双亲性cpg疫苗接种可在小鼠和非人类灵长类动物中诱导强烈的淋巴结激活和COVID-19免疫gydF4y2Ba

2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行不断演变，导致全球卫生持续面临挑战，尽管广泛使用了有效疫苗，但全球范围内的感染浪潮仍推动了显著的发病率和死亡率gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．随着病毒传染性的增加，引起关注的病毒变异(VOC)的连续出现gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}，以及能够部分逃脱中和抗体的突变gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}已被证明是成功控制病毒传播的重大挑战。虽然目前批准的疫苗继续提供预防住院和严重疾病的宝贵保护，但尽管疫苗接种覆盖率很高，但仍观察到社区病毒传播率很高gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}．值得注意的是，尽管有证据表明疫苗诱导的中和抗体滴度可能迅速下降，并且观察到对近期VOC的活性降低，但严重疾病的预防似乎持续存在gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．因此，中和抗体滴度被认为是批准疫苗保护的主要相关因素gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}在没有消毒免疫的情况下，对疾病最坏结果的有效长期保护可能依赖于强健的记忆B和交叉反应性T细胞反应，它们能够快速重新激活，以遏制新生的病毒感染。促进具有这些免疫特征的反应的疫苗可以改善患者的预后，同时还可以防止由于增加暴露于自然人畜共患宿主而导致的未来冠状病毒病原体的出现。gydF4y2Ba

我们之前报道了ELI-005的开发，这是一种蛋白亚单位疫苗，将Spike受体结合结构域(RBD)蛋白与淋巴结靶向TLR-9激动剂AMP-CpG结合，由与CpG DNA结合的二酰基脂质组成gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．RBD免疫原包含体液免疫和细胞免疫的靶点gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba分子大小(34 kDa)预测皮下给药后淋巴结积聚gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}．传统的低分子量(<20 kDa)疫苗佐剂在外周给药后很容易被吸收到循环血液中，amp修饰已知可通过与注射部位组织白蛋白的非共价结合促进淋巴结积累gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．因此，amp引导的疫苗成分向引流淋巴结的生物分布可以显著改善向关键免疫细胞的传递，并参与协调免疫反应的大小和质量的机制，同时限制暴露于免疫无关的部位或耐受通过血液清除的制剂优先到达的部位。此前，这种方法在ELI-005中的应用促进了高效的rbd特异性T细胞和中和抗体反应，在小鼠中采用三剂量免疫方案，证明淋巴结靶向疫苗有可能产生细胞和体液反应的诱人平衡免疫gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在这里，我们描述了ELI-005在小鼠中的进一步评估，包括开发一种简化的启动-促进方案，以快速诱导voc定向的交叉反应性抗体滴度以及高效的T细胞反应。通过比较可溶性和AMP-CpG，我们探讨了引流淋巴结中先天性免疫反应激活的差异潜在机制及其对佐剂有效靶向淋巴结的依赖。我们还评估了ELI-005在恒河猴中的T细胞和体液免疫原性，作为人类受试者潜在安全性和活性的预测模型。gydF4y2Ba

AMP-CpG促进小鼠强烈而持久的细胞和体液抗sars - cov -2反应gydF4y2Ba

先前对ELI-005的评估表明，在小鼠三剂量免疫方案后，ELI-005可有效诱导rbd特异性免疫，其特征为高频外周和组织常驻T细胞反应，以及持久的中和抗体滴度gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．为了提高ELI-005免疫用于潜在临床转导的可行性，我们评估了在第0周和第2周使用10µg Wuhan-Hu-1 (WH-01) SARS-CoV-2 Spike RBD混合CpG DNA佐剂的初始-增强方案。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．为了评估amp修饰对诱导免疫应答的大小和寿命的重要性，用1 nmol AMP-CpG(由与CpG-7909 DNA结合的二酰基脂质组成)或未修饰的可溶性CpG类似物给RBD抗原。在增加剂量后一周检测细胞和体液反应，以表征急性反应，并在32周内纵向评估长期免疫持久性，如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．与可溶性CpG处理的小鼠相比，用ELI-005免疫的小鼠，包括AMP-CpG，脾脏IFNγ斑点形成细胞(SFCs)的数量增加了12倍。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．同样，与可溶性CpG接种相比，AMP-CpG诱导显著增加了rbd特异性细胞因子产生CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在体外直接使用重叠的RBD肽刺激后，外周血中的T细胞增加(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．CD4评估gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外周血中的T细胞表现出类似的反应层次，仅AMP-CpG免疫诱导rbd特异性细胞因子的频率显著增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．在CD8中也观察到类似的趋势gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从灌注的肺组织中分离出的T细胞，这是常驻T细胞免疫的一个重要部位，有助于早期发现和调解新生病毒感染(图。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)．考虑到AMP-CpG在初始-增强方案后促进显著增强的峰值免疫反应的强度，以及长寿命免疫保护的重要性，对免疫原性进行了长达32周的纵向测量。AMP-CpG免疫小鼠的循环rbd特异性CD8水平较高gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞因子gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在整个评估期间，与可溶性CpG或mock免疫的动物相比(图2)。gydF4y2Ba1 g hgydF4y2Ba)．总之，这些结果证明了ELI-005启动-增强免疫的效力和AMP-CpG在促进多种组织中显著增强和持久的细胞免疫的关键作用，这对潜在的预防性保护或调节疾病严重程度至关重要。gydF4y2Ba

体液反应的长期评估显示，可溶性和AMP-CpG免疫组在prime-boost免疫后血清转化迅速。针对免疫抗原WH-01 RBD和Delta RBD的血清IgG抗体滴度在加强免疫后不久达到峰值，并在本研究期间保持在高水平(图2)。gydF4y2Ba1 i, jgydF4y2Ba)．总的来说，这些数据表明，与AMP-CpG佐剂的ELI-005产生了有效的交叉反应性体液免疫反应，并长期保持在显著水平。gydF4y2Ba

AMP-CpG诱导T细胞记忆反应，在抗原再次暴露时迅速扩大gydF4y2Ba

循环的rbd特异性T细胞在增强后的持续存在表明ELI-005促进了持久记忆T细胞的发育。对这种长寿命T细胞群的分析显示，循环rbd特异性四聚体的数量显著增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba带有CD44的细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD62LgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8的中央记忆表型gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。AMP-CpG疫苗诱导的应答比可溶性CpG比较组大2.5倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，这表明效应T细胞在未来接触SARS-CoV-2时可能会更快地扩张。因此，我们在增强后17周皮下注射10µg WH-01 RBD后，研究了抗原再暴露后的回忆反应。7天后分析的循环血液中的回忆反应证实了rbd特异性CD8的快速扩增gydF4y2Ba^+gydF4y2BaELI-005免疫动物中的T细胞(14倍，从攻击前的1.9%到召回后的26.8%，图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．相比之下，可溶性CpG免疫小鼠的回忆反应显著降低，表明AMP-CpG免疫动物的长期记忆反应扩展具有实质性优势。gydF4y2Ba

考虑到在刺激后17周观察到的强大T细胞回忆反应，在刺激后30周，另一组动物被召回。CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba用10µg皮下WH-01 RBD抗原在召回前和召回后7天测量T细胞反应。在AMP-CpG免疫的动物外周血中，产生多功能细胞因子CD8的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba攻毒后T细胞分别增加5倍至32%和近3倍至8.5%(图。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba)．而CD8只有2.3%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba1.3%的CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba显示细胞因子的T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba可溶性CpG组表型。值得注意的是，长期CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在AMP-CpG免疫32周后，即使在它们被召回后，应答仍然高于可溶性CpG组的应答水平。gydF4y2Ba

分析了对SARS-CoV-2进入点和全身保护重要的组织中的细胞免疫反应。在第32周WH-01 RBD攻毒后7天，对免疫小鼠灌注的肺组织和脾脏进行分析。原AMP-CpG免疫动物的抗原召回诱导大量肺常驻T细胞分泌多功能细胞因子。在这些动物中，37%的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图;gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)和12%的CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图;gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)分泌细胞因子，而可溶性CpG处理的小鼠分别为14%和<2%。在脾脏中也观察到类似的趋势，AMP-CpG免疫产生的平均频率接近2500 IFNγ SFC / 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba每10个脾细胞反对<100个IFNγ SFCgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba可溶性CpG组脾细胞。这些数据表明，amp - cpg辅助的ELI-005产生了强大而持久的T细胞记忆群，在再次暴露于SARS-CoV-2抗原后，这些T细胞记忆群可以迅速而有效地扩大，在免疫监测和疾病控制的重要位点提供强大的长期细胞免疫。在回忆后7天，体液反应没有显示出血清滴度的增加，这表明抗体回忆反应可能滞后于T细胞(补充图)。gydF4y2BaS1a bgydF4y2Ba)．RBD的鼻内刺激也导致RBD特异性细胞因子产生CD8水平的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba灌注肺样本中的T细胞表明，疫苗诱导的反应可能在病毒进入部位的局部抗原暴露后被有力地召回(补充图)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

ELI-005在长时间内高度稳定gydF4y2Ba

先前的数据证明了eli -005诱导免疫的效力和持久性。然而，支持大规模免疫运动的全球疫苗分发需要在接近环境温度下的稳定性，而不依赖于超低温储存供应链。为了检验ELI-005的稳定性，进行了一项免疫原性研究，在给药前将配制好的疫苗剂量在普通冰箱温度(4°C)下储存2-4周或在室温(22°C)下储存3天。第二次免疫一周后，评估动物的细胞和体液免疫反应。产生CD8的细胞因子gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外周血和肺中的T细胞以及血清抗体滴度显示出与图中观察到的几乎相同的趋势。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba注射前新鲜配制剂量(补充图。gydF4y2BaS3a-egydF4y2Ba)．这表明ELI-005有可能在储存条件下保持免疫原性，从而实现有效的全球分销，而无需昂贵和不切实际的物流需求。gydF4y2Ba

AMP-CpG在引流淋巴结中刺激免疫编排的全面转录编程gydF4y2Ba

ELI-005增强的免疫原性与过去观察到的AMP-CpG在体内输送到引流淋巴结的改善有关gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．为了进一步探索由此产生的免疫生物学，在使用纳米线引流淋巴结时评估了568个免疫相关基因转录本的综合小组。将WH-01 RBD与可溶性或AMP-CpG混合免疫小鼠一次，并评估引流腹股沟淋巴结在指定时间点对基因转录的差异调节(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．用AMP-CpG处理的小鼠早在免疫后2小时就表现出急性和显著的炎症趋化因子mRNA上调(补充图。gydF4y2BaS4a-cgydF4y2Ba),包括gydF4y2BaCcl3gydF4y2Ba(MIP-1α),gydF4y2BaCcl12gydF4y2Ba(MCP-5)和gydF4y2BaCxcl10gydF4y2Ba(IP-10)，是单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)的重要化学引诱剂。这一趋势持续到6小时，当额外的趋化因子gydF4y2BaCcl7gydF4y2Ba(MCP-3)和gydF4y2BaCcl9gydF4y2Ba(MIP-1γ)被检测到，这可能增强了专业APCs向淋巴结的趋化募集(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS4d egydF4y2Ba)．相比之下，可溶性CpG处理的小鼠显示出非常有限的趋化因子转录谱仅限于gydF4y2BaCcl12gydF4y2Ba(MCP-5)。AMP-CpG处理的淋巴结在24小时内表现出全面的转录激活，反映了对下游适应性免疫原性至关重要的强大先天免疫活性的多个轴(图。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)．特别感兴趣的是转录特征，表明apc的涌入，为病原体识别做好了准备(例如，gydF4y2BaTlr3/4/9gydF4y2Ba，gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba(细胞质PRRs)，抗原处理和呈递(如组织蛋白酶，gydF4y2BaTap1gydF4y2Ba，gydF4y2Baβ2米gydF4y2Ba)和共刺激(例如，gydF4y2BaCd40gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd86gydF4y2Ba)．淋巴结中先天免疫细胞募集和激活的转录证据进一步与上调的炎症相关(例如，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba)和抗病毒药物(例如:gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba， IRFs)过程提示这些通路在amp - cpg驱动的急性免疫激活中的潜在作用。相比之下，可溶性CpG在淋巴结中诱导的转录变化很小，这与先前的证据一致，表明在体内淋巴结堆积不良，免疫原性降低。免疫后72 h的评估显示，可溶性cpg介导的转录变化出现峰值，主要由B细胞募集和激活指标主导(例如，gydF4y2BaCd19gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd79agydF4y2Ba，gydF4y2BaBtkgydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2BaS4f ggydF4y2Ba)．相反，AMP-CpG免疫的淋巴结在这个时间点显示出最小的B细胞相关转录模式。相反，分析显示了模式识别和趋化因子编码转录水平下降的证据，但抗原呈递上调和炎症通路的持续特征与专业apc的淋巴结动员一致，以协调下游适应性免疫。总的来说，这些数据表明了可溶性和amp - cpg诱导的转录编程之间的显著对比。这证明了amp修饰对影响naïve淋巴结转化为高度炎症和抗病毒生态位的至关重要，使APCs能够检测、处理和向适应性免疫系统呈递抗原，最终形成强大的下游适应性免疫。gydF4y2Ba

AMP-CpG诱导淋巴结蛋白组和细胞先天免疫反应的强烈急性激活gydF4y2Ba

鉴于amp - cpg介导的淋巴结转录重编程的证据，我们进一步描述了淋巴结蛋白质组学环境和免疫细胞组成，以进一步研究疫苗接种后诱导适应性免疫的关键机制。为此，我们采用了两种方法:首先，采用多重蛋白质组学方法检测可溶性或AMP-CpG免疫诱导的炎症蛋白在淋巴结裂解液中的总表达;其次，采用流式细胞术检测淋巴结免疫细胞数量、激活标志物和细胞内细胞因子。在初步免疫后6和24小时收集可溶性或AMP-CpG免疫小鼠的引流淋巴结，并通过Luminex评估裂解物，与仅接受载体模拟注射的动物进行比较(图2)。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)．在6小时可溶性和AMP-CpG免疫诱导了几种蛋白质分析物质的相似增加，包括与先天细胞募集和先天适应性免疫细胞相互作用的空间淋巴结组织相关的趋化因子(IP-10, MCP-1, MIP-1α， MIP-1β;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，补充图。gydF4y2BaS5agydF4y2Ba)．接种后24小时的评估显示，虽然可溶性CpG免疫的应答几乎普遍恢复到基线水平，但AMP-CpG诱导的应答持续存在，并扩大到包括许多与先天细胞介导的适应性免疫协调相关的因素(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2BaS5bgydF4y2Ba)．AMP-CpG免疫导致几乎所有测试分析物的全面稳定升高，包括生长因子、th1相关的促炎细胞因子、Th2和调节细胞因子、趋化因子、炎性体相关细胞因子和I型干扰素。鉴于观察到AMP-CpG诱导强烈的淋巴结促炎环境，我们进一步评估了各种免疫细胞在初次免疫后6、24和48小时的淋巴结中协调这一过程的重要性。gydF4y2Ba4 c ggydF4y2Ba、折线图、补充图。gydF4y2BaS5c-ggydF4y2Ba)．24 h流式细胞仪分析(补充图;gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)显示AMP-CpG，而非可溶性CpG，显著增加了所有分析的固有细胞系的总数，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、dc和NK细胞。值得注意的是，在AMP-CpG免疫的动物中，单核细胞和中性粒细胞的数量在24小时达到峰值，随后下降，这与它们在急性反应中的作用一致，而巨噬细胞、dc和NK细胞的数量在48小时继续增加。重要的是，虽然可溶性CpG免疫可导致巨噬细胞、dc和NK细胞的总淋巴结群的相似升高，但AMP-CpG普遍促进了先天性细胞激活状态的显著增强，这由产生多种关键细胞因子(IFNγ、IFNβ、IL-1β、IL-6、IL-12)的淋巴结居住细胞的数量和24小时CD86表面表达的升高所表明(图2)。gydF4y2Ba4 c ggydF4y2Ba、热图、补充图gydF4y2BaS5c-ggydF4y2Ba)．结合观察到的淋巴结蛋白质组学数据，这些数据表明了amp修饰在体内CpG DNA使淋巴结转运和强大的先天免疫激活的重要作用。gydF4y2Ba

通过观察干扰素β的诱导，干扰素反应的强烈转录特征，以及AMP-CpG免疫后所有主要先天免疫细胞系在淋巴结免疫反应中的明显参与，我们假设激活可能部分通过刺激I型干扰素抗病毒反应途径进行。为了研究这一信号级联在AMP-CpG诱导的先天反应中的作用，用IFNAR-1阻断单抗预处理小鼠，以消除IFNα和IFNβ信号转导。免疫小鼠24 h后收集淋巴结进行蛋白质组学分析。当用非活性同型对照抗体预处理的对照组小鼠显示几乎所有测量分析物的升高时，amp - cpg诱导的淋巴结炎症环境被IFNAR-1阻断完全消除(图2)。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2BaS5hgydF4y2Ba)，证实该通路在amp - cpg诱导的免疫激活中起关键作用。gydF4y2Ba

AMP-CpG刺激非人类灵长类动物(NHPs)针对多种VOC的广泛反应性细胞免疫反应gydF4y2Ba

根据ELI-005免疫小鼠后观察到的强大的细胞和体液免疫，我们对NHPs进行了免疫原性评估，以评估人类受试者潜在反应的预测活性。对8只成年雌性恒河猴进行了免疫原性评估(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)， 4-5岁，接种140µg WH-01 RBD与5 mg (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)或10毫克(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)的AMP-CpG，或140µg完整的WH-01刺突蛋白与5 mg AMP-CpG混合(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)。通过对体温、体重、血细胞计数、血清细胞因子测定的纵向监测，安全性评估显示无不良事件或潜在临床风险迹象(补充图)。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba)，以及大致的临床观察，包括监测局部注射部位。在整个研究过程中，收集了外周血单个核细胞(pmcs)、血清和淋巴结细针吸入物(FNA)，用于分析细胞和体液免疫反应(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在加强免疫后的第6周，所有疫苗组的个体动物在体外用wh01 RBD重叠肽(OLPs)刺激后，PBMC中IFNγ SFC的频率显著升高，大多数动物每10只动物中有超过1,000个SFCgydF4y2Ba^6gydF4y2BaPBMC(无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．通过vocs特异性OLP的刺激来评估诱导反应的潜在交叉反应性，与WH-01相比，Beta和Delta OLP刺激的IFNγ SFC频率没有显著差异(图1)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)，这表明eli -005诱导的T细胞反应可能针对VOC序列中保守的表位。通过分析体外刺激后多细胞因子的产生，进一步评估pbmc衍生的T细胞反应。在免疫组中，WH-01 RBD与5 mg AMP-CpG混合在第6周时引起了最强健的外周血T细胞反应，CD8为0.45%gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图;gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba)和0.8%的CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图;gydF4y2Ba5 f, ggydF4y2Ba)被观察到产生IL-2, TNFα， IFNγ，或这些刺激的组合。其他疫苗组的细胞因子水平相对较低gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞反应，细胞因子gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba反应呈持续上升趋势，表明CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞反应在NHPs中比以前在小鼠中观察到的更占优势。gydF4y2Ba

AMP-CpG诱导淋巴结生发中心(GC)的发展，并在NHPs中快速诱导交叉反应中和抗体反应gydF4y2Ba

在第6周，所有疫苗组合诱导了RBD特异性GC B细胞(RBDgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba^+gydF4y2BaBcL6gydF4y2Ba^+gydF4y2Baki - 67gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，与基线水平相比，淋巴结的频率升高(图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．在整个研究过程中，在纵向时间点评估血清中rbd特异性IgG。对WH-01 RBD特异性血清IgG的评估显示，早在初次免疫后的第2周和第4周，所有RBD免疫治疗组的血清转化迅速且几乎普遍(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．在第6周和第8周增强后，所有rbd免疫组的IgG血清浓度进一步增加，第6周的峰值反应相对于基线升高了5000倍。在使用完整Spike蛋白免疫后，观察到类似的IgG反应趋势，这表明RBD和全长Spike与AMP-CpG佐剂联合使用都具有免疫原性。gydF4y2Ba

评估抗体交叉反应，以评估诱导IgG反应识别与VOC驱动近期大流行感染波相关的一组RBD变体的潜力。AMP-CpG免疫诱导血清IgG反应，具有针对几种主要VOC的广泛交叉反应性。在第6周，在所有rbd免疫组中，Beta或Delta rbd相对于WH-01的rbd特异性IgG血清浓度没有明显下降(图2)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)．IgG对Omicron RBD的反应较强，但相对于WH-01、Beta和Delta有所下降。类似的趋势也出现在用全部Spike免疫原免疫的动物身上。gydF4y2Ba

在所有免疫动物的血清中观察到，在中和ID为第6周时，针对WA1的病毒特异性中和抗体水平一致增加gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba大约比在一组恢复期人类血浆样本中观察到的水平高10倍(图2)。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．第6周针对Delta和Omicron变体的中和抗体反应也相对于基线持续升高，但与针对疫苗免疫原的wa1特异性反应相比有所降低(图)。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba)．然而，这些变异导向的反应，包括对Omicron的特异性反应，始终高于恢复期人类血浆比较物，这表明AMP-CpG疫苗诱导的交叉反应中和反应可能超过人类自然感染通常诱导的水平。gydF4y2Ba

AMP-CpG在NHPs引流淋巴结中诱导强大的促炎转录编程gydF4y2Ba

为了研究AMP-CpG接种的NHPs的信号模式，在基线和免疫后24 h收集淋巴结FNA，使用Nanostring进行免疫应答的转录分析。在跨越多个免疫协调轴的各种基因本体类别中，观察到许多基因转录水平的动态变化(图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．总的来说，44个基因相对于基线有差异表达;其中27个基因在接种后显著上调了至少1.5倍，17个基因下调了至少1.5倍(图2)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．上调的转录本包括参与适应性和先天免疫、APC激活、干扰素信号转导和迁移的基因，而参与T细胞无能和衰竭的基因则被高度下调。值得注意的是,gydF4y2BaCd83gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBatf3gydF4y2Ba这些转录本对于DC激活和抗原交叉呈递CD8很重要gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}，和促炎Th1细胞因子一样被高度诱导，gydF4y2BaIl18gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．AMP疫苗显示出强烈的基因诱导主要涉及干扰素信号，包括gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfnar2gydF4y2Ba．最大的一类上调基因与迁移有关，包括gydF4y2BaCxcl10gydF4y2Ba(IP-10)，对巨噬细胞、T细胞、NK细胞和dc具有趋化作用gydF4y2BaCcl3gydF4y2Ba(MIP-1α)，它在淋巴结中协调T细胞- apc相遇，以增强记忆T细胞的大小gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}．相反，与T细胞无能和衰竭相关的基因被下调，包括gydF4y2BaSiggirgydF4y2Ba抑制TLRs的信号转导，gydF4y2BaIl18r1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIl1r1gydF4y2Ba消极地调节炎症gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．这些结果与在小鼠中收集的结果有显著的相似之处，并进一步证实，在NHPs中使用AMP-CpG免疫诱导促炎环境，以促进适应性免疫，包括T细胞启动和引流淋巴结的激活。gydF4y2Ba

尽管有效疫苗得到了批准和广泛采用，但COVID-19大流行继续导致全球感染浪潮，原因是出现了更多变异gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba以及通过自然感染或免疫获得的相对短暂的消毒免疫gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}．随着病毒变型逐渐发展出与祖先毒株更大的突变偏差，并获得更大的传染性，未来候选疫苗活性的目标可能从通过中和抗体预防病毒感染转变为T细胞介导的预防进展到严重疾病、住院和死亡。虽然目前批准的疫苗显示出中和抗体迅速减少，但T细胞反应可能更持久gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}同时也为目前和未来更广泛的VOC识别提供了潜力gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}．因此，能够促进体液和细胞免疫平衡、提供长期持久性、广泛的交叉反应性病毒识别和回忆时快速记忆再激活的疫苗将是进一步开发的有吸引力的候选疫苗。gydF4y2Ba

因此，ELI-005在小鼠和NHPs中的启动增强免疫诱导了平行T细胞和抗体免疫。NHPs中的抗体反应超过了恢复期人血浆中和多种VOCs的能力。重要的是，仅在两次剂量后就检测到欧米克隆特异性中和反应，这表明其优于目前批准的疫苗，后者已被证明需要第三次剂量才能在人体中诱导类似反应gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}．此外，eli -005在NHPs中诱导的抗体反应伴随着淋巴结GC - B细胞反应的强劲发展，被认为与人类疫苗中延长的记忆B细胞反应相关gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}．这些反应，显示出广泛交叉中和体液识别和持久记忆B细胞反应GC前体诱导的潜力，可能提供具有改善持久性和相关特异性的免疫，以应对病毒进化和快速下降的抗体水平的双重挑战。gydF4y2Ba

有趣的是，在小鼠中观察到的增强后rbd特异性IgG滴度并不能预测NHPs诱导的滴度峰值的强度。然而，以前在小鼠中使用3剂方案导致rbd特异性IgG反应显著升高，与在启动-增强免疫后观察到的NHPs反应更一致gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．因此，prime-boost免疫后小鼠与NHP IgG反应缺乏相关性可能与最佳免疫方案的种特异性差异有关。此外，免疫原优化可能为增强免疫原性提供额外的机会。基于WH-01序列的重组RBD在小鼠体内经常表现出次优的体液免疫原性，这可能通过序列修饰来优化以提高ACE2结合的亲和力和稳定性，或通过免疫原支架来促进多价展示gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba．这种免疫原工程策略是进一步优化疫苗效力的有吸引力的选择，可以很容易地与AMP-CpG结合，通过协同淋巴结免疫激活来提高活性。gydF4y2Ba

eli -005诱导的小鼠T细胞反应在脾脏、外周血和肺中表现出明显的增殖峰值;对系统和病毒进入点的病毒感染的早期检测很重要的部位。重要的是，在收缩时，eli -005诱导的记忆T细胞反应在小鼠中维持了>32周，并在回忆时表现出深刻的扩张。在自然感染和免疫(包括原始SARS冠状病毒)后，在人类受试者中观察到长寿命的抗病毒T细胞反应，感染后T细胞记忆存在数年gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．通过早期病毒识别、立即执行抗病毒效应子功能和快速扩展，这些反应为长期保护免受病毒进展和严重疾病发作提供了关键贡献。与此一致的是，我们观察到小鼠的长期记忆T细胞反应在重新暴露于抗原后迅速扩大到峰值水平。此外，在肺和脾脏中存在这些持久的前哨T细胞群，可能在容易检测到呼吸道病毒进入或新生感染的全身体征的位置提供有效的病毒监测来源。gydF4y2Ba

与小鼠一样，在NHPs中，外周血中有大量ELI-005诱导的T细胞，证实了ELI-005活性转化为预测人类免疫的模型。此外，用WH-01、Beta、Delta和Omicron表位刺激后，观察到广泛的病毒反应性，细胞因子产生水平相似。这与人类rbd特异性T细胞反应的表位定位研究相一致，这些研究表明，虽然病毒变体通常会发生与部分抗体中和相关的点突变，但大多数T细胞特异性表位都保持了，这代表了持久免疫识别的更一致的目标gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在引流淋巴结中有效积累疫苗成分可以有效协调先天免疫机制，控制后续适应性免疫的质量和效力。虽然许多分子佐剂已被证明具有免疫调节活性，但它们在体内的效力往往因暴露于免疫监测和协调的原发部位较差而受到限制gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．相反，从注射部位通过体循环的快速、大小依赖的清除，以及进入传入淋巴的低效被动摄取，导致生物分布远离淋巴结，流向与免疫无关的部位或促进耐受的器官gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．amp修饰已被证明可以通过促进CpG与组织常驻白蛋白的物理结合来克服这一挑战，白蛋白是一种最佳大小(~65 kDa)的伴侣蛋白，可通过淋巴引流而不是毛细血管吸收进行清除gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．在实践中，我们观察到，增强AMP-CpG到淋巴结的传递诱导了局部先天免疫反应的多效性作用，这与下游细胞和体液免疫的显著改善相关。gydF4y2Ba

与小鼠中可溶性CpG的剂量匹配疫苗相比，AMP-CpG在给药后引发了显著的淋巴结转录组重编程。先前的报道证实，免疫后淋巴结中的可溶性CpG水平下降或无法检测到gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．在这里，可溶性CpG对淋巴结转录组明显缺乏影响，而AMP-CpG诱导明显的差异转录水平，其标志是早期和持续的趋化因子上调，随后是增强潜在的抗原呈递、病原体识别、抗病毒反应和APC参与机制，表明先天性免疫的强大募集和协调。在NHP淋巴结中观察到的转录特征显示出类似的模式，这表明在预测人类活动的模型中具有共同的激活机制，尽管与小鼠相比，TLR-9在NHPs中的表达模式更为有限。在小鼠中观察到的转录重编程特征通过蛋白质组分析得到了证实，其中可溶性CpG仅支持有限组趋化因子的短暂增加。相比之下，AMP-CpG诱导的趋化因子水平在早期出现类似的增加，几乎所有被评估的分析物都出现了强劲的增加。通过列举激活和产生细胞因子的免疫细胞系，观察到可溶性和AMP-CpG的进一步分化机制，其中AMP-CpG诱导共刺激标记物表达和细胞因子产生模式与蛋白质组学评估中看到的相似，并表明先天免疫细胞的全面协调以建立淋巴结炎症环境。AMP-CpG诱导APC活性显著增强，以DC和巨噬细胞共刺激和细胞因子产生为标志，对T细胞的最佳激活至关重要。综上所述，这些观察结果为amp修饰增强CpG向淋巴结传递的重要性提供了证据，以实现TLR-9激动在协调先天免疫和适应性免疫方面的免疫调节潜力。gydF4y2Ba

TLR-9与B型CpG DNA(包括CpG-7909)的接触主要被认为诱导B细胞和浆细胞样dc的成熟，相对于其他CpG亚类，其促进I型干扰素产生的能力较弱。gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba)．这与可溶性CpG接种后小鼠淋巴结中IFNβ和干扰素诱导转录物的缺乏一致。然而，在AMP-CpG的情况下，接种小鼠和NHPs后24 h IFNβ和干扰素诱导的转录本显著升高。此外，在小鼠中，通过阻断IFNAR-1，淋巴结炎症蛋白组学环境的发展几乎完全被取消，这表明I型干扰素在amp - cpg介导的淋巴结急性炎症反应协调中起着关键作用。虽然这一观察背后的机制不是本研究的主题，但值得注意的是，A型CpG产生的I型干扰素依赖于回文DNA序列的大分子组装，这些DNA序列通过TLR-9聚类驱动信号转导gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．已知amp修饰的CpG促进插入脂质双分子层密集装饰细胞膜gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}这种模式可能类似于对a型CpG干扰素反应至关重要的自组装结构。我们推测，AMP-CpG修饰内体腔面膜小叶可能有助于TLR-9聚类导致的I型干扰素信号的增强。gydF4y2Ba

尽管有效疫苗在发达国家得到了授权、批准和广泛采用，但由于冷链储存和分配方面的挑战限制了低收入国家的可得性，全球可得性一直很低gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba．全球疫苗覆盖率的提高被认为是朝着限制在疫苗可及性差的人群中社区传播导致的进一步变异出现迈出的重要一步。这些变种，包括最近的Omicron变种，继续延长大流行，推动全球感染浪潮。对暴露于室温或冷藏条件下的ELI-005的评估表明，在没有持续超低温储存的情况下，温度敏感性降低，T和B细胞介导的免疫原性保持在相当的水平。在分发ELI-005疫苗时，可能减少对能源和物流密集的运输基础设施的依赖，从而改善全球疫苗的获取。gydF4y2Ba

总之，这些研究揭示了amp修饰CpG DNA定向淋巴结传递的潜力，从而通过对淋巴结固有免疫的全面编程来诱导免疫原性反应。这种方法在亚单位疫苗开发中的应用提供了一种针对传染病抗原提供平衡、有效和持久的细胞和体液免疫的策略，例如在小鼠和NHPs中验证ELI-005免疫原性。通过与蛋白质亚单位免疫原混合开发简单配方的潜力进一步表明，在大量未满足医疗需求的潜在适应症中快速应用的潜力。gydF4y2Ba

疫苗组件gydF4y2Ba

在小鼠研究中，疫苗由10µg SARS-CoV-2 Spike RBD WH-01蛋白(GenScript, cat# Z03483)，结合1 nmol AMP-CpG-7909 (AMP-CpG, Avecia)或可溶性CpG 7909(可溶性CpG, InvivoGen, tlrl-2006，)组成。模拟治疗组在没有抗原的情况下接受匹配剂量的佐剂，或单独用载体(磷酸盐缓冲盐水，PBS)治疗。抗原再激发剂量包括10µg SARS-CoV-2 Spike RBD WH-01蛋白，双侧皮下注射至尾基底或鼻内。为了测试存储温度条件的实验，将剂量混合并在4°C或室温(22°C)下存储指定时间。在NHP研究中，疫苗由SARS-CoV-2 Spike RBD whi -01蛋白(GenScript;cat# Z03483)或SARS-CoV-2 WH-01尖刺蛋白(Acro生物系统公司，SPN-C5H9)， 140µg与AMP-CpG混合，每剂量5或10 mg。gydF4y2Ba

试剂gydF4y2Ba

对于体外细胞样本的刺激，在SARS-CoV-2 Spike RBD (R319-S591, GenScript)上生成了具有11个氨基酸重叠的15-mers的OLP肽库。由于模块化的OLP池设计，包含VOC突变的序列可以与相应的突变肽交换。gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

动物研究是在新伊比利亚研究中心或查尔斯河加速器和发展实验室批准的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的协议下进行的，遵循联邦、州和地方的动物护理和使用指南。在小鼠研究中，从杰克逊实验室(Bar Harbor, ME)购买6- 8周大的雌性C57BL/6 J小鼠。在第0周和第2周，在小鼠尾巴底部(双侧，各50 μ l)皮下注射所指示的抗原-佐剂组合。在第二次给药后7天，以及抗原激发前1天和激发后7天采集外周血样本(如适用)。在第二次给药后7天或抗原激发后7天收集脾脏和肺组织。在右心室灌注10 mL PBS后采集肺。肺组织物理分离，用含胶原酶D (1 mg/mL)和脱氧核糖核酸酶I (25 U/mL)的RMPI 1640培养基消化。gydF4y2Ba

在NHP研究中，8只来自印度、4-5岁的近亲繁殖雌性恒河猴(gydF4y2Ba解剖gydF4y2Ba)被随机分为3组，每组2或3只动物。所有动物都被安置在新伊比利亚研究中心(新伊比利亚，洛杉矶)。在第0周和第4周，动物在大腿上部接受皮下免疫。在基线和整个研究过程中采集血液样本，并进行pbmc处理。在基线、0、2、6、24和48小时，以及启动剂量后2、4、6和8周收集血清。在第0周和第4周从腹股沟淋巴结收集淋巴结FNAs用于流式细胞术分析淋巴结驻留细胞，在第10周后24小时用于NanoString分析。gydF4y2Ba

ICS测定细胞活化和细胞因子gydF4y2Ba

在小鼠疫苗免疫原性研究中，对TNFα和IFNγ进行了ICS分析。外周血细胞(每次加强剂量后7天收集)和肺白细胞(最后一次加强剂量后收集)在37℃、5% CO2条件下，在brefeldin A (Invitrogen, cat# 00-4506-15)和莫能菌素(BioLegend, cat# 420701)存在下，用0.2µg每孔rbd衍生重叠肽刺激过夜(18-20小时)。活/死固定(水)死细胞染色试剂盒(Invitrogen，目录号:用L34966, 1:100)流式细胞仪检测细胞活力。细胞表面用抗CD4抗体(PE-Cy7，克隆:GK1.5, Invitrogen cat# 25-0041- 82,1:20 0)和CD8a抗体(APC，克隆:53-6.7,eBioscience cat# 17-0081- 83,1:20 0)染色，随后用BD CytoFix/CytoPerm (BD, 554714)固定。细胞进一步用抗IFNγ (PE，克隆:XMG1.2, BD cat# 554412, 1:200)、TNFα (FITC，克隆:MP6-XT22, BD cat# 554418, 1:200)和CD3 (APC-Cy7，克隆:17A2, BD cat# 560590, 1:200)抗体染色。阳性对照为PMA (50 ng/ml)和离子霉素(1µM)，阴性对照为完全培养基加等效体积DMSO。细胞渗透性和固定(Invitrogen，目录号:;00-5523-00)。样本采集采用FACSCanto II (BD)，数据分析采用FlowJo V10软件(BD)。gydF4y2Ba

在小鼠先天免疫反应分析中，对免疫后6-48 h收集的腹股沟淋巴结固定/渗透单细胞悬液(BD, cat# 554714)进行表面激活标记物染色和ICS分析。活/死固定染色(Aqua, Invitrogen, cat# L34966, 1:100)用于排除死细胞。细胞用CD11b (BV605，克隆:M1/70，克隆:101237,1:25 5)，CD11c (BV421，克隆:N418，克隆:生物基因# 117330,1:40)，CD3 (AF700，克隆:17A2，生物基因# 100216,1:100)，CD19 (AF700，克隆:6D5，生物基因# 115528,1:100)，Ly6C (BV650，克隆:HK1.4，生物基因# 128049,1:25 5)，Ly6G (PerCP-Cy5.5，克隆:1A8，生物基因# 127616,1:100)，NKp46 (PE-Dazzle594，克隆:29A1.4，生物基因# 137630,1:15 0)，MHCII (APC-Cy7，克隆:M5/114.15.2，生物基因猫# 107628,1:100)，CD86 (BV785，克隆:gl1，生物基因猫# 105043,1:140)，IFNγ (BV711，克隆:XMG1.2，生物基因猫# 505835,1:50)，IL12p40 (PECy7，克隆:C15.6，生物基因猫# 505210,1:80)，IL1β (PE，克隆:NJTEN3, Invitrogen猫# 12- 7113 - 82,1:30 30)，IL6 (FITC，克隆:MP5-20F3, Invitrogen猫# 11-7061- 82,1:10 0)，IFNβ (APC, ASSAYPRO，猫# 32183-05161 T, 1:6)。样本采集采用BD FACS Symphony，数据分析采用BD FlowJo V10软件。gydF4y2Ba

巨噬细胞定义为CD3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD19gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NKp46gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ Ly6GgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ Ly6CgydF4y2Ba^低gydF4y2Ba；单核细胞定义为CD3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD19gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NKp46gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ Ly6GgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ Ly6CgydF4y2Ba^高gydF4y2Ba；DC定义为CD3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD19gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NKp46gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba；中性粒细胞定义为CD3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD19gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NKp46gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ Ly6CgydF4y2Ba^{地中海gydF4y2Ba}/ Ly6GgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba；NK细胞定义为CD3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NKp46gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba．数据以每个淋巴结随时间变化的总细胞数表示，或以各自细胞因子或表面标记物阳性细胞数的z -score表示。gydF4y2Ba

在NHP研究中，冷冻的pbmc被解冻并放置一夜。10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba将PBMCs/well重悬在添加了抗cd49d单克隆抗体(克隆号:9F10, BD cat# 555502, 1:400)、抗cd28单克隆抗体(克隆号:CD28.2, BD cat# 555726, 1:400)、高尔基抑制剂莫能菌素(Fisher Scientific, cat# NC0176671)和brefeldin A (Fisher Scientific, cat# 50- 111 -9757)的R10培养基中，在37℃下孵育8小时，然后在4℃下维持一夜。第二天，用抗CD4抗体(PE-Cy5.5，克隆:S3.5, Invitrogen公司# MHCD0418, 1:100)、CD8 (AF647，克隆:RPA-T8, BioLegend公司# 344726,1:400)、CD45RA (FITC，克隆:5H9, BD公司# 556626,1:20)、CCR7 (BV650，克隆:G043H7, BioLegend公司# 353234,1:20)和水活/死染料(Invitrogen公司，L34957, 1:200)对细胞进行表面染色，随后用BD CytoFix/CytoPerm (BD, 554714)固定。进一步用抗CD3抗体(APC-Cy7，克隆:SP34-2, BD猫# 557757,1:200)，CD69 (ECD，克隆:TP1.55.3, Beckman Coulter猫# 6607110,1:100)，IFNγ (AF700，克隆:B27, BioLegend猫# 506516,1:400)，IL-2 (BV421，克隆:MQ1-17H12, BioLegend猫# 500328,1:20)，IL-4 (PE，克隆:8D4-8, BioLegend猫# 500704,1:100)，TNFα (BV605，克隆:MAb11, BioLegend猫# 502936,1:20)，IL-17A (PE- cy7，克隆:BL168, BioLegend猫# 512315,1:200)。在BD FACS Symphony上采集固定在1.5%甲醛中的细胞，并用BD FlowJo V10软件分析数据。gydF4y2Ba

小鼠外周血细胞抗原特异性四聚体染色gydF4y2Ba

使用RBD-PE四聚体对小鼠样本进行mhc四聚体染色，用于序列VNFNFNGL(埃默里大学的NIH四聚体核心设施，cat# 54971)，以及抗CD8a (APC，克隆:53-6.7,eBioscience cat# 17-0081- 82,1:20 0)、CD3 (APC- cy7，克隆:17A2, BD cat# 560590, 1:200)、CD44 (PE-Cy7，克隆:IM7, eBioscience cat# 25-0441- 82,1:10 0)和CD62L (FITC，克隆:mel14, eBioscience cat# 11-0621- 82,1:10 0)的抗体。使用活/死固定(水)死细胞染色试剂盒(Invitrogen, cat# L34966)在流式细胞术中评估细胞的活力。细胞被渗透并用转录因子染色缓冲集固定(eBioscience, cat# 00-5523-00)。样本采集采用BD FACSCanto II，数据分析采用BD FlowJo V10软件。gydF4y2Ba

酶联免疫斑点法gydF4y2Ba

在小鼠研究中，收集脾脏并加工成单细胞悬液。红细胞在ACK裂解缓冲液中裂解(Quality Biological Inc.， cat# no.)。118156101)。使用小鼠IFNγ ELISpot试剂盒(MabTech, cat# Q00824-1X20210623DS)按照制造商的指示进行IFNγ elisa试剂盒测定。0.1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba小鼠脾细胞被沉积到每个孔，在37℃和5% CO条件下，每孔用0.2µg rbd衍生重叠肽(GenScript)刺激小鼠脾细胞过夜gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对于NHP研究，elisa试剂盒使用Monkey IFNγ ELISpotPLUS试剂盒(MabTech, cat# 3241M-4HPW)进行检测。用RPMI + 10% FBS在室温下封闭预涂的96孔elisa板2小时。0.2 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba将pmcs镀入每个孔，每孔用0.4 μg rbd衍生的OLPs刺激WH-01、Beta和Delta变体。这些斑点是根据制造商的说明开发的。两种动物模型均以PMA (50 ng/mL)和离子霉素(1µM)为阳性对照，以RPMI + 10% FBS + DMSO为阴性对照。用S6免疫斑点分析仪(CTL)对斑点进行扫描和定量。gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体滴度gydF4y2Ba

elisa法测定血清抗体结合效价。在小鼠研究中，ELISA板被CoV-2 RBD蛋白包被(每孔200 ng;GenScript;cat# Z03483)在4°C过夜。用2%的牛血清白蛋白在室温下预阻塞板2小时。将连续稀释的小鼠血清转移到ELISA板上，rt培养2小时。用洗涤缓冲液冲洗板4次(bilegend;然后用1:2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)结合的兔抗小鼠IgG (Fcγ)二抗(Jackson免疫研究，cat# 315-035-046)在RT下孵育1小时。再次用洗涤缓冲液洗涤四次，然后用3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺在RT下显影10分钟，用1 N硫酸停止反应。用ELISA平板阅读器测定450 nm处的吸光度。在0.5 OD(光密度)的吸光度临界值下测定滴度。 For NHP assays, ELISA plates were coated with 100 ng/well of SARS-CoV-2 RBD antigen. The detection antibody used was horseradish peroxidase (HRP)–conjugated goat anti-human IgG (H + L) (ThermoFisher, cat# SA5–10283) at a 1:2000 dilution. The WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin (anti-RBD IgG High 20/150, NIBSC) was used for reference values. Serum titers were determined at an absorbance cutoff of 0.5 OD and converted into binding antibody units/mL (BAU/mL) using the WHO standard.

用纳米线分析基因转录本gydF4y2Ba

在小鼠研究中，在指定时间点从免疫的C57BL/6 J小鼠中收获腹股沟淋巴结，加工成单细胞悬液，并用RLT缓冲液溶解(Qiagen, cat# 79216)。免疫信号的转录谱是使用568个小鼠免疫应答基因的nCounter小鼠免疫面板生成的(NanoString Technologies)。对于NHP研究，使用nCounter NHP免疫小组的770猕猴免疫反应基因(NanoString Technologies)评估淋巴结FNA。使用nSolver软件v4.0 (NanoString Technologies)评估转录反应，使用ROSALIND软件进行差异基因表达。gydF4y2Ba

小鼠淋巴结蛋白质组学gydF4y2Ba

为测定淋巴结细胞因子/趋化因子含量，动物接种疫苗，免疫后6-48 h采集腹股沟淋巴结。对于ifnar1阻断，在免疫前24小时腹腔注射拮抗单抗(克隆:MAR1-5A3, BioXcell cat# BP0241)或同型对照(克隆:MOPC-21, BioXcell cat# BP0083)。在使用TissueLyser II (Qiagen)均质前，将含有Mini蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche, 53945000)和HALT磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher, 78442)的蛋白提取缓冲液(Invitrogen, EPX-9999-000)添加到完整的淋巴结中。使用Luminex细胞因子和Chemokine试剂盒(EMDMillipore, cat# m巨细胞- 70k和MECY2MAG-73K)分析离心清除的裂解物。gydF4y2Ba

淋巴结FNAs中NHP抗原特异性GC B细胞分析gydF4y2Ba

生物素化RBD蛋白(Acro Biosystems, cat# SPD-C82E9)与荧光色素偶联链霉亲和素APC (BioLegend, cat# 405207)络合生成RBD-四聚体。将FNA的淋巴结细胞与rbd -荧光色素复合物孵育，随后用水活/死染料(Invitrogen, L34957)、抗人IgM (FITC，克隆:G20-127, BD猫# 555782,1:5)、抗人IgG (PE- cy7，克隆:G18-145, BD猫# 561298,1:20)、抗人CD3 (AF700，克隆:SP34-2, BD猫# 557917,1:20)、抗人PD-1 (BV650，克隆:EH12.1, BD猫# 564104,1:20)、抗人CD20 (PE/Dazzle 594，克隆:2H7, BioLegend猫# 302348,1:20)、抗人CD4 (APC-Cy7，克隆:APC-Cy7)OKT4, BioLegend猫# 317418,1:20)和抗人类CXCR5 (PerCP-eF710，克隆:MU5UBEE, ThermoFisher猫# 46-9185- 42,1:20)。使用转录因子染色缓冲组(ThermoFisher, cat# 00-5521-00)固定/渗透细胞，并进一步用抗人Bcl-6 (PE，克隆:7D1, BioLegend cat# 358504, 1:20)和抗人Ki-67 (BV421，克隆:11F6, BioLegend cat# 151208, 1:20)进行染色。样本采集在BD FACS Symphony上进行，数据分析采用BD FlowJo V10软件。gydF4y2Ba

新型冠状病毒血清假病毒中和试验gydF4y2Ba

SARS-CoV-2假病毒检测gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba由Genecopoeia执行。使用了来自Washington 1 (WA1) D614G、Delta和Omicron变体的SARS-CoV-2 spike -假型慢病毒。简单地说，以1.2 × 10的密度播种过表达ACE2和TMPRSS2的HEK293T细胞系gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞/一夜之间。制备热灭活血清样品的3倍连续稀释液，并与50 μ L假病毒混合。混合物在37°C下孵育1小时，然后加入HEK-293T-hACE2细胞。72 h后，裂解细胞，测定萤火虫荧光素酶活性。SARS-CoV-2中和滴度定义为样本稀释时，观察到RLU相对于病毒控制井的平均水平降低50%。从经pcr检测确诊为SARS-CoV-2感染(COVID-19)的患者中恢复的恢复期血清样本和血浆样本来自US Biolab (Rockville, MD)和ALLCELLS (Alameda, CA)。在症状出现后平均30天收集样本。接收所有样品并在−80°C冷冻保存，直到分析。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

两个实验组的比较采用Mann-Whitney检验。对于所有涉及三个或更多组的分析，采用后续的Tukey、Dunnett或Šidák事后分析进行单向方差分析。使用Graphpad Prism v9.4进行统计分析。使用ROSALIND软件进行纳米串统计分析，实现广义线性模型来计算每个基因的折叠变化和p值。使用Benjamini-Hochberg错误发现率方法计算调整后的p值。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba