古风陪护引子毛里自隐成超弹性之字形弹簧gydF4y2Ba

黏附菌毛，或称毛毛，是介导细菌感染和生物膜形成的毛发状表面附属物。在革兰氏阴性菌中，大多数粘附菌毛是由蛋白质亚基通过伴侣-引子途径(CUP)组装而成的。gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．CUPs被细分为三组，包括六个主要的系统发育分支:另类(α-fimbriae)，经典(β-， γ-， κ-和π-fimbriae)和古老(σ-fimbriae)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．研究得最好的经典CUPs包括具有尖端粘连素亚基的刚性菌毛(如P和1型菌毛)以及已知起多粘连素作用的较薄的柔性菌毛(如Saf, Psa和F4)gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba}．尽管经典的和替代的CUPs仅限于β-和γ-变形菌门，但古老的CUPs更为普遍，存在于广泛的门中gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．古老的CUPs是很有希望的疫苗和药物靶点，因为它们广泛分布在最棘手的病原体中，包括全耐药病原体gydF4y2Ba答:baumanniigydF4y2Ba和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

致密生物膜的形成是生物的基本特征gydF4y2Ba答:baumanniigydF4y2Ba作为一种医院病原体，因为它适合在表面生存和持久性gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．这种生物膜的形成是由通过古老的伴侣-引子Csu - csud途径组装的Csu菌毛介导的gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba．Csu菌毛包括形成菌毛棒的主要亚基CsuA/B，适配器亚基CsuA和CsuB，以及通过暴露的疏水指状环与各种基质结合的双结构域尖端粘附素CsuEgydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．形成棒状的CsuA/B亚基偏离了标准的Ig-fold，采用了不同寻常的结构，从β-sheet中突出两个突出的发夹A ' -A″和B - B 'gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．这种双发夹结构是古代杯子所特有的gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．此外，与传统和替代CUPs的厚而硬的纤维相比，Csu霹雳纤维出奇地薄gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba这表明了一种本质上不同的菌毛结构。经典的CUP刚性菌毛通过填充到厚的中空螺旋管中形成四元结构gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}可以拉长和放松，以抵抗强烈的冲洗流动gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．古菌毛的分子结构和生物力学性质尚不清楚。因此，我们试图使用冷冻电子显微镜(cryo-EM)获得Csu毛杆的结构，并使用光镊测量Csu毛杆的力延伸响应。gydF4y2Ba

低温电镜显微照片显示毛毛又细又长，但非常坚硬(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.Csu杆的结构确定为3.4的总体分辨率Å(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.Csu菌毛是一种细长的(约23 Å)左旋纤维，呈螺旋状上升(gydF4y2BazgydF4y2Ba)的28.0 Å和子单元之间的旋转(gydF4y2BaφgydF4y2Ba−153°(图;gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba）.毛突相对于螺旋轴倾斜约60°，彼此倾斜约69°，侧投影时毛突呈锯齿状。这种建筑与传统的传统建筑有本质上的不同gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba）.值得注意的是，在Csu棒材中，每个亚单位的螺旋上升比P菌体长3倍(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba）.因此，古老的组合似乎更经济，Csu毛蕊在相同的毛蕊合并速度下，预计其长度增长速度是P毛蕊的三倍。gydF4y2Ba

与它们的经典对应物相反，Csu棒中的亚基不是通过一个，而是通过两个结合机制连接在一起。首先，即将到来的CsuA/BgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}pilin亚基插入其供体链GdgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}进入前CsuA/B的疏水槽gydF4y2Ba^NgydF4y2Ba亚基(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这与其他CUPs中的供体链互补(DSC)相似gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}．第二种结合机制是古代系统特有的，包括一个A ' -A '， B - B '双发夹，从CsuA/B的一侧像手臂一样突出。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在菌毛中，CsuA/BgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}不仅提供GdgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}CsuA / BgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba，而且还将其A ' -A "发卡插入CsuA/B的口袋gydF4y2Ba^NgydF4y2Baβ-链B和E2与环D-D '(图;gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba）.此外，GdgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 2gydF4y2Ba}第三亚单位CsuA/BgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 2gydF4y2Ba}与CsuA/B互补gydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}通过其突出的n端与CsuA/B中的β-链A”和B结合gydF4y2Ba^NgydF4y2Ba．因此,CsuA / BgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba牢固地固定在CsuA/B的两个延伸表面之间gydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}- gdgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 2gydF4y2Ba}模块(图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba):一个来自A ' A "发夹(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba(洋红色))，另一个来自Gd的n端部分gydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 2gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba(橙色))。最后，CsuA/B中β- A链和A - A '环的残基gydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba+ 1gydF4y2Ba}在CsuA/B底部的A " -B环中与残基形成若干接触gydF4y2Ba^NgydF4y2Ba，从而将两个主要的绑定位点连接起来，形成连续的600个Å的绑定面gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba有41个相互作用残基和13个氢键(图;gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.聚类接触提供了近三分之一的相互作用表面(32%)和氢键网络(31%)。gydF4y2Ba

Gd和绒毛球状结构域之间的连接器是柔性的，但a’-A”发夹和Gd N末端限制了绒毛的旋转为上下运动(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.因此，锚定接触赋予了菌毛刚性，并决定了在锚定形成或菌毛拉伸过程中亚单位运动的轨迹(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

使用光镊力谱法对单个Csu菌毛的生物力学特性进行了检测(试验示意图见扩展数据图)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.正如我们之前的生物膜定量表明，Csu菌毛有效地结合聚苯乙烯使用指尖手指gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba，我们使用聚苯乙烯微珠作为探针珠进行测量。在进行这些测量之前，我们用探针珠摩擦缺乏菌毛的细胞表面，以确认没有来自膜系索的力响应。没有一个控制单元显示任何系绳(扩展数据图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.因此，我们可以评估扩展下的Csu力响应(黑色曲线)，其中包括先前报道的刚性经典P pili的三个区域gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.最初，力随杆的拉伸线性增加，表示杆的弹性拉伸(区域I)，然后，力随杆的拉伸不变(区域II)，该区域被解释为杆的四阶螺旋构象的有序展开。因此，在Csu霹雳，它应该对应于一个线性化之字形灯丝。最后，力再次线性增加，并转移到表示弹性拉伸的s型曲线，并且可能是柱状结构的变化(区域III)gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．当反转运动并允许毛束后退时，古典和古代毛束显示出本质上不同的收缩反应。先前的研究表明，刚性经典的CUP菌毛表现出与恢复螺旋结构所需的菌毛松弛相关的力下降gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．相比之下，Csu菌毛的收缩响应(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(紫色曲线))完美地跟踪了延伸，让人想起形状记忆金属在受到外部应力变形后恢复原始形状。因此，古老的Csu菌毛就像一个超弹性的分子之字形弹簧。gydF4y2Ba

通过拟合一个可扩展的蠕虫状链模型(考虑了熵弯曲波动和焓拉伸)来分析区域I的力响应，揭示了Csu pili的持续长度为0.89±0.17µm，拉伸模量为870±120 pN(平均值±s.d)，表明该结构具有高刚度(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;拟合区域I的可扩展虫状链示例示于扩展数据图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba）.利用持续长度和拉伸模量，计算了区域I的毛弹簧常数和抗弯刚度(弯曲刚度;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

值得注意的是，区域II的平均长度与平均菌毛的估计长度相同(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.因此，Csu之字形长丝可逆地展开成正好是其长度两倍的线性构象。这种近乎整数的延伸率(2.01)也在建模中被揭示出来，这是毛状结构的特殊几何结构的结果:打开锁扣将毛状结构的倾斜从大约60°改变为大约0°或从余弦gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba0.5gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba1(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.Csu之字形灯丝的延展性不如螺旋管，如P菌毛，它可以展开到原始长度的六倍左右gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．然而，Csu菌毛可以在更高的力下被进一步拉伸(区域III)。在P菌毛中，这一过程与杆亚基中α-螺旋的展开和亚基的拉伸有关gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba表明在这些力作用下，CsuA/B可能发生较大的构象变化。gydF4y2Ba

打开压紧触点所需的平均力类似于许多紧密填充的螺旋管束的unwind力gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.这一显著的巧合表明，这两种不同的结构都进化为适应相似的剪切力。然而，Csu霹雳比古典霹雳更有活力。而经典的1型毛筒在放卷速度大于0.006 μm s时，其放卷力迅速增大gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，导致力在0.1µm s时增加了20 pNgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(ref。gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba)，在20 μ s范围内，Csu菌毛的力响应基本不变gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，仅增加约5个pN(扩展数据图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba）.Csu之字形长丝对拉伸力的快速响应可能是由于其线性化的四元结构，其中子单元只与最近的邻居相互作用。相比之下，在P菌毛的螺旋管中，每个菌毛与其他10个亚基相互作用，这大大降低了unwind速率，限制了响应流体流速突然变化或波动的能力gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．因此，古老的之字形细丝可以潜在地介导湍流环境中的细菌附着。gydF4y2Ba

考虑到钉钉的相互作用面积较大，我们假设钉钉或其形成可能具有附加功能，并通过诱变评估其在毛毛稳定性、组装和分泌中的作用。首先，我们替换了a’a”发卡的大部分(残基TEGNMN;扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)加上一个甘氨酸(Δ6;扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.自补型CsuA/B亚基(CsuA/Bsc) Δ6突变体的表达水平和热稳定性与野生型CsuA/Bsc相似(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.此外，缺失对CsuA/B聚合物在周质中的无引子组装没有影响(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba）.然而，Δ6突变完全消除了细胞表面毛的表达，这可以通过两种细胞相关毛的成像观察到。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和表面剪切菌毛(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，提示该缺失破坏了通过usher通道的菌毛易位。同样，A’-A”发夹内较短的缺失(MN到G, QTE到G, EGNM到G)不影响亚基的稳定性或组装，但阻止了毛的分泌(扩展数据表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.B-B '发夹(AAT到G)的缺失实际上也消除了分泌，尽管它与邻近的毛尖没有直接接触。这一结果强调了它在维持A’A”发夹的结合能力构象中的作用。D-D’环(AART到G, AAR到G, ART到GG)的缺失构成了a’-A”发夹受体位点的主要部分，类似地阻止了Csu菌群的表面表达，尽管它们也显著降低了亚基稳定性，导致无引物组装效率较低。与缺失突变体相比，在同一区域的残基取代表现出更高的稳定性，但在细胞表面没有毛(Tyr99Ala/Ser)或只有非常少量的毛状物质(Arg104Ala)。此外，除部分埋藏的Met27外，A’-A”发夹和受体位点的关键残基(Asn28、Asn26、Gly25和Ala103)的取代取消或严重抑制了分泌，只允许在一些细菌上组装少数毛状结构。与EM和原子力显微镜(AFM)成像数据一致，使用western blotting对热分离(表面剪切)WT和met27突变体的菌毛进行分析，发现了一条厚厚的CsuA/B条带，而在其他突变体的表面剪切菌毛中没有检测到CsuA/B，或检测到CsuA/B数量减少。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba）.Csu菌毛为细菌提供了强大的“降落伞效应”，这是菌毛细胞抵抗沉淀的一种特有能力，这是对菌毛分泌的额外控制(扩展数据图)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba）.正如预期的那样，除了Met27Ala外，所有的螯合突变要么大幅降低(Arg104Cys和更大程度上的Val2Ala)，要么基本上消除了降落伞效应，这进一步表明了螯合接触在菌毛分泌中的作用。gydF4y2Ba

值得注意的是，突变并没有阻止生物膜的形成(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)，尽管它们使生物膜更容易受到抗尖端(抗csue n端结构域(NTD))抗体的抑制。与这一发现相一致的是，我们用Eu在突变菌表面检测到了CsuE尖端亚基gydF4y2Ba^{3 +gydF4y2Ba}-标记抗尖端抗体(扩展数据图。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba）.这一结果表明，由CsuA、CsuB和csue亚基组成的某种形式的短毛毛或尖端纤原体仍可能在细胞表面组装并出现指尖附着位点。值得注意的是，观察到由这些短结构介导的生物膜更容易受到抗尖端抗体的抑制，这表明最佳的附着需要毛杆的参与。这表明生物力学性质或细菌细胞间杆介导的相互作用可能在这一过程中发挥作用，促进了这一课题的研究。gydF4y2Ba

为了研究Gd N末端在键合形成中的作用，我们用丙氨酸取代了介导相互作用的绒毛之间重要疏水接触的val2。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.突变耐受性良好，不影响组装，但导致非典型的短毛(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.Val2Ala菌毛的力延伸响应在形状上与WT菌毛相似，但在所有三个延伸区域都要短得多(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.7倍短的展开区域II表明Val2Ala菌毛比WT菌毛短7倍(表2gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.此外，突变受损的触点的打开需要更低的张力。因此，这种突变提供了一个中间案例，表明分泌菌毛的长度与握紧接触的强度呈正相关。Arg104Cys突变体代表了另一种有趣的中间情况。尽管突变Arg104Cys显著减少了表面毛毛的总数，但与受突变影响的其他毛毛相比，这些毛毛更长，并介导了更强的降落伞效应(扩展数据图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba）.Arg104Cys菌毛的力-伸展曲线与WT菌毛相似，但其展开力明显较低，区域II较短(表104cys)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba）.因此，在Val2Ala的情况下，这种突变对紧合接触的紧密性和第四系菌毛结构的长度都有负面影响。综上所述，螯合的形成与菌毛杆的分泌有关，是Csu菌毛在细胞表面高效表达的必要条件。gydF4y2Ba

为了了解锁结形成如何促进分泌，我们基于Csu系统和经典CUPs的可用结构对组装-分泌过程进行了建模(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.即将到来的csu - csua /B预装配综合体gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba被吸收到引子NTD上，而生长的毛状体的伴染色体基(由Sub1-Sub2-Sub3片段表示)位于引子c端结构域CTD1和CTD2gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}(图1-2步骤gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.伴侣结合Sub4的Gd取代了GgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba通过供体链交换(DSE)将碱基伴侣链连接到Sub4和Sub3gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．DSE导致Sub3的完全折叠并形成A ' -A '和B-B '发夹gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．然而，由于Sub2进入了狭窄的引子通道，伴随子结合的Sub4只是部分折叠，并且缺少自己的双发夹，因此Sub3不能与其相邻的亚基形成键合接触gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．细胞表面的亚基Sub1和Sub2之间只能形成键合接触(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba(步骤3))。因此，双发夹的形成不是在DSE之前，而是在DSE之后，有三个目的。首先，它提供了一个额外的折叠潜力来驱动组装gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．其次，它可以防止过早的亚基附着，从而使纤维保持分泌所需的细长结构。最后，它使亚基易位后立即形成第四纪结构。gydF4y2Ba

分泌步骤包括将碱基从NTD切换到ctd。这种转换似乎不是由碱基与CTDs的结合所驱动的，因为碱基与CTDs之间既没有重要的疏水作用，也没有亲和作用(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)，质疑驱动CUPs分泌的力量和能量的起源。FimD引子NTD最近被证明可以护送基地，直到它到达ctd，并与CTD2形成相互作用，这可能有助于基地从NTD释放gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．我们的研究结果表明，第四系结构的形成极大地促进了毛杆的分泌，代表了另一种驱动力。由于形成单个钉结会使纤维长度恰好减少一个绒毛的长度，因此钉结的形成可能会主动地将亚基拉到细胞表面，而不会在每个周期中引入它们的位置变化(扩展数据图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.此外，锁扣的形成可能会防止分泌步骤的倒退，这可能会导致底座在从NTD释放后从引子上滑落，永久堵塞组件(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba）.未来对CsuD引子组装-分泌机制的结构研究将有助于验证这些假设。gydF4y2Ba

基于搭扣dsc的之字形灯丝可能是最早、应用最广泛的通过CUP组装的灯丝结构。这种经济的设计使毛杆具有惊人的高机械稳定性，快速的动态性能和超弹性。毛毛分泌过程涉及到一种优雅的机制，只允许在细胞表面形成固定(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba）.因此，与伴侣蛋白保留亚基的折叠能量以驱动毛的组装类似，usher抑制第四系结构的形成，保留亚基间接触的能量以通过膜驱动毛的分泌。值得注意的是，经典CUP亚基的聚合物可以很容易地采用古代菌毛的之字形纤维结构(扩展数据图)。gydF4y2Ba9罪犯gydF4y2Ba)，这表明两种菌毛在到达最终第四纪结构形成阶段之前可能遵循相似的保守分泌途径。因此，不能排除刚性螺旋菌毛的分泌可能部分由亚基间的中间接触驱动，而不是最终的亚基间接触，这一课题值得进一步研究。更灵活的聚胶菌毛的分泌过程以及尖端纤原纤维结构也不清楚。它可能涉及较弱的四元相互作用，缺乏高分辨率的表征。阐明无处不在的古生菌毛的结构和组装-分泌过程将为开发抗持续性细菌感染的附着形成抑制剂铺平道路。gydF4y2Ba

细菌菌株和质粒gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2Ba用菌株DH5α进行质粒繁殖。蛋白表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21-AI (FgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba经济新闻gydF4y2BaTgydF4y2BahsdgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_BgydF4y2Ba(右gydF4y2Ba_BgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_BgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)gydF4y2Ba加gydF4y2Ba扩张型心肌病gydF4y2BaaragydF4y2BaB:: T7RNAP -gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba一个;英杰公司)。基于pBAD-Csu(A/B)ABCDE构建表达质粒gydF4y2Ba^7gydF4y2BapET101-6HCsuA / BdscgydF4y2Ba^8gydF4y2Ba和pET101-CsuC6H-CsuA / BgydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．用反PCR法产生缺失和替换。被删除的密码子被精确地使用一对对应于被删除序列下游的意义链或上游的互补链的引物删除。为了产生插入和替换，寡核苷酸被设计成分别包含额外的核苷酸或核苷酸变化。扩增片段经DpnI处理，纯化后钝端自结扎后转化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α。为了在pBAD-Csu中引入突变，首先将质粒的NotI - SpeI片段亚克隆到pGEM5、pSP72或pBluescript载体中，通过PCR产生突变，然后利用NotI和SpeI酶将pBAD-Csu中的原序列替换为突变片段。通过中间结构和最终结构的测序确认突变。在补充表中提供了寡核苷酸和生成质粒的列表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

蛋白表达及纯化gydF4y2Ba

WT和突变体CsuA/B与CsuC伴侣蛋白共表达，携带一个c端HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签，在周围gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba含有pET101-CsuC6H-CsuA/B-##质粒系列(补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.WT和突变体CsuA/Bsc均表达于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba含有pET101-6HCsuA/Bdsc-##质粒系列(补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.如前所述，通过渗透休克获得质周组分gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．简而言之，球团细胞在20 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA的20% (w/v)蔗糖中重悬。在冰上孵育10分钟后，通过离心收集细胞(7000gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟)，小心地重新悬浮在冰冷的5毫米MgSO中gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba．细胞在7000度时再次成粒gydF4y2BaggydF4y2Ba静置15分钟，收集上清液(即质周部分)。WT和突变体CsuCgydF4y2Ba_{His6gydF4y2Ba}——(CsuA / B)gydF4y2Ba_ngydF4y2Ba通过镍螯合色谱从周质中纯化络合物，基本上如上所述gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．WT和突变体CsuA/BscgydF4y2Ba_{His6gydF4y2Ba}如前所述，通过镍螯合色谱纯化gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba，对20 mM双- tris丙烷进行透析，pH值9.0，并在Mono Q 5/50GL柱上通过阴离子交换层析进一步纯化(GE Healthcare)。对于圆二色测量，使用PD-10脱盐柱将缓冲液交换为12.5 mM磷酸钾，pH值为7.0 (GE Healthcare)。使用NanoDrop 2000分光光度计(赛默飞世尔科学公司)测量蛋白质浓度。gydF4y2Ba

为了表达Csu缘毛的WT和突变变体，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba将抗氨苄西林pBAD- csu (pBAD-(CsuA/B)ABCDE)及其衍生物转化BL-21-AI细胞(补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.选择克隆在添加100 μg ml的Luria-Bertani (LB)培养基中培养gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄西林于37℃过夜，用1:400稀释后的含80-100 μg ml的LB培养基刷新gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素。细胞在37℃下生长到600 nm光密度0.8-1.0，然后用0.2%进行诱导gydF4y2BalgydF4y2Ba(+)-阿拉伯糖蛋白表达，并进一步培养2.5小时。细胞通过两轮5000℃离心收集gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟，7000gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。细菌颗粒在0.5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 75 mM NaCl中重悬，在65°C下孵育1 h。孵育后，细菌通过两轮9,500的离心制成颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。仔细收集含有分离Csu菌毛的上清液，并在4°C保存后进行分析。在低温电镜分析前，采用负染透射电镜对制剂质量进行评价。gydF4y2Ba

纯化菌毛的EM阴性染色分析gydF4y2Ba

将纯化的Csu菌毛涂抹在formvar涂层的发光放电金网格(琼脂科学)上，孵育1分钟。将多余的样品吸干后，用两滴水冲洗网格，再次吸干，然后用2%的乙酸铀酰染色。图像是在80kv的JEM-1400 Plus透射电子显微镜(JEOL)上获得的。gydF4y2Ba

低温电子显微镜gydF4y2Ba

含有分离的Csu菌毛的上清液浓缩至约10 g lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}使用分子质量截断为100 kDa的Vivaspin设备(Sartorius Stedim)。然后，4 μ l样品被应用到发光放电的Quantifoil R2/2 300目铜网格涂有超薄碳(电子显微镜科学)。在4°C和100%湿度下，使用Vitrobot Mark IV(赛默飞世尔科学公司)将网格吸干并浸入液态乙烷中冷冻。数据采集于300 kV Titan Krios电子显微镜(Thermo Fisher Scientific)上，配有Gatan K3直接电子探测器，操作在超分辨率模式下，像素大小为0.433 Å，离焦范围为−1.0至−3.0 μm。每个Å的总剂量为60个电子，并在40帧中平均分配，以考虑剂量加权。SerialEM (v.3.6)用于自动冷冻电镜数据收集。冷冻电镜数据收集的详细情况汇总在补充表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．Csu菌毛的典型冷冻电镜显微照片见补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

低温电镜图像处理和重建gydF4y2Ba

使用MotionCor2 (v.1.2.3)对剂量分割的视频帧进行波束诱导运动校正。gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba．使用CTFFIND (v.4.1.13)估计CTF。在RELION (v.3.0.8)中进行图像处理和螺旋重建gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．在EMAN 2中使用e2helixboxer程序从602张选定的显微照片中手动挑选细丝gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba进行二维分类，生成自动选择模板。螺旋细丝自吸后，以400像素的盒大小提取出480064个片段。经过2D和3D分类步骤后，使用255,833个片段进行3D细化。这些片段被重新缩放到1.35 Å的像素大小。利用RELION (v.3.0.8)中的随机梯度下降算法，从二维粒子从头生成重建的起始模型。螺旋对称参数使用传统的傅里叶-贝塞尔分析以及SPRING (v.0.86)中的segclassconstruct和seggridexplore模块进行估计。gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．螺旋参数的初始估计(−157°螺旋扭曲，26.3 Å螺旋上升)使用搜索范围- 150°至−165°的扭曲和26 Å至30 Å的上升进行测试。螺旋对称(−153°螺旋扭曲，28 Å螺旋上升)在高分辨率3D细化过程中应用和细化，生成分辨率为6.18 Å的地图。应用软蒙版与凸起的余弦边缘14像素和gydF4y2BaBgydF4y2Ba-因子锐化产生了一个全局分辨率为4.8 Å的地图，通过使用独立细化的半重建之间的金标准傅里叶壳相关程序进行评估(FSC 0.143)gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．经过两次贝叶斯抛光，然后进行3D细化和后处理，分辨率进一步提高到3.42 Å。最终的图谱显示了清晰的β链分离和大体积侧链的密度，与报道的分辨率一致。来自RELION的cryo-EM地图的像素大小略有偏差，通过使用UCSF Chimera包中的Fit in map工具计算不同体素大小的地图的相互相关系数值的范围调整为1.2949 Å (v.1.15)gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

模型构建和细化gydF4y2Ba

通过对CsuA/Bsc (Protein Data Bank, PDB)晶体结构的拟合，人工建立Csu菌毛的初始模型:gydF4y2Ba6 fm5gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba利用UCSF Chimera将实验电子密度转化为实验电子密度。使用Chimera Fit in Map工具调整两个亚基之间的角度，首先将三个亚基二聚体对接到地图中的相邻区域，其中一个亚基重叠，并对重叠亚基的方向求平均，然后将三个二聚体完全重叠，并对所有三个二聚体的亚基方向求平均。连接供体链与A链的短连接器使用Coot (v.0.9.4)建模。gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．通过结合Coot中的手动调整和PHENIX (v.1.8.2)中的真实空间优化，对结构进行了优化。gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．最初的四亚基模型被简化为一个具有三个供体链互补亚基(四条链)的模型，它们占据了地图中最高分辨率的位置。使用MolProbity (v.4.5.1)对模型进行验证gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba．细化统计信息在扩展数据表中给出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

AFMgydF4y2Ba

在添加氨苄西林的LB琼脂平板上培养细菌，用0.02%阿拉伯糖诱导产生菌毛。如前所述，用AFM成像带有菌毛的细菌细胞gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba做了一些修改。简单地说，将细菌细胞悬浮在100µl的milliq水中，并将10µl的悬浮液放置在新切割的云母表面(Goodfellow Cambridge)。样品在室温下孵育5分钟并吸干，然后放入干燥器中至少干燥2小时。使用Nanoscope V Multimode 8 AFM仪器(Bruker)收集图像，使用Bruker ScanAsyst模式，并使用以50-90 kHz共振频率振荡的Bruker ScanAsyst-air探头，使用Nanoscope (V .1.8)软件进行选择。根据扫描尺寸和样本数量(每张图像256或512个样本)，以0.8-1.5 Hz的扫描速率在空气中收集图像。最终的图像在两个轴上进行平面拟合，并以振幅(误差)模式呈现。gydF4y2Ba

生物膜测定和生物膜抑制gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2Ba含有pBAD-Csu或其衍生物的菌株BL21在100 mg l的LB培养基中培养过夜gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素。将5 ml新鲜培养基放入50 ml聚丙烯管中，加入100 μl过夜培养物，在37℃下剧烈震动培养2 h。稀释(100、500、1000、2500、5000、7500和10000倍)抗CsuE N末端多克隆抗体(Innovagen AB使用纯化的CsuE N末端定制生产)gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba在50 μl LB中，分成微量滴度板孔。用0.2%阿拉伯糖诱导细菌培养，150 μl重复与抗体稀释液混合在微量平板孔上。在37℃孵育2小时，轻轻摇晃。然后用300 μ l磷酸盐缓冲盐水冲洗两次井。任何剩余的生物膜用1%结晶紫染色15分钟，用水冲洗，晾干，溶解在250µl 0.2% Triton X-100中。使用96孔板光谱仪读取器测定595 nm处的光密度。使用Origin 2015 Sr软件(OriginLab)制作图。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

蛋白质在18% SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，并在Bio-Rad A缓冲液(25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM甘氨酸，20%甲醇和0.1% SDS)中转移到免疫印迹聚偏氟乙烯膜(Bio-Rad Laboratories)上，在100 V或350 mA下作用1小时。膜用5%脱脂奶在磷酸盐缓冲盐水/Tween-20中阻塞，与抗csua /B兔多克隆抗体(Innovagen AB定制)孵育gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba随后用IRDye 680rd偶联抗兔山羊抗体(Li-Cor Biosciences)孵育。使用Odyssey系统(Li-Cor Biosciences)检测蛋白带，并使用ImageJ (v.1.53k)进行量化。gydF4y2Ba

光镊测力gydF4y2Ba

为了测量Csu菌毛的生物力学特性，我们使用了一个定制的力测量光镊装置，该装置围绕一个倒置的Olympus IX71显微镜(Olympus)构建，并配备了一个水浸物(UPlanSApo60XWIR， ×60/1.2 NA;1920 × 1440像素CMOS相机(C11440-10C, Hamamatsu)gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．为了以最小的漂移量对高信噪比的力数据进行采样，我们使用了Allan方差方法来识别噪声gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．我们使用功率谱方法对131,072 Hz的微球位置进行采样，并平均32个连续数据集，每个数据集0.25 s。为了延伸一个壁束，我们以50纳米s的恒定速度移动压电台gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}并对50赫兹的力和位置进行采样。为了评估菌毛第四系结构的平均轮廓长度，我们通过反转压电阶段来屈曲菌毛，直到菌毛接触细菌细胞壁。为了估算毛毛的持续长度和拉伸模量，我们用可扩展的蠕虫状链模型拟合I区域的初始力升gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba．根据这些值，我们通过拉伸模量除以轮廓长度来计算弹簧常数，通过保持长度乘以玻尔兹曼常数(4.1 pN nm)来计算弯曲刚度(弯曲刚度)。我们通过取区域I的末端延伸与区域III的开始之间的差来计算高原长度。同样，我们通过取区域I和区域III之间区域的力的平均值来计算高原力。最后，我们使用前面概述的方法估计区域III的长度gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．所有数值均以均数±s.e.m表示。gydF4y2Ba

温度依赖性折叠转变分析gydF4y2Ba

使用Chirascan CD光谱仪(应用光物理)和110-QS大比色管(helma)测量圆二色性。在以0.150 mg ml插入目标蛋白之前，首先从缓冲液(pH 7.0时12.5 mM磷酸钾)中测量光谱背景4次gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}浓度。在195-260 nm波长范围内测量20°C的CD光谱4次，每3 s测量间隔1 nm。对于熔化光谱，蛋白质被加热4°C，温度从19°C上升到99°C。每个光谱在30 s温度稳定时间后测量一次，波长范围为195-260 nm，每次2 s测量之间间隔1 nm。所有熔化光谱的测量时间为1 h 28 min。每个频谱都被平滑了4倍。在225 nm波长下，以1°C min的速率将样品从20°C加热到99°C，记录熔点曲线gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．圆二色性测量12秒，最初每1.0°C，后来每0.5°C，误差范围为0.15°C。每段录音耗时1小时19分钟。用2 M氢氧化钾对样品间的残留蛋白进行纯化。利用Chirascan用户界面中的曲线拟合函数将熔融数据拟合到sigmoid曲线+斜率方程中。gydF4y2Ba

组装-分泌过程的建模gydF4y2Ba

基于Csu菌毛棒(本文)的冷冻电镜结构和CsuA/Bsc (PDB:gydF4y2Ba6 fm5gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^8gydF4y2Bacsu - csua /B伴侣-亚基复合物(PDB:gydF4y2Ba5 d6hgydF4y2Ba)gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．由于CsuD引子没有可用的结构，引子的模型是基于经典CU通路中的FimD引子的结构:晶体结构(PDB:gydF4y2Ba3 rfzgydF4y2Ba)gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba构象1和2的低温电镜结构(PDB编码)gydF4y2Ba6 e14灯头gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 e15gydF4y2Ba分别gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba）.Phyre2蛋白质折叠识别服务器gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba基于整个FimD(构象1)的结构自动模拟了92%的CsuD完整氨基酸序列，置信度为100.0%。根据与预组装复合物结合的NTD的晶体结构，构建了引子在毛毛分泌不同阶段的NTD模型(PDB:gydF4y2Ba1 ze3gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 b0mgydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}FimD构象的低温电镜结构。立体化学分析gydF4y2Ba傻瓜gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

所有数据均以均数±标准差表示。Csu菌毛的低温电镜图像如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba从大约100个显微照片的数据集中选择，代表了一个单一毛的典型图像。WT和Δ6突变体表面剪切菌毛材料的冷冻电镜图像是从不同放大倍率下记录的约20张显微照片的数据集中选择的。西方的污点在无花果上。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba是三个独立实验的代表。WT CsuA/Bsc熔炼三次;扩展数据图显示了一次熔化实验的CD光谱。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba．生物膜定量(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)和细胞表面的CsuE曝光(扩展数据图。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)实验进行了两次，对更小的突变体进行了几次检查。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba