植物pin -形成的生长素转运体的结构和机制gydF4y2Ba

生长素是一组调节植物几乎所有生长发育过程的激素。吲哚-3-乙酸;pgydF4y2BaKgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}= 4.7)是最突出的生长素，被同义称为“生长素”。IAA提供生长信号，协调植物最复杂的环境反应，包括向光性和向地性gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

植物生长素在植物体内的分布受植物生长素极性转运过程的控制，对植物生长的许多影响取决于植物体内生长素的分布gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba}。这一过程依赖于PIN转运蛋白将生长素输出到细胞外gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}。pin在生理上的重要性往往是严重的gydF4y2Ba销gydF4y2Ba突变表型，这可以模仿生长素外排抑制剂，如市售除草剂萘酞酸gydF4y2Ba^10gydF4y2BaNPA(又称naptalam);pgydF4y2BaKgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}= 4.6)。gydF4y2Ba

PIN蛋白家族是植物界独有的，被归类为大胆汁/亚砷酸盐/核黄素转运蛋白(BART)超家族的一部分，该家族还包括胆汁酸、亚砷酸盐和核黄素的转运蛋白，其成员分布在所有生命领域gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。预计PIN蛋白有十个跨膜螺旋，包括两个由细胞质环分开的五个跨膜螺旋重复序列。标准引脚(PIN1-4和PIN7 ingydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba)具有长环(323-355个残基)的特征，并且主要位于质膜中，而非典型pin (PIN5和PIN8以及中间的PIN6)位于质膜中gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba)具有更短的环，可以在细胞器膜如内质网膜中发现gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}(扩展数据图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.典型pin的长环具有调节活性的磷酸化位点;这些环已被证明是自抑制的，需要激酶活性来启动运输gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在这里，我们提出了PIN蛋白的结构和生物物理特性。特别是，冷冻电子显微镜(cryo-EM)已被用于解决在具有和不具有结合IAA的外向状态下的结构，以及在具有结合NPA的内向状态下的结构，分辨率在2.9和3.4 Å之间。结合突变蛋白的转运数据，这些结构提示了生长素转运的分子机制和模型，广泛适用于无处不在的PIN家族。gydF4y2Ba

我们选择从gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba筛选各种PIN同源物进行表达和纯化。PIN8是一个40 kDa大小的非典型PIN，具有43个残基的短胞质环，缺乏典型PIN的长自抑制环中所见的磷酸化基序。当在卵母细胞中表达时，PIN8表现出与激酶激活的PIN1相似的强大的IAA运输活性。这种活性不依赖于激活激酶，对抑制剂NPA敏感，这表明PIN8是一种组成型活性生长素转运体(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了表征IAA通过PIN8的电致运输，我们在gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba纯化后，将其重组为蛋白脂质体。我们利用固体支撑膜(SSM)电生理技术测量了PIN8对IAA的电容耦合，结果表明PIN8对IAA的表观亲和力相对较低，Michaelis常数为(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba;方法:356±136µM (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba）.我们测量解离常数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba)为39.9µM(扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba）.我们观察到适度的pH依赖性，在6.0-7.4之间达到最佳(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba）.与卵母细胞试验一样，NPA可以抑制运输，其抑制常数为(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)为1.9µM，表明其亲和力比IAA高一个数量级(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba）.我们筛选了许多额外的PIN基板(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)，并发现IAA类似物，例如萘乙酸(NAA)或除草剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d)，会引起PIN8的电流反应，而不带电的生长素以及一些内源性生长素则不会。这些底物的比较表明，形状互补在识别中起着很大的作用:例如，吲哚-3-丁酸(IBA)的较大尺寸和2-苯基乙酸(PAA)的还原环系统都导致电流减小。gydF4y2Ba

在将纯化蛋白重组成肽盘后，我们使用单粒子冷冻电镜分析了PIN8的三种不同结构:2.9 Å分辨率的载脂蛋白形式，3.2 Å分辨率的IAA结合PIN8, 3.4 Å分辨率的NPA结合PIN8(扩展数据图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.此外，在3.3 Å(扩展数据表)中，从洗涤剂溶解的制剂中产生了与载脂蛋白肽盘结构难以区分的载脂蛋白形式结构gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.载脂蛋白形式的最高分辨率图用于初始模型构建，但所有图都显示出整个蛋白质的良好密度，除了无序细胞质环的39个残基，这些残基没有建模(图2)。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba）.我们可以模拟多种水分子和脂类以及相关结构中的IAA和NPA。gydF4y2Ba

载子形式的PIN8显示一个对称的PIN8二聚体(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)，其特征是具有垂直于膜平面的双旋转轴，其明显的凹度沿着该轴从非细胞质侧延伸到膜内。在每个单体内有10个跨膜螺旋(M1-M10)，包括5个跨膜螺旋的反向重复gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba）.在每次重复中，第四个螺旋围绕膜平面中间的保守脯氨酸残基被破坏:M4中的Pro116和M9中的Pro325。这些断裂的螺旋形成一个x形交叉，标志着生长素结合袋(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

PIN8单体分为两个结构域，我们将其命名为支架结构域和转运体结构域(图2)。gydF4y2Ba1 d, fgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.支架结构域由螺旋M1、M2、M6和M7组成，形成一个大的界面(1,512 Å)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)与二聚体中的另一个单体相连。该界面主要由M2和M7介导，并通过M1和扭结的M6之间的凹槽中的脂质进一步稳定(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba）.我们还观察到另一种带有脂肪尾部的脂质粘在转运体结构域的口袋中。我们测试了对脂质活性的依赖性，发现PIN8在混合脂质和纯磷脂酰胆碱脂质体中的功能相似(扩展数据图)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba）.转运体结构域由螺旋M3-M5和M8-M10组成，并包含中心的x形交叉。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba）.单体的整体折叠与胆汁酸/钠同向转运体相似，但膜拓扑结构是倒置的gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba(扩展数据图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.在交叉点旁边，在支架结构域和转运体结构域之间有一个明确的充满水的结合袋，该结合袋通过凹面向蛋白质的非细胞质侧开放(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba）.相比之下，进入细胞质被阻断，清楚地将载脂蛋白pin8二聚体的构象定义为空的外向开放状态。gydF4y2Ba

PIN8的底物结合形式IAA-PIN8与apo-PIN8几乎相同(Cα原子的均方根偏差(r.m.s.d))。gydF4y2Ba_CαgydF4y2Ba) = 0.6 Å)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.结合袋中的IAA密度明显，周围有三个水分子(图2)。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba）.因此，IAA-PIN8结构代表了底物结合的外向开放状态，这是生长素的预期释放状态。gydF4y2Ba

IAA与其面向交叉的羧酸基结合;虽然只有两个残基在氢键距离内(Asn117和Gln145)，但IAA被来自M4b和M9b螺旋的正偶极子稳定。Pro116的主链羰基形成了一个极袋，这个极袋也由Tyr150和Ser146排列。在这里，我们观察到三个定义明确的水分子，它们可能反映了IAA在释放状态下与结合袋的部分解离。将Asn117和Gln145突变为丙氨酸会消除运输，支持它们的重要性(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba）.Tyr150突变体显示出混合结果:Y150F保留了对NPA的活性、亲和力和敏感性，而Y150A中粗侧链的去除导致其活性和亲和力非常低(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba）.相比之下，Ser146的突变对活性没有影响(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在转运体结构域，IAA碳主链在非细胞质侧与Leu119(M4b)和Ile120(M4b)接触，而吲哚环在细胞质侧与Val327(M9b)和Val328(M9b)接触。这四个疏水残基对称地位于两个关键脯氨酸之后的交叉上，作为重复和保守的交叉序列基序的一部分(P(N/Q)XΦΦ;其中Φ为疏水残基)(图2)gydF4y2Ba两个罪犯gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba）.交叉基序的疏水残基提供了生长素底物的亲和力。体积庞大的I120Y和V328Y突变体支持了这一点，这两种突变体都通过干扰底物结合而降低了表观亲和力，但仍保留了NPA敏感性(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba）.综上所述，转运体结构域和IAA之间的相互作用强调了PIN8在形状互补的基础上选择IAA，正如SSM电生理学结果所表明的那样。在支架结构域，吲哚环与Ile51 (M2)、Leu54 (M2)以及伪对称相关的Leu260 (M7)和Ala263 (M7)具有非特异性疏水相互作用。这些疏水残基(如I51Y)的大量突变导致传输电流显著降低(图5)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba）.所有定义结合袋的残基在不同植物物种中都表现出高度的序列保守性，并且在所有物种中都是完全保守的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaPIN5以外的PIN蛋白(扩展数据图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

PIN8的npa结合形式采用向内开放的构象(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.支架结构域和二聚体界面相对于外开构象(r.m.s.d)是不变的。gydF4y2Ba_CαgydF4y2Ba= 0.9 Å)，但两个转运体结构域旋转了大约20°，使生长素结合位点和Asn117暴露在细胞质侧。这种旋转导致结合位点的平移约5 Å(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.与IAA外开状态相比，NPA与蛋白质的相互作用更广泛(图2)。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba）.与IAA类似，NPA的羧酸基团指向交叉，但有几个更强的相互作用，在外向开放状态下没有观察到。除了在IAA中看到的相互作用外，NPA还与Val327和Val328的主链氮原子以及Gln145和Tyr150在一个不涉及水的网络中相互作用。NPA的苯环和萘环仍然与转运体结构域的两个交叉基序相互作用，类似于IAA。还观察到与支架结构域的几种新的相互作用，其中许多是由NPA的萘环介导的，并且可能是更大，更复杂的NPA分子所特有的(图2)。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8个模拟gydF4y2Ba）.因此，NPA的抑制作用可以用两个组成部分来解释:(1)由于支架结构域的额外残基的参与而产生的更强的结合，以及(2)更大的NPA阻止向外状态过渡。gydF4y2Ba

毗邻生长素的主要结合位点，在M3、M5和M9交叉的另一侧有一个辅助的“支持位点”。这个支持位点通过一个广泛的氢键网络连接到生长素的主要结合位点，这个氢键网络由中心Gln145和Pro116的主链羰基桥接。高分辨率的apo-PIN8地图显示了该地点的两个峰，其建模为水(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba）.在低分辨率的IAA-PIN8和NPA-PIN8地图中，相同的位点包含一个单一的弱峰，也被建模为水(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8汉英gydF4y2Ba）.Na的存在gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在胆汁酸/钠同向转运体的类似位点上，我们通过比较PIN8在钠和钾排他性缓冲液中的转运来探测离子依赖性。在这两种情况下，PIN8都保持充分的活性，这表明没有发生特定的离子反输运(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.在所有结构中，支持位点的水分子与Asp75 (M3)、Gln78 (M3)、Lys79 (M3)、Gln320 (M9a)和Gln145 (M5)形成氢键网络(图5)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.突变分析表明，除Gln320外，所有这些残基对于活性都是绝对必需的(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.值得注意的是，Asp75和Lys79是完全保守的，构成质子供体-受体对，具有质子运输的潜力;事实上，这一观点得到了从残基(D75N或K79Q)去除电荷并消除输运的等构突变的支持(图5)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba8 a、c、dgydF4y2Ba）.在所有的结构中，Asp75到Lys79的距离都小于3 Å，与Asp75的非质子化状态一致。然而，蛋白脂质体中PIN8的活性对质子动力解耦剂不敏感，并且对pH依赖性最小，这表明质子动力不是运输的必要条件(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba）.此外，卵母细胞的输出率也与外部pH值无关(扩展数据图。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

植物的生长和形态在很大程度上受典型pin介导的极性生长素运输的控制。所有pin的比较gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba这里对PIN8的研究表明，除了不寻常的非规范pin5外，生长素和支持位点是完全保守的。这种保守性，也延伸到其他植物物种，表明我们的观察可以推广gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(扩展数据图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba）.在蛋白质脂质体测定中测定的IAA的低表观亲和力比植物组织中生长素的生理浓度低5 - 500倍gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba(0.1 -10µM)。虽然我们不能排除实验人工制品，这意味着不同的功能gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Bapin产生于不同的定位、丰度和自抑制特性，而不是直接调节底物亲和力gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba。一些研究表明，ABCB转运体与pin相互作用，在IAA转运中产生选择性gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。我们的工作表明，这种相互作用在体外不需要活性，而且很可能在植物中也不需要。gydF4y2Ba

PIN家族是BART超家族的一部分，其中包括来自BASS家族的ASBT胆汁酸/钠同调子gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。尽管PIN8和ASBT采用相同的折叠方式，但ASBT的方向相反，不会出现二聚化(扩展数据图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.此外，至少有三个其他家族的蛋白质采用相同的折叠(DALI)gydF4y2BaZgydF4y2Ba-得分bbb10)，即两个NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba反向转运蛋白家族(CPA1和CPA2)和HCO3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba同向转运家族gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}。与胆汁酸/钠同向转运体类似，这些其他蛋白家族都与pin具有可忽略不计的序列同源性。的HCO3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba同向转运体采用与PIN8相同的膜取向，而NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba反转运蛋白与胆汁酸/钠正转运蛋白具有相同的倒置取向，这也许可以解释为什么pin和这些不同蛋白家族之间的结构联系以前没有被注意到(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

这些其他蛋白质家族都是使用钠或质子驱动运输的二级活性转运蛋白，并且都被提出使用升降机机制发挥作用，其中支架结构域是固定的，转运蛋白结构域围绕保守的脯氨酸交叉基序旋转。值得注意的是，在这些家族中，驱动钠和质子所占据的位点与pin中的支持位点位于相同的位置。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，从这项工作中可以清楚地看出，PIN8使用了相同的通用脯氨酸交叉提升机制(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

我们的数据表明，负电荷的IAA是足够的传输(扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.然而，存在一个支持位点的基本结构，允许离子结合，以及一个保守的和功能必需的Asp75-Lys79对，可以介导质子易位gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。大多数支持位点的突变完全取消了活性，强调了该区域的本质，但卵母细胞和SSM电生理分析均未表明依赖于钠或质子的反运输来驱动生长素的输出。因此，我们的数据支持pin的单端口机制，尽管我们不能明确排除质子反端口在体内的可能性。gydF4y2Ba

在现有数据的基础上，我们提出了以下的生长素运输pin模型(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba):向内的构象允许电离的生长素分子进入转运和支架结构域之间的结合位点。带负电的羧酸基团被M4b和M9b的正偶极子稳定，同时被Asn117保持在原位，并通过Gln145与支持位点相互作用。碳主链和吲哚环被脚手架结构域两个交叉基序的四个疏水残基识别。在转变为外向构象的过程中，脯氨酸交叉旋转20°，支架结构域的生长素结合位点被从细胞质中翻译出5 Å。在向外的状态下，IAA的释放是由pH值的变化促进的，从而使羧酸盐发生质子化和中和。底物释放后，蛋白质恢复到内向开放状态。gydF4y2Ba

有人认为pin的寡聚态可能在调控中起作用，但PIN8中较大的二聚体相互作用表面反对动态平衡gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。然而，可以想象，这些单体是独立运作的，而且pin可以形成异齐聚物gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

我们没有直接解决典型pin中细胞质环的自抑制问题，但与其他已知蛋白家族的联系提供了一些提示gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba同向转运者，已经证明来自细胞质调节伙伴的环通过与结合位点相互作用将蛋白质锁定在内向构象中gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}。通过类比，典型pin中的自抑制回路似乎是通过类似的机制运作的。gydF4y2Ba

总之，我们提出了一个PIN的体外生化表征，以及在生长素和除草剂NPA存在和不存在时代表两个关键构象状态的结构。含有NPA的结构对PIN蛋白具有竞争性抑制作用，可为新型除草剂的结构开发提供基础。我们描述了生长素运输的分子机制，可以独立于单价离子或质子起作用，从而扩大了我们对来自所有生命王国的不同蛋白质超家族的蛋白质使用的交叉升降机机制的理解。这项工作为进一步研究PIN在植物生长发育中至关重要的极性生长素运输中的作用奠定了基础。gydF4y2Ba

蛋白质纯化gydF4y2Ba

答:芥gydF4y2Ba本研究中使用的蛋白质序列可在Uniprot (gydF4y2Bahttps://www.uniprot.org/gydF4y2Ba)，并附有以下登记编号。PIN1: Q9C6B8, PIN2: Q9LU77, PIN3: Q9S7Z8, PIN4: Q8RWZ6, PIN5: Q9FFD0, PIN6: Q9SQH6, PIN7: Q940Y5和PIN8: Q9LFP6。gydF4y2Ba

PIN基因被克隆到一个gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba基于p423_GAL1的过表达质粒，并进行了表达和纯化性能测试。的gydF4y2Ba拟南芥PIN8gydF4y2Ba选取Q9LFP6基因(Uniprot: Q9LFP6)，以烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位点和十组氨酸亲和标签置入框内。该构建体使用Quickchange商业协议(Agilent)作为所有点突变体的定点诱变模板。gydF4y2Ba

改变了gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba应变gydF4y2BaDSY-5gydF4y2Ba在5l摇瓶或培养容器中培养，培养到高细胞密度，半乳糖诱导22小时后收集gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。收集的细胞在水中洗涤三次，并重新悬浮在缓冲液A中(0.1 M Tris pH 7.5, 0.6 M NaCl, 1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 1.2 mM苯基甲基磺酰氟)。细胞通过敲打头裂解，裂解液在5000℃离心澄清gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟。膜组分在20万下进行超离心成球gydF4y2BaggydF4y2Ba在缓冲液B (0.05 M Tris pH 7.5, 0.5 M NaCl, 20%甘油)中重新悬浮2 h，然后在液氮中冷冻。gydF4y2Ba

为了纯化蛋白质，将3-4 g膜解冻，溶解在总容积为50 ml的缓冲液C (0.05 M Tris pH 7.5, 0.5 M NaCl, 10%甘油)中，并添加1%gydF4y2BangydF4y2Ba十二烷基-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-d-麦芽糖苷(DDM)和0.1%半琥珀酸胆固醇(CHS)。不溶性物质在17000℃离心时被丢弃gydF4y2BaggydF4y2Ba用1.2µm过滤器过滤30分钟。加入pH 7.5的咪唑20 mM，上样于1 ml镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱。用缓冲液D(缓冲液A含20 mM咪唑，0.1% DDM, 0.01% CHS)和缓冲液E(缓冲液A含70 mM咪唑，0.05% DDM, 0.005% CHS)进行两步洗涤。gydF4y2Ba

SSM电生理实验用缓冲液F (0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油，0.05% DDM, 0.005% CHS, 500 mM咪唑)洗脱样品。洗脱液与TEV蛋白酶孵育，在含有0.5 mM EDTA和0.5 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)的缓冲液F中透析过夜。然后将样品过滤并在Ni-NTA柱上重新运行，以吸附由TEV蛋白酶，裂解标记和未裂解标记蛋白组成的his标记蛋白。将含有无标记PIN8的流动组分浓缩在100 kDa的切断中心体(Vivaspin)上，并在Biorad650或Superdex200 10/300柱上进行SEC抛光，缓冲液G经热稳定性实验优化gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba(0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油，0.05% DDM, 0.005% CHS, 0.5 mM EDTA)。gydF4y2Ba

对于冷冻电镜，肽盘样品制备遵循一般方案gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}。简单地说，两步洗涤后，用缓冲液I (0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油，0.03% DDM, 0.003% CHS, 0.06 mg ml)对蛋白质进行重脂化gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}大豆提取物极性脂(Avanti))。在开始头上肽盘重构之前，用缓冲液J (0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油，0.008% DDM, 0.0008% CHS)洗涤色谱柱。用含1 mg ml的无洗涤剂缓冲液K (0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油)洗涤柱，开始肽盘重构gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}peptidisc (Genscript)。在用含有500 mM咪唑的缓冲液K进行洗脱之前，用缓冲液K进行额外的洗涤步骤以消除剩余的游离肽盘。在此之后，样品与TEV蛋白酶孵育，并在含有0.5 mM EDTA和0.5 mM TCEP的缓冲液K中进行透析。gydF4y2Ba

对于冷冻电镜洗涤剂样品，在用缓冲液I进行重脂化步骤后，使用缓冲液L (0.05 M Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油，0.006% LMNG, 0.0006% CHS)将DDM洗涤剂交换为十二烷基麦糖新戊二醇(LMNG)，然后使用添加500 mM咪唑的缓冲液L进行蛋白质洗脱。然后用TEV蛋白酶孵育样品，用添加0.5 mM EDTA和0.5 mM TCEP的缓冲液L进行透析。透析后，冷冻电镜样品纯化继续与SURFE相同gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在“SSM电生理分析”中描述的R样品方案，例外的是SEC缓冲液被替换为不含甘油的缓冲液K(肽盘样品)或缓冲液L (LMNG样品)，并补充0.5 mM EDTA。gydF4y2Ba

SSM电生理分析gydF4y2Ba

对于SSM电生理，一个SURFEgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba采用Nanion Technologies公司的rn1。简而言之，大豆磷脂混合物(38%磷脂酰胆碱，30%磷脂酰乙醇胺，18%磷脂酰肌醇，7%磷脂酸和7%其他大豆脂)和1-棕榈酰-2-油酰-gydF4y2BasngydF4y2Ba-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)购自Avanti。在不含Ca的林格氏溶液中制备脂质体gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1mm NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，并使用孔径为400 nM的Lipsofast (Avestin Inc .)进行均质。将Triton X-100加入到脂质体中，最终浓度为1% (v/v)。将蛋白质添加到脂质体中，计算出脂质体与蛋白质的比(LPR)为10:1。用400mg ml去除洗涤剂gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}生物珠(BioRad)在4°C的旋转振动筛中过夜。蛋白脂质体在液氮中冷冻，保存在- 80°C直到使用。gydF4y2Ba

传感器涂层按照描述进行gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。蛋白脂质体在不含Ca的林格溶液中以1:5稀释gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，超声5次，然后离心(30分钟，3000gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4℃)。非活化缓冲液为不含Ca的林格溶液gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}如前所述，除非另有说明，激活缓冲液包含感兴趣的底物。来代替NagydF4y2Ba^+gydF4y2BaKgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-没有CaCl的铃声gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba117.5 mM KCl, 10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，代入KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-没有CaCl的铃声gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(117.5 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)被使用。解耦剂:羰基氰化物gydF4y2Ba米gydF4y2Ba乙醇中的-氯苯基腙(CCCP)和2,4-二硝基苯酚(DNP)分别为5µM和100µM。其他化学品都是从罗斯或西格玛购买的。每个实验至少在两个单独的传感器上进行。在每个传感器上，每次测量由三个技术重复组成，其中计算平均值。gydF4y2Ba

在大多数情况下，我们使用单个溶液交换实验。在这种情况下，固定在支撑膜上的蛋白脂质体按照规定保存在非激活缓冲液中。实验开始时，将非活性缓冲液换成新鲜的相同的非活性缓冲液，1 s后加入活性缓冲液(含有底物的相同缓冲液)。再过1秒，缓冲区再次交换为非激活缓冲区。在整个30年代记录当前的反应。对于竞争或抑制，各自的化合物存在于非激活和激活溶液中。gydF4y2Ba

激活溶液中对底物的响应电流是对发生在(1)带电分子穿过膜时的致电事件的响应;(2)当一个不需要带电的底物与蛋白质结合时，这种结合导致构象变化，从而使膜中的电荷发生位移;(3)电流被基材屏蔽或中和;(iv)这些可能性的任何组合。响应底物应用的峰值电流被用来描述蛋白质的性质。gydF4y2Ba

拟合Michaelis-Menten曲线来描述对不同底物浓度的电流响应。我们使用gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba但由于峰值电流是结合和输运信号的混合(即前稳态和稳态电流)，因此该参数也可以更恰当地描述为ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba。一个gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba从生物物理分析中得到的结果将是特定于该实验设置的，与其他类型的分析或生理条件的比较应谨慎进行。在竞争性研究的情况下，我们明确使用gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba或gydF4y2BaKgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba，因为在这些情况下，参数是具体确定的。使用GraphPad Prism v9.3进行统计分析。gydF4y2Ba

低温电镜样品制备gydF4y2Ba

新纯化的PIN8的峰分浓缩至4-10 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。c -平孔碳网格(CF-1.2/1.3, Cu-300目)在GloQube Plus (Quorum)中以15 mA放电45 s。在网格的非碳侧滴入4µl的样品，用Vitrobot Mark IV (ThermoFisher Scientific)在4°C和100%湿度下工作，印迹时间为4 s，然后将其放入液体乙烷中冷冻。在栅格冷冻前，将样品与15 mM的IAA钠盐或2 mM的NPA孵育2小时，获得底物结合状态。gydF4y2Ba

图像采集和数据处理gydF4y2Ba

使用工作在300 kV的Titan Krios G3i显微镜(ThermoFisher Scientific)，配备生物量子成像滤光片(能量狭缝宽度为20 eV)和K3探测器(Gatan)来收集电影。包含肽盘样本的数据集使用自动采集EPU v2.11.1.11获得，标称放大倍数为13万，对应物理像素大小为0.647 Å。对于所有数据集，电影都以超分辨率像素大小保存，并在EPU中进行2x分类，恢复到标称像素大小。gydF4y2Ba

实时增益归一化曝光导入cryoSPARC (v3.2.0)gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba并以流方式进行patch运动校正、patch对比度传递函数(CTF)估计、粒子拾取和提取。经过几轮颗粒清洗后，使用初始的初步体积映射来创建模板。从包含7900部电影的apo-PIN8完整数据集中，模板选择总共提供了2,082,448个粒子。经过两轮二维分类，人工选出最具代表性的类。这些粒子作为从头算模型重建的输入。在使用从头算3D模板进行三轮异构细化后，剩余的327,193个粒子进行C2对称的非均匀细化，得到全局2.9 Å分辨率图。同时进行了C1对称改进工作，但两种单体之间没有差异。gydF4y2Ba

为了确保膜蛋白稳定方法不影响寡聚体状态和整体结构，我们在肽盘(2.9 Å)和洗涤剂LMNG (3.3 Å)中分别求解载脂蛋白PIN8。各自的地图显示没有变化的构象，我们专注于肽衍生的地图，因为它的更高的分辨率。在筛选的任何网格中也没有单体或高寡聚态的证据。gydF4y2Ba

配体结合PIN8的加工流程与载脂蛋白PIN8的加工流程相同。简而言之，整个IAA-PIN8数据集由15,771部电影和模板挑选组成，共产生2,639,895个粒子。经过几轮二维分类和异构细化，最终获得200,061个粒子，采用C2对称拼版的非均匀细化得到了全局3.2 Å分辨率图。NPA-PIN8的完整数据集由14,500部电影和模板挑选组成，共产生3,345,146个粒子。经过多轮二维分类和异构细化，最终获得77608个粒子，再进行C2对称拼版的非均匀细化，得到了一张全局3.4 Å分辨率图。对于载脂蛋白形式，进行了平行的C1细化，两种单体之间没有明显的差异。使用cryoSPARC进行局部分辨率估计。gydF4y2Ba

模型构建和细化gydF4y2Ba

使用RoseTTAFold服务器计算PIN8模型预测gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba并与奇美拉的PIN8地图对接gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。两个PIN8分子可以很容易地融入到图谱中。PIN8的柔性细胞质环(残基165 ~ 205)在图谱中不可见，在Coot模型构建中被排除在外gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。最终模型包括残数1-164和206-367(总共367个残数)。初始的PIN8二聚体模型通过基于分子动力学的几何拟合使用MDFF进行分析gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba通过Namdinator v2.0(参考。gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba）.通过在Coot中进行迭代人工模型构建，结合使用phoenix进行实时空间细化，初步采用Amber力场分子动力学细化，可以进一步改进模型gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。利用配体构建剂肘部制备了脂质与配体IAA的配合物gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。在所有的电子显微镜图中，尽管围绕着PIN8二聚体的脂质带是可见的，但电子密度只允许对配体结合的PIN8进行两个磷脂酰胆碱分子和四个载脂蛋白PIN8分子的初步建模。几何图形在MolProbity v4.2中进行验证，包括CaBLAM和Ramachandran-Z分析gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}(Rama-Z)。使用PyMOL分子图形系统v1.5.0.4 (Schrödinger)制作图形。利用ConSurf分析了物种间残基的守恒性gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。利用PROMALS3D进行序列比对gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。使用ALINE v1.0.025可视化排列gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。利用DALI鉴定了与其他蛋白家族的结构相似性gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。采用NGPhylogeny.fr进行系统发育分析gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba。简单地说，MAFFT用于多序列比对(MSA)， BMGE用于MSA修剪，FastME用于无根树生成。从500次试验中计算Bootstrap值。gydF4y2Ba

卵母细胞外排测定gydF4y2Ba

卵母细胞外排实验按描述进行gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。简而言之，卵母细胞注射150 ng转运体cRNA，不注射或注射75 ng激酶cRNA。gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH-IAA (25 Ci mmol)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是从ARC或RC Tritec购买的。卵母细胞内注射IAA至IAA内浓度为1µM，相当于100%。在指示的时间点之后，通过液体闪烁计数来确定每个卵母细胞的残留放射性，并相对于初始的100%表示。每个时间点代表10个卵母细胞的平均值和似乎值。为了计算以每分钟百分之几为单位的相对运输率，进行了线性回归。图中每个数据点。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba表示从不同卵母细胞收集的一个生物复制的转运率gydF4y2Bax光滑的gydF4y2Ba女性。使用GraphPad Prism v9.3进行统计分析。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba