代表性数据，每个实验有三个重复(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2BaOcy分离出CREB, CBP和STAT3蛋白的Western blotgydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba+ l +gydF4y2Ba雄性老鼠。先用蛋白酶体抑制剂MG132 (1 μM)或溶酶体抑制剂leupeptin (100 μM)处理Ocy 3 h，再用T6167923 (20 μM)处理48 h。每24 h向培养物中添加MG132、leupeptin和T6167923。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。gydF4y2Ba＃gydF4y2BapgydF4y2Ba双尾不配对< 0.05gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。Ns =不显著。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba来自三个以上独立实验的代表性图像。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

相反，Pam3的激活增加了CREB、CBP和STAT3蛋白的稳定性，而它们的mRNA水平没有变化(图1)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．Pam3刺激后CREB、CBP和STAT3的赖氨酸(K) 48泛素化降低证实了泛素-蛋白酶体途径控制着MYD88下游这些转录因子的稳定性(图。gydF4y2Ba7罪犯gydF4y2Ba)．进一步，我们研究了Ocy中CREB、CBP和STAT3的泛素连接酶。F-box和富含亮氨酸重复蛋白19 (FBXL19)是一种E3泛素连接酶，使CBP泛素化gydF4y2Ba41gydF4y2Ba．我们发现，在刺激MYD88通路后，FBXL19蛋白而不是mRNA在Ocy中不稳定。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba16一个gydF4y2Ba)．因此，我们研究了Pam3对含FBXL19和CREB/CBP分子复合物形成的影响。CREB和CBP与FBXL19形成分子络合物，Pam3刺激减少了络合物的形成(图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．骨细胞IDG-SW3细胞中FBXL19的慢病毒过表达增加了CREB和CBP的k48 -泛素化，并降低了这些蛋白的水平。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba)．事实上，FBXL19过表达抑制了骨细胞IDG-SW3细胞中的RANKL蛋白和mRNA水平。gydF4y2Ba7小时,我gydF4y2Ba)．相反，是推倒gydF4y2BaFbxl19gydF4y2BaCREB和CBP蛋白增加，RANKL蛋白和mRNA上调，CREB和CBP的泛素化降低(补充图。gydF4y2Ba16中gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图7:在骨细胞富集的细胞群中，激活MYD88途径通过降低CREB、CBP和STAT3泛素化诱导RANKL。gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaPam3CSK4或PBS刺激Ocy中CREB、CBP和STAT3蛋白的降解动力学。用环己酰亚胺(CHX, 10 μM)和Pam3CSK4/PBS每24 h处理一次Ocy。图表显示了蛋白质带相对于0 h时的强度(%)。β-肌动蛋白归一化。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba在CREB、CBP和STAT3的免疫沉淀(IP)后对k48 -泛素化蛋白进行Western印迹。用Pam3CSK4或PBS刺激Ocy 48小时。gydF4y2BaegydF4y2BaPam3CSK4或PBS刺激Ocy中FBXL19的Western印迹。gydF4y2BafgydF4y2BaCREB和CBP的IP，然后是FBXL19的Western blotting。Pam3CSK4或PBS刺激后48小时。gydF4y2BaggydF4y2BaCREB或CBP蛋白IP后k48 -泛素化蛋白的蛋白印迹。使用过表达标记FBXL19的小鼠FBXL19的分化IDG-SW3细胞的细胞裂解液。图表显示了整个细胞裂解物中CREB、CBP和FBXL19蛋白条带对抗β-肌动蛋白的相对强度。gydF4y2BahgydF4y2Ba左图:用过表达标记FBXL19的小鼠FBXL19的分化IDG-SW3细胞的细胞裂解液对RANKL进行Western印迹。右图:β-肌动蛋白归一化后RANKL蛋白的相对水平。gydF4y2Ba我gydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba用Pam3CSK4或PBS刺激过表达标记小鼠FBXL19的分化IDG-SW3细胞48小时。gydF4y2BajgydF4y2BaPam3CSK4或PBS刺激Ocy中PDLIM2的Western印迹。gydF4y2BakgydF4y2BaSTAT3的IP，然后是PDLIM2的Western blotting。Pam3CSK4或PBS刺激后48小时。gydF4y2BalgydF4y2BaSTAT3蛋白IP后k48 -泛素化蛋白的Western印迹。使用过表达myc标记的小鼠PDLIM2的分化IDG-SW3细胞的细胞裂解液。图显示了整个细胞裂解物中STAT3和PDLIM2蛋白条带对抗β-Actin的相对强度。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba左图:用过度表达myc标记小鼠PDLIM2的分化IDG-SW3细胞的细胞裂解液进行RANKL的Western印迹。右图:β-肌动蛋白归一化后RANKL蛋白的相对水平。gydF4y2BangydF4y2BaqPCR分析gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba用Pam3CSK4或PBS刺激过表达myc标记小鼠FBXL19的分化IDG-SW3细胞48小时。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2BaPam3 = Pam3CSK4。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba图表由三个独立实验的数据创建(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba具有代表性的数据来自三个结果相似的独立实验，每个实验有三个重复(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。gydF4y2Ba＃gydF4y2BapgydF4y2Ba双尾不配对< 0.05gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba米gydF4y2Ba来自三个以上独立实验的代表性图像。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

PDLIM2是E3泛素连接酶，调节STAT3降解gydF4y2Ba42gydF4y2Ba．我们发现，刺激MYD88通路可使Ocy中PDLIM2蛋白和mRNA不稳定。gydF4y2Ba7 jgydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba17一个gydF4y2Ba)．STAT3与PDLIM2形成络合物，Pam3刺激减少了Ocy中络合物的形成(图。gydF4y2Ba7 kgydF4y2Ba)．慢病毒过表达PDLIM2增加了骨细胞IDG-SW3中STAT3的k48 -泛素化，降低了STAT3蛋白水平(图。gydF4y2Ba7 lgydF4y2Ba)．在过表达PDLIM2的IDG-SW3骨细胞中，RANKL蛋白和mRNA水平降低(图1)。gydF4y2Ba7 m, ngydF4y2Ba)．相比之下,gydF4y2BaPdlim2gydF4y2Ba敲低使STAT3蛋白增加，RANKL蛋白和mRNA升高，同时降低STAT3的泛素化(补充图。gydF4y2Ba17中gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

甲状旁腺激素(PTH)刺激骨细胞蛋白激酶A (PKA)诱导creb介导gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba表达式gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba．然而，PKA的抑制作用没有被抑制gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3诱导(补充图。gydF4y2Ba18一个gydF4y2Ba)．此外，Pam3刺激并没有增加CRTC2的结合，CRTC2是一种CREB的共激活物，对pth诱导的RANKL表达至关重要gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba增强剂，提示作用机制gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3的诱导作用与PTH的诱导作用不同。gydF4y2Ba18 bgydF4y2Ba)．已知IL-6和TNF-ɑ增加骨细胞中RANKL的表达gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba．IL-6中和，TNF-ɑ中和，部分被抑制gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3诱导(补充图。gydF4y2Ba18 cgydF4y2Ba)，表明pamp驱动gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba骨细胞的上调主要是由TLR直接激活调节的，但骨细胞衍生的细胞因子通过自分泌或旁分泌的方式增强它。因此，结果表明，在Ocy中，CREB、CBP和STAT3的k48 -泛素化是诱导MYD88下游RANKL表达的另一个关键机制，其中FBXL19和PDLIM2在泛素化过程中发挥关键作用。gydF4y2Ba

MYD88抑制剂可预防牙周炎中的牙槽骨丢失gydF4y2Ba

我们测试了一种myd88特异性抑制剂对牙周炎的治疗效果。我们发现T6167923的系统性给药gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba对野生型小鼠牙槽骨CEJ-ABC距离的增加和BV/TV的降低具有保护作用gydF4y2BaPggydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba)．这些保护作用伴随着牙槽骨表面破骨细胞形成的减少和牙槽骨破骨细胞相关基因表达的减少(图。gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba)．数据显示，MYD88的药理抑制作用可在体内抑制由牙周炎引起的破骨细胞诱导和牙槽骨吸收，从而提示MYD88可能是包括牙周炎在内的细菌感染引起的骨丢失的治疗靶点。gydF4y2Ba

图8:给药MYD88抑制剂可防止牙龈卟啉单胞菌感染引起的牙周炎的牙槽骨丢失。gydF4y2Ba
图8gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba左:右上颌骨显微ct图像gydF4y2BaPorphyromonas gingivalisgydF4y2Ba（gydF4y2BaPggydF4y2Ba)或灌药接种野生型C57BL/ 6j雄性小鼠，给药剂量为T6167923或DMSO。颊侧视图。每组雄性小鼠的代表性图像。右图:右上颌磨牙的CEJ-ABC总距离。gydF4y2BabgydF4y2Ba右上颌第二磨牙下牙槽牙BV/TV。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2BaPggydF4y2Ba+ dmso (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5),gydF4y2BaPggydF4y2Ba+ t6167923 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)，车辆+ DMSO (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)，车辆+ T6167923 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)。gydF4y2BacgydF4y2Ba左:牙槽骨TRAP染色。每组雄性小鼠的代表性图像(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5 /组)。比例尺= 100 μm。右:牙槽骨表面破骨细胞的组织形态学分析。gydF4y2BadgydF4y2Ba牙槽骨破骨细胞相关基因qPCR分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5 /组)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba数据以平均值±标准差表示。＊gydF4y2BapgydF4y2BaTukey-Kramer检验单因素方差分析< 0.05。Ns =不显著。每个数据点代表一只生物上独立的老鼠。源数据作为源数据文件提供。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

骨溶解与骨感染相关的机制尚不清楚。此外，尚不清楚细菌感染引发的骨细胞myd88介导的宿主防御系统是否以及如何影响骨骼。目前的研究表明，骨细胞通过直接将MYD88通路激活整合到负责破骨细胞形成的RANKL诱导机制中，从而主导控制细菌诱导的骨溶解。模式识别受体TLR2和TLR4在骨细胞对细菌pamp的识别中发挥核心作用。通过这些受体，MYD88通路将感染信号转换为骨吸收信号。我们的数据还表明，骨细胞MYD88通路对骨吸收的影响出现在病理环境而不是生理环境中。我们建立了一种改进的方法，分别分离成骨细胞富集和成骨细胞富集的细胞群从成年小鼠的颅骨。使用这种方法，我们发现骨细胞在pamp刺激下表达的RANKL量明显高于成骨细胞，10 kbgydF4y2BaDmp1gydF4y2Ba与成骨细胞相比，启动子对骨细胞具有高度特异性。因此，对颅骨骨溶解和牙槽骨丢失的治疗有重要意义gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba骨细胞中的TLR-MYD88信号轴主要调控口腔和颅面区骨感染中的骨溶解。此外,gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba骨细胞特异性表明，骨细胞是细菌诱导骨吸收机制中RANKL的主要来源。gydF4y2Ba

来自骨细胞的RANKL已被证明在生理性和病理性骨吸收中发挥关键作用gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba．但它在骨感染中的作用尚不清楚。此外，在体外实验中，细菌PAMPs已被证明能增加新生小鼠颅骨成骨细胞和骨细胞MLO-Y4细胞系中RANKL的表达gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，这些研究从未直接比较骨细胞和成骨细胞之间诱导RANKL的潜力。我们发现，激活MYD88通路促进RANKL mRNA和蛋白的表达在骨细胞富集的细胞群中要比在骨细胞富集的细胞群中更为强烈。考虑到骨细胞是骨中最丰富的细胞，骨细胞富集细胞更高的RANKL诱导能力可能是我们得出骨细胞在细菌骨感染中破骨细胞形成中起主导作用的结论的基础。gydF4y2Ba

当受到细菌病原体的刺激时，骨细胞调节造血和分泌广泛的炎症因子gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba．然而，这种骨细胞衍生因子在体内对骨骼的影响尚未确定。令我们惊讶的是，gydF4y2BaDmp1-Cre; Myd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠发现，MYD88通路的骨细胞选择性恢复足以触发和发展骨表面的炎症和骨溶解，这表明骨细胞转化为强大的炎症细胞，在细菌pamp刺激下，不仅提供RANKL，还提供促炎症的“骨细胞因子”和“骨趋化因子”。因此，在骨感染性疾病中，“骨细胞炎症”可能调节免疫细胞和破骨细胞祖细胞向骨表面的迁移。中性粒细胞和巨噬细胞的协同激活可能是促进骨表面炎症病变发展的必要条件。确定哪些骨细胞源性炎症介质在招募中性粒细胞和巨噬细胞到骨表面的过程中发挥关键作用，以及炎症骨细胞是否参与了骨细胞骨溶解的机制，将是很有趣的。详细的时间过程研究gydF4y2BaDmp1-Cre; Myd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDmp1-Cre; Myd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠将确定受包括RANKL在内的骨细胞源性炎症介质严重影响的炎症和骨吸收阶段(如起始、进展或建立)。总之，目前的研究提供了遗传学证据，骨细胞是骨吸收和炎症的直接细胞介质。因此，骨细胞可能是阻断破骨细胞祖细胞和炎症细胞向骨表面迁移的细胞靶点。gydF4y2Ba

从机制上讲，激活MYD88通路增加了CREB和STAT3的磷酸化水平，而阻断这些tf可以防止gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba骨细胞诱导。这些数据显示了CREB和STAT3的关键作用gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba骨细胞的调节。CREB是众所周知的监管机构gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba通过结合成骨细胞样MC3T3-E1细胞中的D2, D4和D5增强子来转录gydF4y2Ba40gydF4y2Ba．我们的数据显示，在骨细胞富集的细胞群中，除了D2、D4和D5增强子外，Pam3促进了CREB与T3增强子的结合。T3最初在T细胞特异性机制中被鉴定出来gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba转录gydF4y2Ba56gydF4y2Ba．CREB与T3结合可能对骨细胞特异性机制很重要gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba归纳。类似地，STAT3对gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba通过与ST2小鼠间质细胞系中的D4、D5和D6增强子结合转录gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba．我们发现，在骨细胞富集的细胞群中，Pam3刺激刺激了STAT3与D2、D5和D6增强子的结合。因此，增加STAT3与D2的结合可能与更健壮的机制有关gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba诱导的骨细胞多于成骨细胞。全基因组比较骨细胞和其他细胞类型(包括成骨细胞和T细胞)之间的CREB和STAT3结合位点对Pam3的响应变化，将识别出新的骨细胞特异性gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba转录机制。gydF4y2Ba

更大的gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba骨细胞富集细胞的诱导能力也可以通过CREB、CBP和STAT3蛋白稳定性的增加来解释。我们发现MYD88通路通过CREB/CBP和STAT3的k48 -泛素化及其蛋白酶体降解调节RANKL的表达。FBXL19是一种F-box蛋白，在Skp1-Cul1-F-box蛋白(SCF) E3泛素连接酶复合体中调节CBP、Rac1/3、RhoA和IL-33R的泛素化gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba．我们的数据显示，骨细胞中CREB是FBXL19的泛素化靶点，FBXL19通过CREB和CBP调控骨细胞RANKL的产生。PDLIM2是STAT3的E3泛素连接酶，在T细胞和巨噬细胞功能中发挥重要作用gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba．然而，它在骨骼系统中的作用仍然未知。我们发现PDLIM2在骨骼系统中的一个关键作用是通过STAT3的靶向泛素化来控制骨细胞中的RANKL。激活MYD88通路可减少骨细胞富集细胞中含有CREB/CBP和FBXL19的分子复合物的形成，同时减少CREB/CBP的泛素化。同样，它减少了PDLIM2与STAT3的相互作用，减少了STAT3的泛素化。这些结果表明，CREB/CBP和STAT3对其泛素连接酶的相互作用减少是促进细菌炎症骨细胞中RANKL诱导的CREB/CBP和STAT3蛋白稳定性的主要原因。MYD88通路激活后FBXL19和PDLIM2蛋白水平的下调可能是减少这些分子相互作用的潜在机制。因为过表达FBXL19或PDLIM2会抑制骨细胞中的RANKL，所以阻止FBXL19和PDLIM2蛋白的减少或增加这些泛素连接酶的稳定性将是骨细胞中抑制RANKL的一种策略。FBXL19降解受fbxw17介导的泛素化和cbp介导的乙酰化调控gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba．操纵这些FBXL19降解机制可能是抑制骨感染中破骨细胞发生的一种途径。需要揭示PDLIM2降解和mRNA转录的调控机制，以确定通过PDLIM2抑制RANKL的策略。由于MYD88信号激活NF-kB通路，NF-kB p65是PDLIM2的另一个泛素化靶点gydF4y2Ba65gydF4y2Ba在pam3刺激的骨细胞中，pdlim2介导的p65泛素化也可能降低，从而上调促炎基因表达。我们的数据显示，FBXL19和PDLIM2共同调控骨细胞中MYD88下游的RANKL诱导，这表明这些泛素连接酶是骨感染中骨溶解的治疗靶点。gydF4y2Ba

值得注意的是，在骨细胞富集的细胞群中，Pam3激活MYD88通路增加了CREB、CBP和STAT3蛋白在12小时后的稳定性。因为gydF4y2BaRanklgydF4y2BaPam3刺激后8和48小时，CREB, CBP和STAT3的稳定性增加可能与gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba晚期的诱导。相反，CREB和STAT3的磷酸化增加了8小时，这导致它们与gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba增强剂，很可能负责gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba早期的诱导。骨细胞来源的炎症细胞因子(如IL-6)对这些tf的稳定性的旁分泌或自分泌作用需要进行研究，以确定除了MYD88通路之外的信号通路是否分别通过FBXL19和PDLIM2调节CREB/CBP和STAT3的降解。我们的数据显示，单一抑制CREB或STAT3通过抑制剂或siRNA处理可有效抑制pam3诱导gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba表明CREB和STAT3共同调控骨细胞RANKL的转录。有趣的是，Pam3注射量减少了gydF4y2Ba功能gydF4y2Ba这表明OPG抑制与MYD88无关的机制，很可能是在成骨细胞中gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，在骨感染时与骨细胞RANKL协同促进骨溶解。最终，这些通过Pam3识别的诱导RANKL表达的分子机制需要在活细菌刺激的骨细胞中验证。gydF4y2Ba

在gydF4y2BaPggydF4y2Ba-相关牙周炎、T和B细胞是RANKL的潜在来源gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba．然而，未发现明显的牙槽骨丢失恢复gydF4y2BaPggydF4y2Ba这表明来自这些淋巴细胞的RANKL对小鼠破骨细胞的形成不是至关重要的gydF4y2BaPggydF4y2Ba所致牙周炎模型。相比之下，两者gydF4y2BaRag1gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba；gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaRanklgydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠表现出从牙槽骨溶解的显著拯救，从而证实骨细胞是RANKL的主要来源gydF4y2BaPggydF4y2Ba全身的牙周炎。这些发现表明，不管参与牙槽骨丢失的免疫细胞类型是什么，骨细胞是RANKL的主要和直接来源，负责由其驱动的破骨细胞形成gydF4y2BaPggydF4y2Ba感染。重要的是，我们来自rag1缺陷小鼠的数据表明骨细胞中RANKL的诱导与骨细胞中T和B细胞的激活无关gydF4y2BaPggydF4y2Ba牙周炎。研究骨细胞RANKL在结扎诱导的牙周炎模型中破骨细胞生成所需的程度是有意义的gydF4y2BaHgydF4y2Ba17 cells在牙周韧带细胞和成骨细胞中诱导RANKL的表达gydF4y2Ba72gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在此之前,gydF4y2BaPggydF4y2Ba在小鼠和人类中，是否显示了侵入上皮细胞和牙周韧带细胞以刺激炎症反应导致牙周炎gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba．我们的研究表明，骨细胞腔隙-管系统可以避风港gydF4y2BaPggydF4y2Ba组件，并热杀gydF4y2BaPggydF4y2Ba而且gydF4y2BaPggydF4y2Ba培养上清增多gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在骨细胞富集细胞中的表达。这些结果表明gydF4y2BaPggydF4y2Ba-来源的病原体直接与骨细胞相互作用刺激gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba在体内通过TLR2-MYD88途径表达。致病性成分gydF4y2BaPggydF4y2Ba可通过口腔局部血液循环系统到达骨细胞。因此，检查它是否存活将是有趣的gydF4y2BaPggydF4y2Ba侵入并存活于牙槽骨的腔隙-管隙内。作为gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠感染gydF4y2BaPggydF4y2Ba显示牙槽骨丢失和gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba小鼠感染gydF4y2BaPggydF4y2Ba我们认为，细菌PAMPs直接激活牙槽骨骨细胞是牙周骨丢失的病理机制，MYD88通路可能是牙周病的治疗和预防靶点。事实上，在本研究中，MYD88抑制剂治疗阻止了牙槽骨丢失的进展gydF4y2BaPggydF4y2Ba．最终，需要开发骨细胞特异性给药系统，因为全身抑制MYD88会增加宿主对细菌感染的敏感性，削弱宿主免疫系统对细菌的清除gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

虽然我们已经证明了骨细胞MYD88通路在骨感染中的关键作用，但目前的研究存在局限性。最近的报告表明gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba在Ai9/14报告小鼠的骨细胞和成熟成骨细胞中都有活性gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba．然而，之前的研究并没有直接比较gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba-介导的原代骨细胞和成骨细胞之间的靶向基因重组效率。我们发现gydF4y2BaDmp1gydF4y2Ba通过直接比较Ocy和Ob之间MYD88、RANKL和TLR2蛋白的缺失/恢复效率，启动子对骨细胞具有高度特异性。这种差异可能是由于检测灵敏度的差异。Ai9/14小鼠可能对微量的gydF4y2BaCregydF4y2Ba表达不足以删除其他的柔体转基因gydF4y2Ba79gydF4y2Ba．另外,gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba是否可以在靶向结构、靶基因、骨类型和位置或骨化类型依赖的方式中显示骨细胞特异性gydF4y2Ba79gydF4y2Ba．的选择性gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba对于颅骨骨细胞，gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba是最可靠的gydF4y2BaCregydF4y2Ba驱动目前的骨细胞研究涉及破骨细胞和免疫细胞，不像gydF4y2BaSost-CregydF4y2Ba10gydF4y2Ba对分化成破骨细胞、T/B淋巴细胞或髓样细胞的造血祖细胞显示很少或没有脱靶活性。在目前的研究中，1)Ocy对细菌PAMPs的更大的RANKL诱导能力，可以在IDG-SW3细胞中重现(补充图。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)， 2)越大gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba3)骨细胞是骨中最丰富的细胞类型，这一事实可能为骨细胞在骨感染中调节骨溶解起关键作用提供了依据。然而，我们从成骨细胞中分离骨细胞的方法仍然不理想和不完善，从颅骨中分离出的Ocy和Ob群体具有明显的异质性。因此，我们的研究结果可以解释为，骨细胞和成熟骨细胞中的MYD88通路，但主要是骨细胞中的通路，在口腔和颅面区pamps驱动的骨溶解机制中起着重要作用。这一解释得到了数据的支持gydF4y2BaOsteocalcin-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba在Ocy和Ob中缺乏MYD88的小鼠表现出与在oy和Ob中相同的骨溶解抑制gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba；gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠(补充图;gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)．确定骨细胞特异性的未来发展gydF4y2BaCregydF4y2Ba将需要老鼠。可以想象，骨细胞TLR-MYD88-RANKL轴影响骨溶解的程度取决于病原体和骨感染的部位。我们的研究不排除T/B细胞或其他细胞RANKL来源的可能参与，如malpgydF4y2Ba80gydF4y2Ba在细菌引发的骨吸收机制中。重要的是，在CAR细胞、骨骼肌细胞和经皮质血管周细胞的亚群中，MYD88可能被删除/恢复gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba需要在解释我们的发现时加以考虑gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba．尤其值得关注的是，CAR细胞是否是骨感染中破骨细胞诱导的关键RANKL供应者。gydF4y2Ba

总之，我们的研究确定了MYD88通路在骨骼系统中的作用，并揭示了骨细胞是嵌入在骨骼中的细菌传感器，可转化为产生RANKL的炎症细胞。我们还发现，细菌刺激的骨细胞，在某种程度上也可能是细菌刺激的成熟成骨细胞，具有通过RANKL诱导和炎症细胞招募直接和独立触发和发展骨溶解的能力(补充图。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．这些对骨细胞的认识建立了骨细胞作为通过RANKL的破骨细胞发生和骨吸收的中心调节因子。由于骨细胞MYD88通路的激活是细菌感染引起炎症性骨溶解的重要原因，靶向骨细胞中的MYD88信号通路和下游RANKL调控机制将是牙周炎和骨髓炎中骨破坏的一种治疗策略。同样，关节炎患者的骨破坏是由MYD88突变引起的gydF4y2Ba82gydF4y2Ba也许能从同样的治疗策略中获益。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

研究批准gydF4y2Ba

所有的突变小鼠系和实验程序都得到了印第安纳大学医学院动物保护和使用机构委员会(IACUC)和印第安纳大学生物安全机构委员会(IBC)的批准。gydF4y2Ba

老鼠gydF4y2Ba

C57BL / 6 J,gydF4y2BaMyd88gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba，gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba，gydF4y2BaRanklgydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1r1gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba，gydF4y2BaRag1gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba，gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba，gydF4y2BaTlr2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba,gydF4y2BaTlr4gydF4y2Balps-de / lps-delgydF4y2Ba，gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2Ba，gydF4y2BaOsteocalcin-CregydF4y2Ba小鼠来自Jackson实验室(Bar Harbor, ME, USA)。gydF4y2BaTlr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠由博士提供。罗哈斯，哈丁和布姆。所有小鼠均在无特异性病原体(SPF)条件下饲养gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMyd88gydF4y2Balsl / lslgydF4y2Ba在SPF级条件下，用蒸压饲料和酸化水(pH值2.3至2.8)饲养和饲养的小鼠。gydF4y2Ba

CregydF4y2Ba重组分析gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba基因组DNA PCR法gydF4y2Ba

使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA。用10ng的DNA进行PCR反应。gydF4y2Ba

颅骨注射Pam3CSK4，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba有限合伙人,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba英国网球协会,gydF4y2BaPggydF4y2Ba有限合伙人gydF4y2Ba

Pam3CSK4,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba英国网球协会,gydF4y2BaPggydF4y2Ba将LPS(20µL PBS中100µg /小鼠)每隔一天注射到10 ~ 11周龄小鼠的头颅上，共3次(注射第一天=第1天)，第6天用qPCR检测基因表达。第7天进行显微ct和组织形态测量。第7天用苏木精和伊红(H&E)染色和免疫组化染色检查头颅皮损。超纯LPSgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(20 μ L PBS 100 μ g /小鼠)每隔一天注射2次。第4天用qPCR检测小鼠，第5天用显微ct和组织形态测定法检测小鼠。冠状线和矢状线的交点被用作注射的参考位置。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2BaPggydF4y2Ba文化gydF4y2Ba

PggydF4y2Ba(ATCC 33277)在羊血琼脂板上培养，并进一步在添加酵母提取物(5 g/L)、hemin (5 mg/L)和menadione (50 mg/L)的胰蛋白酶大豆肉汤中生长，在37℃厌氧条件下(AnaeroPack, Mitsubishi)。的密度gydF4y2BaPggydF4y2Ba用600 nm吸光度测定。离心后收集上清，用0.2 μ m过滤器过滤。gydF4y2BaPggydF4y2BaPBS冲洗，70°C热杀1 h，悬浮于上述培养基中。没有直播gydF4y2BaPggydF4y2Ba是通过培养热杀的证实的吗gydF4y2BaPggydF4y2Ba．gydF4y2BaPggydF4y2Ba上清和热杀gydF4y2BaPggydF4y2Ba都是为每次实验准备的。gydF4y2Ba

骷髅头注射活的gydF4y2BaPggydF4y2Ba

PggydF4y2Ba(2 × 10)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba将20 μ L生长培养基CFU /小鼠)每日注射于10 ~ 11周龄小鼠颅骨，共5次(注射第一天=第1天)，第6天分析骨组织。gydF4y2Ba

活菌口服接种gydF4y2BaPggydF4y2Ba

10 ~ 11周龄小鼠在饮用水中预先加入磺胺嘧啶(200 mg磺胺甲恶唑和40 mg甲氧苄啶/5 mL) 7天，以减少口腔共生菌群数量。用不含硫代硫醚的水间隔3天(第10天)，2 × 10gydF4y2Ba9gydF4y2BaCFU的gydF4y2BaPggydF4y2Ba(ATCC 33277)以50µL的2%羧甲基纤维素(CMC)/PBS接种于麻醉小鼠的整个牙龈组织，每隔一天用24 G可延展性喂针接种5次。对照组小鼠单独接种培养液(2% CMC)。小鼠采用免疫荧光染色检测agydF4y2BaPggydF4y2Ba在末次接种后第3天，qPCR和组织形态测定法在第7天，显微ct在第42天。gydF4y2Ba

MicroCT分析gydF4y2Ba

颅骨骨组织(第7天Pam3CSK4，gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba英国网球协会,gydF4y2BaPggydF4y2Ba有限合伙人。第6天直播gydF4y2BaPggydF4y2Ba．第五天gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLPS)用4%多聚甲醛(PFA)固定24 h，用70%乙醇浸泡，Skyscan1176 (Bruker)扫描，x射线能量50 kV，像素大小8.43 μm，旋转步长0.3°，曝光时间926 ms。扫描数据用NRecon软件(Bruker)重构，动态范围为0 ~ 0.18。利用CTVox软件(Bruker)基于体绘制方法生成三维图像。用ImageJ (NIH)测量以冠状线和矢状线相交为中心的6 × 6mm头颅区域的骨侵蚀面积(约713片)，以像素为单位除以像素总数。采用CTAnalyser (Bruker)在6 × 6 mm面积上定量测定骨面/骨体积(BS/BV)和骨体积/组织体积(BV/TV)，阈值为48。上颌骨(末次接种后42 d)用4% PFA/PBS固定24 h，动态范围为0 ~ 0.22的Skyscan1176扫描。使用DataViewer (Bruker)创建3D图像，并将咬合平面与横平面对齐。利用CTAnalyser重建二维图像，测量右上颌三颗磨牙12个牙尖下方牙槽骨嵴(ABC)与牙釉质交界处(CEJ)的总距离。采用右上颌骨第二磨牙下两颊根间牙槽骨10片定量BV/TV，阈值为65。在活体显微ct扫描颌骨时，小鼠用异氟醚麻醉，使用CTAnalyser测量CEJ-ABC的距离，旋转步长0.6°，阈值为40。gydF4y2Ba

H&E染色及组织形态学分析gydF4y2Ba

颅骨和上颌用4% PFA固定24 h, EDTA (0.5 M, pH 7.2)脱钙，石蜡包埋。冠状面切割6个μm切片进行H&E和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。采用Bioquant Osteo软件盲法测定右上颌第一磨牙下冠状线与矢状线交点前后3mm的头状骨表面或近中根与颊根之间牙槽骨表面的破骨细胞/骨面(N.Oc/BS)和破骨细胞/骨面(Oc.S/BS)数量。gydF4y2Ba

免疫组化和免疫荧光染色gydF4y2Ba

石蜡切片用10 μg/mL的蛋白酶K (Gold Biotechnology)处理10 min, 37°C提取抗原，用3% H淬灭内源性过氧化物酶gydF4y2Ba2 gydF4y2BaOgydF4y2Ba2 gydF4y2Ba/ PBS的解决方案。用含有二抗的2%血清阻断后，切片用抗MYD88 (LS-C357983, LSBio)、TLR2 (NB100-56720, Novus)、TLR4 (ab13867, Abcam)、F4/80(克隆A3-1, Bio-Rad)、Ly-6G (sc-53515, Santa Cruz Biotechnology)或的抗体孵育gydF4y2BaPggydF4y2Ba(DMAB9447，创意诊断)在4°C过夜。M.O.M工具箱(矢量实验室)被用于反gydF4y2BaPggydF4y2Ba抗体PBS冲洗后，切片与生物素化二抗(载体实验室)在室温下孵育60分钟，并用vecastain®Elite ABC-HRP Kit(载体实验室)处理。用impact DAB(矢量实验室)显色后，切片用甲基绿或苏木精反染。为gydF4y2BaPggydF4y2Ba成分检测采用Alexa Fluor 488偶联二抗(Invitrogen)， DAPI反染色(Thermo Fisher)。gydF4y2Ba

成骨细胞和骨细胞富集细胞群的分离gydF4y2Ba

取10 ~ 11周龄C57BL/ 6j雄性小鼠的颅骨，无菌解剖，切成3 × 3 mm的小块。汇集的骨块按参考文献描述的顺序消化。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba．使用I型胶原酶(300 U/mL, Worthington生化)在α-MEM (Thermo Fisher)和EDTA (5 mM, pH = 7.4;ACROS有机)在无钙和镁汉克平衡盐溶液(HBSS, Thermo Fisher)中添加1%的牛血清白蛋白(研究产品国际)。所有消化步骤都在3.5 mL溶液中进行，6孔板在5% CO条件下以170 RPM旋转gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba37°C。每次消化后，收集消化液，骨块用HBSS冲洗2次，然后将消化液和HBSS结合在一起作为单一组分(F)。将组合的细胞悬液在500 g下旋转5分钟，重新悬浮在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(P/S)的α-MEM中(Thermo Fisher)，然后每个组分培养48 h。为了进行机制研究，使用CD45 +细胞耗尽试剂盒(Invitrogen)从F1 - 4细胞和F6 - 9细胞中取出造血细胞。为了更好地将骨细胞与成骨细胞分离，我们将F5排除在实验之外。从F1-4和F6-9中纯化的cd45阴性细胞分别被视为成骨细胞富集细胞群(Ob)和成骨细胞富集细胞群(Ocy)。将Ob和Ocy悬浮于α-MEM中，播种于100 mm的培养皿上。48 h后去除非附着的死亡细胞，将Ob和Ocy重种于8孔室载玻片(1 × 10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba每孔细胞)，6孔板(1.0 × 10gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba每孔细胞)或60毫米的培养皿(5.0 × 10gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba细胞)进行进一步的研究，包括Ocy和Ob的验证，比较gydF4y2BaDmp1-CregydF4y2BaOcy与Ob之间的特异性。gydF4y2Ba11 dgydF4y2Ba)，以及对Ocy中RANKL调控机制的研究。Ocy在涂有鼠尾I型胶原蛋白(细胞应用)的培养皿上培养。gydF4y2Ba

免疫荧光染色分析Ocy和Ob中硬化蛋白和角化蛋白的表达gydF4y2Ba

将Ocy和Ob以1 × 10的密度接种在8孔孔孔玻片(康宁)上，玻片上涂有或不涂有I型胶原蛋白gydF4y2Ba4gydF4y2Ba每孔细胞。将细胞用4% PFA在室温PBS中固定10 min，然后用PBS轻洗5 min 3次。在RT条件下用0.2% Triton X-100在PBS中渗透10分钟并用PBS洗涤5分钟三次后，用2% BSA/PBS和2%驴或山羊血清(Sigma-Aldrich)在RT条件下孵育30分钟。抗硬化蛋白抗体(R&D systems, AF1589)或抗角化抗体(Abcam, ab128304)在4℃轻轻摇晃过夜。PBS冲洗后，用Alexa Fluor®594驴抗山羊抗体或Alexa Fluor®594山羊抗兔子抗体(Thermo Fischer)在rt孵育细胞1小时，用正常山羊或兔IgG作阴性对照。用Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, A12379)检测f -肌动蛋白。细胞核用4 '，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。使用BZ-X800显微镜(Keyence，大阪，日本)获得荧光图像。计算硬化蛋白或角化菌阳性细胞的百分比(阳性细胞数除以细胞总数)，并在每个孔的五个随机场中取平均值。gydF4y2Ba

Ob和Ocy的刺激gydF4y2Ba

用Pam3CSK4 (100 ng/mL)、Pam2CSK4 (100 ng/mL)、超纯LPS刺激Ob和OcygydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(100 ng/mL)， FLA-ST (100 ng/mL)，或单链RNA (100 ng/mL) (InvivoGen)。gydF4y2Ba

RNA隔离gydF4y2Ba

用RiboZol RNA提取试剂(VWR)提取RNA。以冠状线和矢状线交点为中心的颅骨骨组织(6 × 6 mm)和颅骨皮肤组织(6 × 6 mm)进行RNA提取。取上颌腭侧牙龈组织(1 × 3mm)和上颌颌骨组织(包括磨牙)进行RNA提取。去除软组织后，将颅骨和颌骨组织快速冷冻在液氮中，然后使用组织粉碎机(Cellcrusher Limited)粉碎成粉末。龈组织用组织研磨机(Thermo Fisher)均质。用移液法将Ob和Ocy均质。gydF4y2Ba

逆转录-定量PCR (qPCR)分析gydF4y2Ba

总RNA用Ribozol (VWR)分离，1µg RNA用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies)逆转录。qPCR使用PowerUp SYBR Green主mix进行，并使用QuantStudio设计分析软件(Thermo Fisher)进行分析。本研究使用的qPCR引物列在补充表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．用相对标准曲线法计算基因的相对表达量。的表达水平归一化gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba除了图9I和9m，其中bygydF4y2Baβ肌动蛋白gydF4y2Ba用于归一化。gydF4y2Ba

体外破骨细胞发生gydF4y2Ba

从10到12周大的股骨和胫骨上采集骨髓细胞gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠。用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞(eBioscience)后，骨髓细胞在添加10%胎牛血清和P/S的α-MEM培养皿中孵育3 h，使基质细胞粘附在培养皿上。收集非贴壁细胞，接种于10 cm培养皿中，在M-CSF (25 ng/mL, PeproTech)存在下培养2天，获得骨髓来源的M-CSF依赖性巨噬细胞(BMMs)作为破骨细胞前体细胞。α-MEM中添加10% FBS和P/S的Ob和Ocy在48孔板上以2.0 × 10的密度培养gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba细胞/孔培养24 h后，以2.0 × 10的密度播种BMMsgydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞/。8 h后，用100ng /mL Pam3CSK4或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba25 ng/mL M-CSF存在的LPS(第1天)。含有M-CSF的培养基每48小时更换一次，Pam3CSK4或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba每24 h向培养物中添加LPS。用TRAP染色试剂盒(Sigma-Aldrich)观察TRAP阳性(+)细胞，并在第7天将超过3个核的TRAP +细胞计数为破骨细胞(TRAP + MNCs)。gydF4y2Ba

Ocy的抑制剂治疗gydF4y2Ba

U0126、SP600125、SB203580 (Cell Signaling Technology, CST)、BMS-345541 (Sigma-Aldrich)、666-15、C188-9、STAT5-IN-1、T-5224、CADD522、H-89 (Med Chem Express)和T6167923 (Aobious)被用于阻断特定的分子或激酶。环己酰亚胺(APExBIO)用于阻断蛋白质合成。所有抑制剂在TLR激动剂刺激前2 h加入。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

用冰冷的PBS清洗细胞，然后用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P8340, Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制剂(P0044和P5726, Sigma-Aldrich)的NP-40裂解缓冲液(150 mM NaCl, 1% NP-40, 25 mM Tris-HCl (pH7.4)， 5 mM EDTA, 10%甘油，2.5 mM焦磷酸钠，1 mM β-甘油磷酸)溶解细胞。用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher)测定蛋白质浓度。蛋白质在Laemmli缓冲液中煮5分钟。在7.5或10%的聚丙烯酰胺凝胶上分离10到15微克蛋白质，转移到硝化纤维素膜上进行Western blotting分析。在含有t吐温-20的tris缓冲盐水溶液中用5%脱脂脱脂牛奶阻塞后，用含有一抗的Can Get Signal溶液(TOYOBO)在4℃下孵育膜，然后用HRP偶联二抗(CST)孵育。使用SuperSignal West Dura或Femto化学发光衬底(Thermo Fisher)检测波段，并使用Celvin S 320+化学发光成像仪(Biostep)进行可视化。为了进行定量比较，样本来自同一实验，并并行处理印迹。本研究中使用的一抗列于补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

IDG-SW3细胞与慢病毒的转导gydF4y2Ba

IDG-SW3细胞(由印第安纳大学Lynda Bonewald提供)在33岁时培养gydF4y2BaogydF4y2BaC存在IFN-γ (50 U/mL, Gibco)。含有慢病毒的老鼠gydF4y2BaFbxl19gydF4y2Ba、鼠标gydF4y2BaPdlim2gydF4y2Ba、鼠标gydF4y2BaFbxl19gydF4y2BashRNA，也就是老鼠gydF4y2BaPdlim2gydF4y2BashRNA和阴性对照慢病毒购自GeneCopoeia。1.0 × 10gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba将IDG-SW3细胞接种于涂有鼠尾I型胶原蛋白的60 mm培养皿上，在聚苯醚(8µg/mL)存在下，以5倍感染倍数(MOI)感染慢病毒。72h后开始嘌呤霉素(5µg/mL)筛选。对嘌呤霉素耐药的IDG-SW3细胞在37岁时扩增培养gydF4y2BaogydF4y2BaC在缺乏IFN-γ的情况下培养28天，使其分化成成熟的骨细胞样细胞，然后用Pam3CSK4刺激。gydF4y2Ba

siRNA转染到MLO-Y4细胞gydF4y2Ba

MLO-Y4细胞(由印第安纳大学的Lynda Bonewald提供)被植入6孔板上，涂有鼠尾I型胶原蛋白(5 × 10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba并在添加2.5%胎牛血清、2.5%犊牛血清和1% P/S的α-MEM中培养，在37℃、5% CO2条件下培养。使用TransIT-X2®动态传递系统(Mirus)转染sirna(每个25 nM)。24 h后更换无抗生素培养基。将TransIT-X2中的sirna复合体或对照sirna添加到培养基中。siRNA转染48小时后，收集细胞进行qPCR分析。gydF4y2Ba

Immuno-coprecipitationgydF4y2Ba

细胞用冰冷的PBS洗涤两次，用NP-40裂解缓冲液裂解。用A/ g - plus -琼脂糖蛋白(Santa Cruz Biotechnology)预清后，取300µg总蛋白与1µg抗cbp抗体(#7389,CST)、抗creb抗体(#9197,CST)、抗stat3抗体(#12640,CST) 4℃孵育过夜，再与20µL蛋白A/ g - plus -琼脂糖蛋白孵育3 h。将沉淀的琼脂糖用裂解缓冲液洗涤三次后，再悬浮于Laemmli缓冲液中煮5分钟。样品经SDS-PAGE后进行Western blotting。gydF4y2Ba

用核酸酶(CUT & RUN)法在靶下裂解并释放gydF4y2Ba

所有步骤都按照制造商的方案(CUT & RUN检测试剂盒，CST)进行。简单地说，2 × 10gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba将Ocy细胞重新悬浮在洗涤液中(20 mM HEPES-NaOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM亚精胺和蛋白酶抑制剂鸡尾酒)，加入豆状蛋白a磁珠，然后在室温下旋转10分钟。细胞珠偶联物重悬于200µL含2µg抗cbp (#7389, CST)、抗creb (#9197, CST)、抗stat3 (#12640, CST)、抗crtc2 (MAB6338, R&D)一抗或兔IgG (# 66362, CST)的洋地黄苷缓冲液(2.5%洋地黄苷溶液洗涤缓冲液)中，4℃旋转过夜，再悬于250µL抗体缓冲液和7.5µL的pago - mnase酶(# 57813,CST)中，4℃旋转1 h。用洋地黄苷缓冲液洗涤后，将含有CaCl的150µL洋地黄苷缓冲液冷冻gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba加入150 μ L含5 nggydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba用于样品归一化的插入DNA。37°C孵育15分钟后，样品在16000 g下4°C离心2分钟。将试管放在磁架上，然后收集上清。使用DNA纯化缓冲液和自旋柱(#14209,CST)纯化DNA。用补充表中的引物进行qPCRgydF4y2Ba3 gydF4y2Ba来量化DNA的含量gydF4y2BaRanklgydF4y2Ba启动子和增强子区域。使用%输入法计算每个抗体的数据，并表示为相对于同型对照(兔IgG)的倍数富集。gydF4y2Ba

ELISAgydF4y2Ba

用小鼠sRANKL预包被ELISA试剂盒(Biogems)测定细胞培养上清液中可溶性RANKL水平。荧光强度用SpectroMax i3采集，用SoftMax Pro6 (Molecular Devices)分析。gydF4y2Ba

体内给药MYD88抑制剂gydF4y2Ba

从最后一天开始，每隔一天给小鼠腹腔注射T6167923 (40 mg/kg)gydF4y2BaPggydF4y2Ba接种直到分析那天。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

双尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-test用于比较两组之间的均值。采用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验来比较三个或更多组之间的平均数。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的。采用GraphPad Prism软件进行统计分析。对男性和女性组进行独立分析，以检测性别差异。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

关于研究设计的进一步信息可在gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba