摘要gydF4y2Ba
逆转录子是原核遗传逆转录元件，编码一种产生多副本单链DNA的逆转录酶gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(msDNA)。尽管对msDNA生物合成的研究已经进行了几十年gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在美国，重激子的功能和生理作用尚不清楚。这里我们展示了Retron-Sen2gydF4y2Ba沙门氏菌血清gydF4y2Ba血清型鼠伤寒编码一种附属毒素蛋白STM14_4640，我们将其重新命名为RcaT。RcaT被逆转录酶- msDNA抗毒素复合物中和，并在msDNA生物合成的扰动下变得活跃。逆转录酶是与RcaT结合所必需的，msDNA是抗毒素活性所必需的。高度流行的含rcat的retron家族构成了一种新型的含dna的三联毒素-抗毒素系统。为了了解这种毒素-抗毒素系统的生理作用，我们开发了一种高通量反向遗传学方法，即毒素激活-抑制结合(TAC-TIC)，以确定毒素-抗毒素系统的分子触发和阻滞剂。通过将TAC-TIC应用于Retron-Sen2，我们鉴定出多种噬菌体起源的触发蛋白和阻断蛋白。我们证明了噬菌体相关的触发直接修饰msDNA，从而激活RcaT并抑制细菌生长。相比之下，前噬菌体蛋白通过直接阻断RcaT来绕过retrons。与最近的报道一致，retron毒素-抗毒素系统作为流产感染抗噬菌体防御系统gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．因此，RcaT逆激子是dna三重调控的毒素-抗毒素系统，它使用逆转录酶- msdna复合物作为抗毒素和噬菌体蛋白活性的传感器。gydF4y2Ba
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全基因组测序的原始读数保存在欧洲核苷酸档案中gydF4y2BaPRJEB38324gydF4y2Ba．来自RcaT和RT免疫沉淀和噬菌体感染的蛋白质组学数据见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba，原始数据在加入后存放在ProteomeXchangegydF4y2BaPXD022376gydF4y2Ba．所有TAC-TIC数据见补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．源图像和副本提供于figshare (gydF4y2Bahttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.17376488gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
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TAC-TIC数据用R(3.6.1)进行分析，完整代码可在gydF4y2Bahttps://git.embl.de/kritikos/tic-tacgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢EMBL Genomics Core提供WGS;EMBL PEP Core用于RT-Sen2纯化;EMBL蛋白质组学核心;Typas实验室进行讨论，特别是M. Wartel帮助建立了高通量偶联;E. van Nimwegen forgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaSC402;V. Mutalik和B. Adler的Ffm和Br60噬菌体。这项工作得到了EMBL和亚历山大·冯·洪堡基金会的Sofja Kovaleskaja奖的支持。K.M.和A.M.获得了EMBL跨学科博士后(EI3POD)项目(MSCA COFUND;664726)。M.G.在德国卓越战略- exc 2155-390874280下由DFG资助。J.R.E.得到了NIH的支持(K08AI108794)。H.L.A.-P。由NIFA (NIFA 2016-11004和2017-08881)和DARPA支持。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
a。b。g。z。m。m。s。j。r。e。A.T.监督了这项研究。J.B.和A.T.根据J.R.E.和h.l.a.p的意见构思了这项研究。有机,K.M点和A.T.设计实验中,有机,K.M,点,刘昌明,M.Z S.G.-S。， A.S.和C.K.进行了实验。N.K.和M.G.构建了RcaT和逆转录酶系统进化树。V.M.预测了RcaT-Sen2结构。的gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm化学遗传学筛选数据来自B.P.和M.G.分析gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm基因组测序数据，A.M.和F.S.分析蛋白质组学数据。G.K.和J.B.分析了TAC-TIC屏幕。J.B.， a.m.， n.k.， K.M.和G.K.根据A.T.的输入设计了图形，J.B.和A.T.根据所有作者的输入编写了不同的手稿版本。gydF4y2Ba
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扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1逆转录子表型被抑制的副逆转录子基因，编码细胞质毒素RcaT。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,ΔgydF4y2BarrtTgydF4y2Ba和ΔgydF4y2BaxseA年代gydF4y2BaTm对冷敏感。的1536集落数组gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm基因删除库gydF4y2Ba15gydF4y2Ba将菌株固定在LB板上，在室温下培养。殖民地的大小gydF4y2Ba44gydF4y2Ba用来计算每个菌株的适合度s分gydF4y2Ba66gydF4y2Ba．s分数由gydF4y2BangydF4y2Ba= 8生物学。纵虚线表示各菌株的平均s分(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3781);阴性或阳性的s值表示敏感或抗性突变体。gydF4y2BabgydF4y2Ba扰乱msDNA的生物发生导致冷敏感性。gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm野生型和re - on缺失菌株连续稀释并在LB板上斑点，如图所示。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba．培养皿在指定温度下孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4生物学)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Retron突变体在厌氧条件下生长较少。生长曲线gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba在37°C厌氧条件下，通过测定微量滴度板中的OD578，获得Tm野生型和反转录子缺失菌株;gydF4y2BangydF4y2Ba= 11生物，符号表示平均值，误差条表示标准偏差(小于符号则不显示)。gydF4y2BadgydF4y2Ba在有氧条件下，Retron突变体不受影响。实验和绘图如图c所示，但菌株是有氧生长的(gydF4y2BangydF4y2Ba= 11生物学)。gydF4y2BaegydF4y2Ba， RNAse H和Exo VII参与msDNA的生物合成。msDNA从gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm野生型和携带p-retron质粒的retron缺失菌株-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba．提取的msDNA在tbe -聚丙烯酰胺凝胶中电泳(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BafgydF4y2Ba、删除gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba恢复retron突变体的冷敏感性。gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm菌株的生长和斑点如图所示。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BaggydF4y2Ba、删除gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba恢复retron突变体的厌氧敏感性。生长曲线gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm菌株的获得和绘制如图c (gydF4y2BangydF4y2Ba= 11生物学)。gydF4y2BahgydF4y2Ba， RcaT是一种可溶性蛋白。未加标签的,gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba3 xflaggydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm WT在37°C的LB中生长，裂解，通过超离心步骤将样品分离为可溶性部分和膜部分。采用SDS-PAGE和免疫印迹法分析不同组分。LpoA和RecA分别作为膜和可溶性部分的对照(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba在寒冷的温度下，抑制型植物像野生型植物一样生长。从冷敏感型中分离出抑制因子gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm突变体(ΔgydF4y2BarrtTgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba；面板gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)或催化gydF4y2BarcaTgydF4y2Bae107q突变体(面板gydF4y2BajgydF4y2Ba)生长，连续稀释，并在LB板上斑点如图所示。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba．已识别的抑制突变显示(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BakgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba功能缺失点突变不影响RcaT水平。用质谱法定量突变菌株中的RcaT蛋白水平(图中虚线表示)gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba)．y轴为reton缺失菌株与WT相比RcaT蛋白水平的比值(log2 fold-change)(面板)gydF4y2BakgydF4y2Ba)或在RcaT点突变体中与背景菌株相比的相同比例，其中抑制基因在(面板)中分离gydF4y2BalgydF4y2Ba)．灰色虚线表示RcaT蛋白水平没有变化。黑线表示平均值(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2-4生物学)。gydF4y2Ba
图2 . Retron-Sen2作为一种毒素-抗毒素系统gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba抗毒素不会关闭RcaT的表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， RcaT可被抑制gydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba-gydF4y2Ba反式rrtTgydF4y2Ba．gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba携带质粒p-的二元组合gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba, p-retronΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba，空载体，用适当的抗生素在LB中培养，连续稀释，如图所示。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， RcaT抑制需要两者gydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba而且gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用携带反转录子成分的质粒进行培养，如图所示。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba．只有完整的retron才能恢复生长。RcaT的表达足以抑制生长(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， RcaT的抑制需要RNAse H和Exo VIIgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株(WT， ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BaxseBgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BarnhAgydF4y2Ba)携带质粒p-retron-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba或p-retron被培养，连续稀释，如图b所示(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BadgydF4y2Ba在美国，抗毒素缺失只会轻微影响RcaT水平。gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba3 xflaggydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm菌株(WT和retron-deletion)gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm未标记菌株(原生菌株)在37°C LB中生长，或转移到20°C 5 h。采用SDS-PAGE和免疫印迹法对菌株的蛋白质样品进行分析。以LpoA水平(α-LpoA抗体)为加载对照。柱状和误差柱状分别表示均值和标准差(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5生物学)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，用ImageJ(像素密度)定量d区37°C免疫印迹中的RcaT-3xFlag信号。柱状和误差柱状分别表示均值和标准差(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5生物学)。gydF4y2Ba
图3功能标记RcaT-RT共免疫沉淀与温度无关。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba， 3xflag标记RrtT亲和纯化的火山图(面板gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和RcaT(面板gydF4y2BabgydF4y2Ba)在37°C和20°C野生型和不同突变背景下。实验与图中相同。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba，并给出37°C的AP数据。x轴表示中已识别蛋白质(由2个以上的独立肽)的平均log2比值gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba3 xflag和gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-3xFlag与未标记的AP样本比较gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm WT控制菌株(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)，y轴表示gydF4y2BapgydF4y2Ba这些log2比值(双尾limma)的值。gydF4y2BacgydF4y2Ba，标记RcaT保留其功能。未加标签的,gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba3 xflag标记gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm菌株(WT和retron- delets)在37℃LB中培养5-6 h，连续稀释，在LB板上斑点，并在指定温度下孵育。*表示ΔSTM14_4645::cat，用于共转导无疤痕标记gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba(PCR验证共转导)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，带标记的RrtT保留其功能。未加标签的,gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba3 xflag标记gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm菌株(WT和retron- delets)在37°C的LB中培养5-6小时，连续稀释，在LB板上斑点，并在指定温度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BaegydF4y2Ba, Flag-tagginggydF4y2BarrtTgydF4y2Ba不改变retron蛋白表达，而标记标记gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba降低两种逆激子蛋白的水平。输入样本(整个蛋白质组)中的蛋白质用于图中所示的样本。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba比较标记和未标记的RcaT和RT蛋白水平(log2倍变化)gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm WT菌株(x轴)。线表示平均值，来自两个生物重复。RT在gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-3xFlag标记的菌株，而RcaT甚至没有被检测到(n.d)，可能是由于较低的水平(染色体RcaT处于MS检测的水平，因此微小的变化可以使其低于检测)。请注意，尽管两种retron成分的水平都较低，gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-3xFlag保留其功能(面板c)并表示(扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
图4 RT与msDNA相互作用。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， RT-Sen2蛋白的纯化。一个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3) CodonPlus-RIL株携带质粒p-gydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba-gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba用-6xHis纯化RT-Sen2-6xHis蛋白(c端融合)，采用镍柱固定金属亲和层析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2次提纯)。gydF4y2BabgydF4y2Ba, His-tagginggydF4y2BarrtTgydF4y2Ba不影响其抗毒素活性。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba携带二元组合质粒p-的BL21-AI菌株gydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba-gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba6 xhis, p -gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba，空载体，在37℃的卡那霉素lb中连续稀释，在有或没有阿拉伯糖的lb -卡那霉素培养皿中培养5-6小时，培养皿在20℃孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6生物学)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21通常不会产生与msDNA-Sen2大小相似的DNA。msDNA从gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21携带质粒p-gydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba-gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba或者是空质粒。提取的msdna在tbe -聚丙烯酰胺凝胶中电泳(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4生物学)。gydF4y2BadgydF4y2Ba纯化RT-Sen2中msDNA的分离gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(与图a相同)。从500 μg纯化RT-Sen2-6xHis蛋白中提取总DNA，并在tbe -聚丙烯酰胺凝胶(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2次提纯)。gydF4y2Ba
图5不同的逆激子在不同环境下对生长的抑制作用。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bade - com -4976 (Eco10)， SC402 (Eco3)和REL606 (Eco1) (WT， ΔgydF4y2BarnhAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba(或双突变株)在37℃LB中连续稀释培养5-6 h，并在LB或LB pH 5.5板上斑点。培养皿在指定温度下孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，与面板a相同的菌株在37°C LB中厌氧培养24h，同时测量OD578。这里绘制了突变菌株的产量与相应WT菌株的产量的比较。gydF4y2BangydF4y2Ba= 4(2个生物/2个技术)。gydF4y2BacgydF4y2Ba只有RcaT-Sen2和-Eco9在单独过表达时具有毒素作用。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113株携带retron- orgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-编码质粒(Sen2, Eco9, Eco10, Eco3和Eco1)，在37℃的lb -大光霉素中连续稀释，在有或没有阿拉伯糖的lb -大光霉素培养皿中培养5-6小时，并在37℃的培养皿中孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2Ba
图6 Retron-Eco9与Retron-Sen2相似。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， Retron-Eco9的操纵子结构与Retron-Sen2相似。Retron-Eco9包含gydF4y2BamsrgydF4y2Ba，gydF4y2Ba默沙东公司gydF4y2Ba，gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba而且gydF4y2BarrtTgydF4y2Ba区域，85%，58%，43%，49%与相应的Retron-Sen2区域相同(前两个核苷酸，后两个蛋白质水平);gydF4y2BarrtgydF4y2Ba=逆转录酶。gydF4y2BabgydF4y2Ba， msDNA-Eco9与msDNA-Sen2类似。msDNAs-Sen2和-Eco9模型gydF4y2Ba67gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba， msDNA- eco9生物合成需要ExoVII和RNase hgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113株(野生型，ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BaxseBgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BarnhAgydF4y2Ba)携带PBAD-msrmsd-RT-Eco9质粒，经tbe -聚丙烯酰胺凝胶(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BadgydF4y2BaRcaT-Eco9的抑制需要RNAse H和Exo VIIgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113株(野生型，ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BaxseBgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BarnhAgydF4y2Ba)携带质粒Ptac-msrmsd-Eco9，以及PBAD-RT-Eco9(−)或pbad - rt - rct - eco9(+)，在37℃LB条件下，用适当的抗生素连续稀释，在抗生素-LB培养皿中培养5-6小时，培养皿中有/没有阿拉伯糖，37℃孵育过夜(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，非同源RT-msrmsd对产生msDNA。msDNA从gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113共表达rtron - sen2 (Se)或-Eco9 (Ec)的RT (PBAD-RT;Se或Ec -阿拉伯糖诱导)和Ec/Se msrmsd (Ptac-msrmsd或空载体(-))。提取的msDNA在tbe -聚丙烯酰胺凝胶中电泳(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BafgydF4y2Ba在基本的msrmsd (Se)水平下，Ec RT不能起到抗毒素的作用，但当后者被诱导时则可以(图2)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，符合Ec RT逆转录Se msrmsd的能力较低(图e)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2Ba
扩展数据图7 TAC低iptg，再现性，命中热图和验证。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba-gydF4y2BabgydF4y2Ba， TAC源于低iptg诱导。实验如图所示。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba，但用低iptg质粒库诱导MOB(面板a;p1)gydF4y2Ba26gydF4y2BaTransBac(面板b;p2)gydF4y2Ba27gydF4y2Ba．前噬菌体基因折叠富集(FE)和gydF4y2BapgydF4y2Ba值(单尾费雪精确检验)显示在顶部。gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba， TAC在对照和实验板中的再现性。来自对照板(ctrl)或实验板(exp)的菌株未处理的菌落透明度值，来自复制板1和2，相互绘制。图中表示每个板对中包含的过表达库和IPTG浓度。结果显示MOB(面板c;p1)gydF4y2Ba26gydF4y2BaTransBac(面板d;p2)gydF4y2Ba27gydF4y2Ba．复制相关性(RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)为每个再现性图显示。绿色圆点对应图a-b和图中所示的命中点。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba．gydF4y2BaegydF4y2Ba，跨过表达式库的已识别触发器的非参数比较。从MOB中鉴定的触发基因gydF4y2Ba26gydF4y2Ba(p1)和TransBacgydF4y2Ba27gydF4y2Ba(p2)过表达库根据其平均z-score差值按百分位数排序，从低iptg诱导或高iptg诱导的TAC筛选中计算。不可用(NA)表示测量被标记为有问题的基因(见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)在相应的库/ iptg -浓度。Absent表示一个基因库中缺失的基因。前噬菌体和与噬菌体相关的触发基因分别用粗体和下划线表示。gydF4y2BafgydF4y2Ba，将质粒(绿色为p1/p2触发基因)偶联gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带p-empty, p-retron, p-retron-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba，或p-gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba．384个转偶联物菌落阵列被固定在含有适当抗生素、阿拉伯糖和IPTG浓度的LB板上(这里显示的是效果最强的IPTG浓度)。y轴表示每个质粒的触发程度，以菌株的菌落不透明度比(p-retron-Δ)来衡量gydF4y2BarcaT +gydF4y2BaP1 /p2-trigger)除以(p-retron + P1 /p2-trigger)。p1-对照值通过测量相同的菌落不透明度比来获得，p1-阻滞剂基因(gydF4y2BangydF4y2Ba= 72 - 36个生物x2技术重复)，作为阴性对照。比率由gydF4y2BangydF4y2Ba=gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- p1-触发基因5个生物x2技术重复(p1-除外)gydF4y2BayfbOgydF4y2Ba；gydF4y2BangydF4y2Ba=gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- 4个生物x2技术重复)，并从gydF4y2BangydF4y2Ba=gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- p2触发基因的12个生物x2技术重复。携带p1/p2触发质粒的菌株的代表性菌落如下图所示。水平线表示平均适应度比，误差条表示标准偏差。p1-对照适应度数据用灰色和p1-表示gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba分别绘制，以避免压缩其余触发基因的分数。gydF4y2BaggydF4y2Ba，结合供体菌株的质粒(绿色为p1/p2-触发基因，p1-empty/p2-empty)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带质粒p-retron-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba和p-retron。转偶联物在LB中与适当的抗生素一起培养5小时，连续稀释，在含有抗生素、阿拉伯糖和IPTG(无IPTG，低或高)的LB板上标记，37℃孵育。触发器通过激活RcaT来抑制生长，触发取决于诱导水平。gydF4y2Ba
扩展数据图8 TIC高iptg、重现性、命中热图和验证。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba， TIC是高iptg诱导的结果。实验如图所示。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba，但用低iptg质粒库诱导MOB (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba；p1)gydF4y2Ba26gydF4y2Ba及TransBac (gydF4y2BabgydF4y2Ba；p2)gydF4y2Ba27gydF4y2Ba．前噬菌体基因折叠富集(FE)gydF4y2BapgydF4y2Ba值(单尾费雪精确检验)显示在顶部。gydF4y2BayfbOgydF4y2Ba被选为阻滞剂，尽管没有超过临界值，由于基因与gydF4y2BayfbNgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba，对照板和实验板的TIC再现性-如扩展数据图所示。gydF4y2Ba7 c, dgydF4y2Ba．蓝色的点对应面板上显示的点击量gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba在无花果中。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba．gydF4y2BaegydF4y2Ba，跨过表达式库识别的阻塞器的非参数比较-如扩展数据图所示。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba．gydF4y2BafgydF4y2Ba，将质粒(蓝色为p1-blocker基因，黑色为p1-empty)偶联到gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带p-empty, p-retron, p-retron-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba，或p-gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba．384个转偶联物菌落阵列被固定在含有适当抗生素、阿拉伯糖和IPTG浓度的LB板上(这里显示的是效果最强的IPTG浓度)。y轴表示每个质粒的阻断程度，用携带不同阻断剂的菌株(p-gydF4y2BarcaT +gydF4y2Bap1-阻滞剂)除以携带触发质粒(p-gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba+ p1-trigger)，作为阴性对照。适应度比率由gydF4y2BangydF4y2Ba= 8 - 4个生物X 2个技术重复。p1触发的平均群体不透明度由gydF4y2BangydF4y2Ba= 110 - 55个生物x2个技术重复。下图所示为携带p1阻断剂质粒的菌株的代表菌落。水平线表示平均适应度比，误差条表示标准偏差。p1-对照适应度数据显示为灰色(不含任何阻滞剂的RcaT完全毒性)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，偶联供体菌株的质粒(蓝色为p1/p2-blocker基因，p1-empty/p2-empty)偶联gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带质粒p-gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba或者p1空质粒。转共轭物如扩展数据图所示生长。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba．阻滞剂以剂量依赖的方式特异性缓解rcat介导的毒性。gydF4y2Ba
图9 dam介导的retron-TA触发。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba、细菌和噬菌体gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba同源物触发Retron-Sen2。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带p-retron的组合-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba， p-retron, p1-gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba电子商务gydF4y2Bap1 -gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTmgydF4y2Bap1 -gydF4y2Ba大坝gydF4y2BaP1gydF4y2Ba和p1-empty，在添加适当抗生素的LB中培养5 h，连续稀释，在添加抗生素、加/不加阿拉伯糖和IPTG(低)的LB板上染色，37°C孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，噬菌体P1gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba引发染色体Retron-Eco9gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaNILS-16。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaNILS-16 WT和ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba- eco9菌株携带p2-质粒gydF4y2Ba大坝gydF4y2BaP1gydF4y2Ba或p2-空，在lb -湿霉素中培养5小时，连续稀释，在lb -湿霉素板上斑点，加或不加IPTG, 37°C孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，噬菌体P1坝表达水平与p2-相当gydF4y2Ba大坝gydF4y2BaP1gydF4y2Ba质粒。一个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113ΔgydF4y2Ba花边gydF4y2Ba携带空质粒的菌株被噬菌体P1感染gydF4y2Ba梵gydF4y2Ba(MOI 2) 0、5或35分钟(未感染、早期和晚期感染)。同样的菌株，但是携带了一个表达Dam的单拷贝载体gydF4y2BaP1gydF4y2Ba在LB中培养，用60 μM的IPTG诱导质粒。大坝的水位gydF4y2BaP1gydF4y2Ba蛋白用蛋白质组学(TMT标记)和Dam进行定量gydF4y2BaP1gydF4y2Ba比较噬菌体感染和质粒诱导的数量(x轴)。噬菌体感染或大坝gydF4y2BaP1gydF4y2Ba诱导不改变内源Dam的表达(表SgydF4y2Ba7 gydF4y2Ba)，其序列多样性足以与Dam区分开gydF4y2BaP1gydF4y2Ba(大坝39%相同的266/754残基大坝gydF4y2BaP1gydF4y2Ba) (gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2BadgydF4y2Ba《大坝》gydF4y2BaP1gydF4y2BaP1产生的蛋白质水平gydF4y2Ba梵gydF4y2Ba足以触发Retron-Eco9。与图b相同的菌株在37℃lb -潮霉素中用IPTG (0 - 1000 μM)培养，诱导后8 h测定其光密度，并与Δ进行适合度比较gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-Eco9菌株(x轴)。垂直线表示平均适应度比，水平线表示标准偏差(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BaegydF4y2Ba水坝过表达不影响msDNA水平。msDNA从gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm携带p-retron质粒组合-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Bap1 -gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba，或p1-empty。质粒与阿拉伯糖和IPTG共诱导(低)。提取的msDNA在tbe -聚丙烯酰胺凝胶中电泳(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4生物学)。gydF4y2BafgydF4y2Ba， RcaT在p-retrongydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba是功能。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba携带p-retron质粒组合的菌株gydF4y2BaWTgydF4y2Ba, p-retrongydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Bap1 -gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba， p1-empty，如面板a (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BaggydF4y2Ba, p-retrongydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba产生与野生型retron相同水平的msDNA。msDNA从gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm菌株携带p-retrongydF4y2BaWTgydF4y2Ba或p-retrongydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba．提取的msDNA在tbe -聚丙烯酰胺凝胶中电泳(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2Ba
扩展数据图10gydF4y2BaracCgydF4y2Ba-gydF4y2Ba衰退gydF4y2Ba是一个阻滞剂触发基因对。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， RecE触发Retron-Eco9。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带p-retron- eco9质粒组合，p-retron-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-Eco9 p1 -gydF4y2Ba衰退gydF4y2Ba，和p1-empty，在添加适当抗生素的LB中培养5 h，连续稀释，用抗生素、阿拉伯糖和IPTG(低)在LB板上染色，37°C孵育(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， RecE降解成熟和未成熟的msDNAgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．msDNA从gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm株(WT，或ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba)携带质粒p-retron-ΔgydF4y2BarcaTgydF4y2Ba．msDNA提取液与重组RecE孵育(见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)，并在tbe -聚丙烯酰胺凝胶(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， RacC阻断RcaT-Eco9。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBW25113携带p-质粒组合gydF4y2BarcaTgydF4y2Ba-Eco9 p1 -gydF4y2BaracCgydF4y2Ba，和p1-empty，在不同IPTG浓度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3生物学)。gydF4y2BadgydF4y2BaRacC阻断内源性冷敏感性gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm反转录酶抗毒素缺失。gydF4y2Ba年代gydF4y2BaTm株(WT， ΔgydF4y2BarrtTgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BaxseAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BarnhAgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BamsrmsdgydF4y2Ba)携带质粒p1-gydF4y2BaracCgydF4y2Ba或者空向量被生长并被标记，如面板a (gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生物学)。gydF4y2Ba
扩展数据图11图中的噬菌体防御实验数据gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
pSC101载体中含重子菌株的生长曲线(3-5拷贝/细胞gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba)在其原生启动子或空载体的控制下(见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba）;gydF4y2BangydF4y2Ba每个面板= 2个生物:a(37°C)和b(25°C)。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
RcaT域的结构相似度搜索。gydF4y2Ba
补充表2gydF4y2Ba
RcaT和RT亲和纯化蛋白质组学数据。gydF4y2Ba
补充表3gydF4y2Ba
RcaT和RT系统发育树来源数据。gydF4y2Ba
补充表4gydF4y2Ba
TAC-TIC命中基因中前体基因的富集。gydF4y2Ba
补充表5gydF4y2Ba
原始和处理过的TAC-TIC健康数据。gydF4y2Ba
补充表6gydF4y2Ba
触发基因和阻断基因的功能描述。gydF4y2Ba
补充表7gydF4y2Ba
噬菌体P1gydF4y2Ba梵gydF4y2Ba蛋白质组学。gydF4y2Ba
补充表8gydF4y2Ba
本研究中使用的菌株、质粒和引物。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
根据与作者或其他权利持有人签订的出版协议，《自然》杂志或其许可方对本文拥有独家权利;作者对这篇文章接受的手稿版本的自我存档仅受此类出版协议的条款和适用法律的约束。gydF4y2Ba
关于本文gydF4y2Ba
引用本文gydF4y2Ba
Bobonis, J.， Mitosch, K.， Mateus, A.。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba细菌重激子编码噬菌体防御三方毒素-抗毒素系统。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba609gydF4y2Ba， 144-150(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05091-4gydF4y2Ba
收到了gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
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发表gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586-022-05091-4gydF4y2Ba
这篇文章被引用gydF4y2Ba
大肠杆菌Ec86 retron复合物的Cryo-EM结构揭示了结构和防御机制gydF4y2Ba
微生物学性质gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
病毒衣壳蛋白直接激活细菌固有免疫系统gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
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