AAA+ atp酶介导的RuvAB-Holliday结分支迁移机制gydF4y2Ba

同源重组是一种基本的细胞过程，涉及到遗传完整性的维护和遗传多样性的产生，跨越生命的所有领域。在基因重组、双链断裂修复和复制叉挽救过程中，中心和普遍的元素是一个被称为Holliday结的四向DNA异质双工gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba}．在原核生物中，RuvA和RuvB这两种蛋白质通过促进atp依赖性的单向链交换反应，即活性分支迁移，在Holliday连接的处理过程中发挥着关键作用gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}．先前的生物化学和结构证据表明，分支迁移是由一个三方复合体促进的:RuvA四聚体聚集在Holliday结交叉周围，为DNA分离和复卷提供结构指导，两侧是两个六聚体RuvB AAA+ atp酶，共同促进新出现的重组DNA的易位gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}．此外，这些研究表明，RuvA (RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba)结合到RuvB的显着素-1 β-发夹上，这是PS1插入超枝的一个显著特征gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}调节分支迁移，增加RuvB马达的atp酶活性gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}．此外，这种跨物种的异互补能力证实了RuvA-和RuvB AAA+协同作用机制在Holliday结合部的存在gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．尽管有大量的知识，但RuvAB-Holliday连接复合体(以下简称RuvAB-HJ)的结构和RuvB AAA+马达驱动DNA易位的分子机制促进了生物体内最基本的生物过程之一，即遗传信息的维护和交换gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}仍然是未知的。为了揭示RuvAB机械的结构和工作原理，我们应用时间分辨低温电子显微镜(cryo-EM)和单粒子分析体外重组RuvAB配合物处理Holliday结。我们的结构分析揭示了一个活跃的RuvAB分支迁移复合体高度协调的构象景观，并揭示了旋转RuvB AAA+马达中完全分解的核苷酸循环和DNA转位之间的动态相互作用。此外，我们还发现，在atp依赖的功率冲程中，RuvB马达将DNA作为分子杠杆进行转移，将化学能转换为机械力。gydF4y2Ba

在DNA重组过程中，由RuvAB机制驱动的Holliday连接的分支迁移是一个快速和高度动态的过程gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．为了使这一过程可视化，我们从来自于gydF4y2Ba鼠伤寒沙门氏菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba，并在分支迁移实验中测试了它们的功能(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．两者homo- (RuvA和RuvB fromgydF4y2Ba美国沙门氏菌感染gydF4y2Ba)和hetero- (RuvA fromgydF4y2Ba美国沙门氏菌感染gydF4y2Ba和RuvBgydF4y2Ba美国酸奶gydF4y2Ba)复合物在加入ATP后对Holliday结的处理类似，这表明由于单个组分的互换性，其潜在机制高度保守(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 a -gydF4y2Ba)．为了捕捉这个快速过程的催化步骤，我们首先用等摩尔的缓慢水解的ATPγ s混合物取代ATP来减慢反应速度gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba和ADP，并在冰上孵育反应30分钟(数据集t1)或5小时(数据集t2)，以模拟RuvAB-HJ复合物的起始和平衡阶段(扩展数据图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba)．随后的样品玻璃化导致了同质配合物的聚集和少量的单个颗粒，而异质配合物在网格上的分布很大程度上是单分散的，适合单颗粒分析(扩展数据图。gydF4y2Ba1 f jgydF4y2Ba)．RuvAB-HJ配合物的低温- em结构分辨率为8 Å，显示出高度灵活和线性排列的三方组合，8个RuvA分子对称排列在两个四聚体(3.3 Å分辨率)和四向Holliday结两侧，并与1或2个RuvB六聚体(2.9-4.1 Å分辨率)和二聚体粒子(3.9 Å分辨率)灵活连接(图4)。gydF4y2Ba1汉英gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba，gydF4y2Ba3模拟gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4 a - bgydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．该体系结构与先前提出的RuvAB机制模型一致gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}．在这两种粒子类型中，DNA以双螺旋结构进入和离开RuvA核心，一个或两个六聚体RuvB马达与重新连接的DNA的小凹槽接合(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．RuvA核心通过RuvA物理连接到两个RuvB电机gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．两边各有两个RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba结构域与相邻位置的RuvB子单元相结合，表明这些结构域能够协同控制两个RuvB AAA+电机(图1)。gydF4y2Ba1 c, egydF4y2Ba)．值得注意的是，所有四个ruvb协调的RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba域本地化到Holliday结交叉的同一侧(扩展数据图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)，意味着一个单一的RuvA四聚体可能足以同时操作两个RuvB电机。这些发现也与拟议的RuvABC解析体结构一致，其中Holliday结被一个RuvA四聚体和一个解析体RuvC的二聚体夹在中间gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了研究RuvAB-HJ配合物的柔韧性，我们对我们的粒子进行了进一步的三维分类。该分析表明，除了整体灵活性外，在约7%的二部粒子和约6%的三部粒子中，dna参与的RuvB相对于RuvA-HJ核心的位置旋转了约60°。这表明RuvB电机能够旋转，并且在完成60°旋转后，每个RuvB子单元都占据了旋转前相邻子单元的位置(图1)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．多体精细化分析进一步证明了旋转在粒子中占总柔性的45%左右(扩展数据图)。gydF4y2Ba5汉英gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，我们推断重组的RuvAB复合体具有酶活性，因此在不同的构象状态下成像。此外，我们的数据显示，之前描述的DNA底物的连续旋转gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba伴随着RuvB AAA+电机本身的旋转。gydF4y2Ba

为了理解RuvB电机的旋转与分支迁移之间的联系，我们对来自t2数据集的RuvB六聚体应用了迭代聚焦细化和严格的三维分类。该分析揭示了9个结构上不同的RuvB马达映射，分辨率在2.9到4.1之间Å(扩展数据图。gydF4y2Ba2 c, egydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3 e-ngydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．其中两个映射(在3.9和4.1 Å分辨率)无法改进到允许明确分配核苷酸的分辨率，因此没有进一步考虑。其余7个RuvB电机可以根据绑定RuvA的数量进行分组gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba，有一张地图缺少RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba(s0gydF4y2Ba^{−一gydF4y2Ba})，两张包含一个RuvA的地图gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba(s0和s1)和四张显示两界RuvA的地图gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba域(s2, s3, s4和s5)，一起表明RuvA之间的动态相互作用gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba和RuvB电机。gydF4y2Ba

所有的RuvB马达组装成封闭的，不对称的六聚体，具有大约2纳米宽的中央孔，容纳DNA(扩展数据图。gydF4y2Ba3 e mgydF4y2Ba)．与之前的结构和相互作用研究一致，RuvB的寡聚是由大的(RuvBgydF4y2Ba^lgydF4y2Ba)和小的(RuvBgydF4y2Ba^{年代gydF4y2Ba})相邻亚基的atp酶结构域gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba4汉英gydF4y2Ba)．类似于其他AAA+易位酶gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}，四个RuvB子单元(A, B, C和D)一起组装成一个“螺旋楼梯”。这产生了一个连续的界面，主要结合两个DNA链中的一个(图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)，强调每个进入RuvA核心的双链DNA中只有一条链是由一个RuvB马达控制的(扩展数据图。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)．剩下的两个RuvB亚基(E和F)关闭了螺旋阶梯，但不与DNA结合。DNA参与的亚基(A, B, C和D)通过它们的C端头结构域(RuvB)与DNA结合gydF4y2Ba^HgydF4y2Ba)．每个RuvBgydF4y2Ba^HgydF4y2Ba该结构域包含4个保守的精氨酸残基Arg291、Arg310、Arg312和Arg315，它们产生一个带正电荷的结合界面，与带负电荷的DNA主链互补(图1)。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba)．(为了便于比较gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaRuvAB系统中，相应的残基列在补充信息表中gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．来自每个亚基的精氨酸残基的重复结合模式与由两个核苷酸(大约7 Å)的距离隔开的DNA相结合。此外，由于RuvB子单元在RuvB六聚体中彼此相距约60°，这些数据进一步表明，RuvB马达的旋转与一个易位步骤中发生的事件有关。gydF4y2Ba

为了研究六聚体的整体构象可塑性，我们分析了每一个Cα原子在所有七个不同的电机结构上的变异性，表示为与相应质心距离的标准偏差(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．这表明，RuvB六聚体可分为刚性(白色)、柔性(蓝色)和中间区域。刚性区包含与dna结合的亚基B和C，而与dna分离的亚基E和F位于柔性区。值得注意的是，分别连接楼梯顶部和底部两个不等半段的dna结合亚基A和D位于中间区域，这表明六聚体内部的差异灵活性参与了ruvab介导的分支迁移。值得注意的是，变异性的程度并不一定局限于整个RuvB亚基，例如亚基A和D，它们显示出柔性和刚性区域(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．为了进一步评估单个RuvB亚基的可塑性，我们确定了42个RuvB亚基之间的平均均方根偏差(r.m.s.d)，以及它们各自的域之间:RuvBgydF4y2Ba^lgydF4y2Ba(残留21 - 181),RuvBgydF4y2Ba^{年代gydF4y2Ba}(残留182-254)和RuvBgydF4y2Ba^HgydF4y2Ba(残留255 - 330)。这一分析显示低平均r.m.s.d。(r.m.s.d。gydF4y2Ba_ØgydF4y2Ba分别为1.2 Å， 0.48 Å和0.453 Å)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，显示RuvB的整体结构gydF4y2Ba^lgydF4y2Ba, RuvBgydF4y2Ba^{年代gydF4y2Ba}和RuvBgydF4y2Ba^HgydF4y2Ba在很大程度上保持不变，但它们彼此之间的相对位置是不同的。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．六聚体内DNA底物的存在进一步使我们能够确定RuvB亚基显示出位置特定的、不同的构象，以下称为簇(簇[A]对应于RuvB中亚基A的位置，簇[B]对应于亚基B的位置，等等)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然后，我们通过测量两个二面角(gydF4y2BadgydF4y2Ba1 RuvB之间gydF4y2Ba^lgydF4y2Ba和RuvBgydF4y2Ba^{年代gydF4y2Ba},gydF4y2BadgydF4y2Ba2 RuvB之间gydF4y2Ba^{年代gydF4y2Ba}和RuvBgydF4y2Ba^HgydF4y2Ba)和一个三角形的角度，它提供了一个关于RuvB中发生的变化的更全面的视角(扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．我们发现每个RuvB簇([A]到[F])的特征是三个角度的独特组合，因此包含一组具有更相似构象的RuvB亚基(图1)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．RuvB在团簇内也会发生变形，在团簇中变化最大[E]，其中三角形角的动态范围为5.6°(图5)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．为了更好地描述RuvB六聚体这一灵活区域的运动，我们将s1到s5的5个结构与几乎不变的亚基C对齐，并分析所有其他亚基的运动(扩展数据图。gydF4y2Ba6 d-fgydF4y2Ba)．该方法揭示了簇内连续的构象变化[E]可以沿着一条平均长度约为7 Å(范围:6-10 Å)的轨迹描述，这条轨迹指向RuvA-HJ核(图1)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．值得注意的是，簇内轨迹的长度[E]很好地对应于两个核苷酸的RuvB阶梯的步长(DNA中核苷酸之间的距离约为3.5 Å)，这表明五个RuvB结构(s1到s5)可以代表一个活跃的RuvB电机通过一个易位步骤时的连续原子快照。gydF4y2Ba

为了研究观察到的RuvB六聚体构象变化与ATP水解之间的相互依赖性，我们首先分析了所有30个核苷酸结合袋的核苷酸身份和占用(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)．我们发现位于阶梯顶端的簇[A]包含ATPγS (s1和s2)， ADP + MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}(s3)或ADP (s4和s5)，这是一种与在这个口袋上进行的ATP水解反应一致的构型。在六聚体的另一侧，簇[D]包含ADP (s1)、碎片和中断密度(s2到s4)或ATPγS (s5)。碎片化和中断密度表明核苷酸占用率低，表明这些位点具有类似载脂蛋白的结构。dna结合簇[B]和[C]完全被ATPγS所占据，而dna游离簇[E]和[F]只与ADP结合(图5)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

不考虑之前在轨迹上构象变化的顺序，五种状态的核苷酸循环揭示了相同的结构态序列(s1→→s5)，从而独立验证了它们的顺序:循环从亚基D中的ADP释放(s1→s2)开始，然后在亚基a中通过三种状态(ATP→ADP + Mg)进行催化反应gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}→ADP (s2→s3→s4))，并通过亚基D (s5)吸收ATP完成(图5)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．这些数据强调了ATP水解和核苷酸交换分别发生在位于阶梯顶部[A]和底部[D]的相反簇中，并且各个步骤在时空上是分离的(图4)。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)．结构内聚需要在相对位置的亚基之间循环，以及上面描述的伴随的构象变化，这表明亚基之间有一个连锁信号链，连接核苷酸循环，最终，DNA易位。gydF4y2Ba

值得注意的是，DNA在所有五种状态下仍然与所有四个阶梯亚基(A到D)结合，因此DNA底物与这些亚基的相互作用与核苷酸结合的类型无关，包括在ATP水解(亚基A)和在交换位置(亚基D)(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．因此，我们的数据显示，为了在中央RuvB马达孔内重新定位DNA底物，RuvB亚基必须服从核苷酸周期后附加的构象变化。因此，我们推断，核苷酸周期实际上首先在五个状态上启动RuvB亚基，然后获得它们各自邻近簇的构象(扩展数据图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)．这也得到了一个事实的支持，即状态s5中的核苷酸排列与状态s1中的配置相同，但六个亚基各自的构象向前移了一个，占据了新的后续状态(s5→s1 ': A(s5)→F(s1 ')， B(s5)→A(s1 ')，等等)。当这一事件发生时，所有6个RuvB亚基同时转移到下一个构象簇，而核苷酸排列没有任何额外的变化(s5和s1 '中的亚基具有相同的核苷酸占用)，将整个六聚体的构象重置为状态s1。因此，我们把这个过程称为“集群开关”(s5→s1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．由此可见，所有后续的过程现在都发生在各自相邻的亚基中，这意味着核苷酸水解和所有其他过程都以重复的序列围绕六聚体环进行。gydF4y2Ba

为了从结构上深入了解核苷酸结合囊发生的事件，我们首先分析了它们的共同特征。核苷酸在两个连续亚基的界面结合(gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba)，核苷完全夹在RuvB之间gydF4y2Ba^{年代gydF4y2Ba}和RuvBgydF4y2Ba^lgydF4y2Ba一个子单元的定义域gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}(RuvBgydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)．在所有含atp的囊区中，一个保守的Walker-A基序与ATPγS-Mg结合gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}其中Lys65与ATP γ-磷酸盐相互作用gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba， Thr66对应MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．另外的接触点由两个保守的gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用精氨酸残基:Arg21和传感器2精氨酸Arg218gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．Arg21位于N端，与ATP α-磷酸结合，而传感器2精氨酸Arg218位于小ATP酶结构域，介导核苷酸感知(图2)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．与之前的研究一致，ATPγS-MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}反式gydF4y2Ba-传感由两个元件实现:位于α-螺旋α4上的保守特征基序(Glu127-Asp130)和gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-作用于α-螺旋α5上的Arg171gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．因此，Arg171代表典型的精氨酸指，在大多数AAA+ atp酶中被保守，并直接与γ-磷酸盐协调gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．此外，两个额外的酸性gydF4y2Ba反式-gydF4y2Ba残基，Glu128和Asp129，感觉gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba分别残基Arg21和Arg218，从而间接稳定核苷酸结合(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了了解ATP水解和信号转导耦合的分子机制和化学，我们在亚基A中跟踪ATPγ s在(s1)之前、(s2)期间和(s3-s5)水解后的命运，其核苷酸结合囊在gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba在通过催化态(s1→→s5)的过渡过程中，来自亚基F的螺旋α4和α5进行协调运动，这使得不同的局部重排成为可能gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-残基对亚基A中的ATP水解至关重要(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．特别是分子间的相互作用gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Glu128和gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Arg21在s1状态下维护，在以下状态下丢失，使能gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Glu128来代替精氨酸指gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Arg171。进一步，在状态s2，残差gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Tyr131连接gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Arg21在协调gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Asp129，一个事件的出现与连续密度之间gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Asp129和ATPγS-MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}复杂的(图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)．连接密度最好描述为有序的水分子，这是促进ATP γ-磷酸亲核攻击所必需的。这一特征母题的重要性已在突变研究中得到强调gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Asp129显著降低了分支迁移活性和突变gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Glu128导致细菌生长缺陷gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．作为对发生在s2态亚基A中的ATP水解反应的额外验证，ATP γ-磷酸盐和Walker-B基序残基之间也出现了连接密度gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Asp110，类似于gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-Asp129，已被证明对ATP水解很重要gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在接下来的状态中，可以观察到ATP水解反应的进展，它首先导致γ-磷酸(s2→s3)的释放(图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．因此，传感器的绑定2gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Arg218向核苷酸释放，而MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子通过gydF4y2Ba顺式gydF4y2BaThr66仍然完好无损(图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在下一个跃迁(s3→s4)中，Mg的损失gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子释放gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Thr66，它现在协调ADP β-磷酸盐。随后,(s4→s5)gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-传感器2的arg218离开自己的绑定口袋，标定子单元A，准备进行集群切换。gydF4y2Ba

我们观察到RuvA的特殊结合gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba在亚基A中催化中心对面的RuvB六聚体通过楼梯底部的所有状态(s1到s5)不能解释在RuvA存在时atp酶活性的增加gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．相反，它建议RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba在这样的安排中，核苷酸循环上产生了调节功能，并直接协调分支迁移。特别是，我们发现一个单一的RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba在所有五种状态下都与亚基D结合，这表明在整个核苷酸周期中，RuvA-HJ复合体在三个部分的粒子中被拴在两个相反的RuvB马达上。相比之下，第二个RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba在状态s2到s5中，与子单元E独占绑定(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．两个RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba在它们各自的RuvB亚基中结合到先前描述的疏水复合界面，该亚基由RuvB组成gydF4y2Ba^lgydF4y2Baα-螺旋α3和显子-1 β-发夹gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba)，在PS1的其他六聚体AAA+电机中直接或间接地插入超支链坐标与其基板gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}．分析了RuvA的作用gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba结合(s1→s2)到子基E表明结合事件对RuvB六聚子产生楔形作用，使子基E和d的大结构域分离gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba结合是通过诱导配合机制实现的。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．亚基E的重新定位导致亚基D的大atp酶结构域的同时移位，进而促进其核苷酸结合袋的打开，从而使ADP分子逃脱(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba10 dgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．因此，我们的数据显示RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba(结合到亚基E上)通过作用于亚基d发挥核苷酸交换因子的作用。值得注意的是，与此同时，E的重新定位引起邻近的、dna分离的亚基F的运动gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-作用残基Glu128, Asp129和Arg171促进了A中的ATP水解反应，如上所述。gydF4y2Ba3 g hgydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba10 egydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在此观察的基础上，我们假设RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba它还通过与亚基E上的存在体-1 β-发夹结合发挥作用，作为ATP酶激活域，通过前向协调的亚基间信号通路刺激A中的ATP水解。gydF4y2Ba

值得注意的是,这gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba亚基F中的-作用残基仅在Mg丢失时才与核苷酸断开gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}这反过来又允许子单元F (s4→s5)的大尺度运动(扩展数据图。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在RuvB亚基A中释放与ADP结合的亚基F会引发连锁反应，这也会影响dna分离的亚基e的位置。因此，我们的数据揭示了MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子触发了限制在柔性RuvB亚基(D, E和F)内的逆行间亚基信号传导(图)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)．作为后果之一，守门gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba亚基E的-Arg21不能再与ADP α-磷酸在其核苷酸结合口袋中协调，进而导致整个N端从口袋折叠(图。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba)．这为下一个易位步骤中ADP的释放做好了准备，当集群切换发生，亚基E已经过渡到构象集群[D]，在那里它最终受到核苷酸交换。这进一步体现在不断增加gydF4y2BadgydF4y2Ba1和聚类E中的三角形(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)，在分子水平上削弱了n端之间的疏水相互作用gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Leu20及其gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba与Thr193、Ile196、Phe197和Asn221等合作伙伴绑定。因此，不稳定gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Leu20损害的能力gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-Arg21来配合ADP α-磷酸盐(扩展数据图。gydF4y2Ba10 fgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．此外，逆行信号通路影响楼梯底部的亚基D，在状态4时达到其结合袋的最大开口，这表明尽管ADP已经在s2中释放，核苷酸交换在四个状态(s2→→s5)中进行(图4)。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba)．一个新的ATP分子(s4→s5)的获得伴随着亚基E和F的协调运动以及亚基D的大区域(以下称为“转换器”:F - E - DgydF4y2Ba^lgydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 hgydF4y2Ba)．作为这种运动的一部分，新获得的ATP分子的配位通过亚基D中的N端恢复(扩展数据图)。gydF4y2Ba10我,jgydF4y2Ba)．因此，RuvB N末端的门打开(簇[E])和门关闭(簇[D])运动可作为核苷酸循环方向性的额外证明。最后，逆行信号传导导致亚基D(大区域)成为RuvB马达中刚性区域的一部分，这标志着核苷酸循环的完成(图。gydF4y2Ba4汉英gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果表明，所有RuvB子基的构象在六聚体和转换体(F-E-DgydF4y2Ba^lgydF4y2Ba)作为一个RuvB马达操作的多域模块，在核苷酸循环过程中进行高度协调的运动。子单元E在这个模块中心的关键位置使RuvA能够绑定gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba通过亚基间信号传递信息，刺激远端亚基A中的ATP水解和邻近亚基D中的核苷酸交换(图1)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

来洞察构象变化的联系中观察到的转换器RuvB电机和DNA易位,我们调查了五个核苷酸的结构由校准周期(s5 s1)所有国家的中心转换器(亚基E)。分析表明,遵循一个连续运动轨迹转化为RuvB电动机的升降运动,单个地区的六聚体提升比例距离单元E(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这将导致DNA结合接口及其结合的DNA被从RuvA-HJ核心提升7.0 Å左右。因此，我们的数据提供了证据，RuvB马达作为分子杠杆，将整个核苷酸循环中获得的能量转化为拉力，物理上移动DNA约7.0 Å-that is，两个核苷酸，从而实现DNA重组过程中的分支迁移(图。gydF4y2Ba5罪犯gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba8gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

值得注意的是，后续的簇切换仅在核苷酸循环后重新定位RuvB六聚体(沿着DNA底物移动)，而不会对DNA施加直接的机械力，因此不会积极促进RuvA-HJ核心中的链交换(分支迁移)gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba)．随着第二个RuvA的加入，RuvB电机的变流器发生了最大的构象变化gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba(s1→s2)，伴随ADP弹射(s1→s2)和ATP摄取(s4→s5)的核苷酸交换反应，说明这两个事件对DNA易位的贡献最大(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)．与核苷酸交换相关的运动最近也被认为是26S蛋白酶体的AAA+ atp酶马达的发力步骤gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}．基于我们的发现，我们假定RuvA作为一个支点，这使得RuvB马达通过产生一个功率冲程将DNA拉过RuvA核心，从而促进分支的迁移(图1)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．总之，RuvB AAA+ atp酶马达经历了两个连续的过程(核苷酸循环和簇切换)，这两个过程既能维持DNA结构不变，又能在分支迁移过程中进行旋转。gydF4y2Ba

在对t2数据集进行结构分析的过程中，我们发现了两个附加的粒子子集，它们显示出核苷酸占用，这与上面描述的顺序核苷酸周期不一致。第一个亚群含有缺乏中心定位的RuvA寡聚体(s0gydF4y2Ba^{−一gydF4y2Ba}(扩展数据图gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．这清楚地表明，4个RuvB亚基A到D被ATPγS所占据，亚基E和F被ADP所占据(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)．值得注意的是，比密度在低密度阈值可见，表明部分存在ATPγS和MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，从而确定一个不对称形成的RuvB六聚体可以携带多达5个ATP分子(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)．另一个亚群(s0, RuvA结合)的粒子与缺少RuvA的粒子(s0, RuvA结合)具有相同的核苷酸构型gydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba})(扩展数据图gydF4y2Ba2 c, egydF4y2Ba而且gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)．因为ATP水解(s2→s3)先于核苷酸循环中新的ATP分子(s4→s5)的获得，在亚基a和D中同时存在ATP表明s0状态不是水解循环的一部分。此外，我们还注意到状态s0的转换体采用了一种混合构象，这与核苷酸周期(s1到s5)中看到的任何构象都不同(图5)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．因此，我们假设这种状态类似于尚未进入核苷酸周期的RuvB六聚体，因此必须首先经过ATP水解或交换，以采用核苷酸排列的位置和构象依赖序列，如图s1到s5状态所示。我们将这样的状态称为“初始状态”(s0)。gydF4y2Ba

为了验证这一假设，我们在相同的条件下对RuvAB-HJ粒子进行了低温em，但在体外重建后不久将样本玻璃化(在30分钟(t1数据集)而不是5小时(t2))(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba)．只有两个状态(s0gydF4y2Ba_t1gydF4y2Ba和s1gydF4y2Ba_t1gydF4y2Ba)可以从该数据集以高分辨率(3.3 Å)恢复(扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3 i ngydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．在两个t1状态下，只有一个RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba结合了RuvB六聚体中的亚基D(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)，这意味着在孵育5小时(t2)后观察到的s2到s5状态确实是由不断进行的核苷酸循环主动产生的。此外，这一发现证实了RuvAB-HJ配合物(t2)在活性支迁移过程中被玻璃化。在结构级别，状态s0gydF4y2Ba_t1gydF4y2Ba与s0 (t2)相似(图5)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 kgydF4y2Ba)，但它在亚基f中包含第五个ATP分子。这一发现证实了s0 (t2)状态最终可以由s0产生的概念gydF4y2Ba_t1gydF4y2Ba通过ATP水解在亚基F(非过程)。考虑到在细菌细胞中ATP水平通常超过ADP水平gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba研究表明，在体内RuvB电机首先通过在RuvB亚基(s0有4或5个ATP)上随机优先加载ATP来组装起始状态，然后进入连续序列核苷酸周期(s0→s1→s5)，促进分支迁移。gydF4y2Ba

我们的研究结果使我们提出了一个起始和分支迁移的模型，该模型假设DNA易位通过一个杠杆机制发生，由ruva -栓系的RuvB六聚体结合DNA旋转执行和控制gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

非渐进起始阶段(随机):(1)RuvA四聚体结合在Holliday结及其柔性RuvA上gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba将RuvB亚基以六聚体的形式组装在新形成的DNA周围，并在ruva结合的Holliday连接(RuvAB-HJ三联体复合体)的每一边以相反的方向排列。(2) RuvB六聚体随机加载核苷酸(ATP或ADP)，初始的失配位ATP水解和/或核苷酸交换发生，采用顺序核苷酸排列，如状态s1 (a - b - c - d - e - f: ATP - ATP - ATP - ADP - ADP)。gydF4y2Ba

渐进式易位阶段(顺序):(1)六聚体RuvB马达作为一个单元工作，经历由转换器介导的正向和逆行信号波，并由核苷酸循环提供燃料:首先ADP在亚基D的阶梯底部被弹出，导致阶梯顶部亚基A的ATP水解，随后ATP在亚基D中被摄取。(2)由于在核苷酸周期中，RuvB固定在RuvA的第III域，伴随着RuvB的旋转，DNA被拉出RuvA核心，通过两个核苷酸推进分支迁移(功率冲程)。(3)随着核苷酸周期的进行，RuvB马达被重新定位(簇开关)，从而RuvB亚基将采用其相邻邻居的构象。(4)集群切换完成后，RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba由于系绳的物理约束，必须游离，并可以自由地重新结合下一个前进的RuvB子单元。通过将构象团簇[E]和[D]限制在RuvA可及的范围内，可以重置电机。要完成360°的完整旋转，这个过程要重复6次。每个亚基将经历至少5个位置特异性构象，分支迁移复合体总共消耗12个ATP分子(每个RuvB马达6个ATP分子)，并通过12个核苷酸推进重组DNA。gydF4y2Ba

这项工作揭示了脱离底物的RuvB亚基的关键作用，其高度协调的运动控制着RuvB六聚体中的核苷酸循环。这些子单元是一个转换器的一部分，通过它来绑定RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba到亚基E可以刺激远距离亚基间信号通路，从而导致ATP水解和核苷酸交换。基片脱离子单元是大多数环形AAA+电机的统一特征gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}这表明该转化器的变体可能也作用于其他AAA+ atp酶。能够在旋转的RuvB电机RuvA上反复发挥其临界功能gydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba结构域需要不断地从RuvB六聚体中释放出来，并与核苷酸循环产生的新生成的结合接口结合。虽然这种旋转背后的驱动力还有待确定，但这种运动的能量来自于核苷酸循环似乎是合理的。由于DNA底物在双四聚体RuvA核的限制下已经折叠成双螺旋结构，我们认为RuvB马达的旋转是由移位DNA的倒卷提供动力的。从RuvAB机械的这种观点来看，双RuvA四聚体在稳定Holliday结中起着重要作用，确保两个DNA底物可以倒回成双螺旋，并为RuvB电机的旋转提供了理论基础。gydF4y2Ba

通过5个不同的过渡态中间产物(s1到s5)，我们的数据从结构上证实了在RuvB马达中，核苷酸循环围绕环进行，为六聚体AAA+ atp酶转位酶的保守核心机制原理提供了概念证明gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．在RuvAB复合体中，旋转的RuvB马达的序列核苷酸循环使转换器维持在与中心RuvA-HJ复合体相同的区域。因此，单个RuvA四聚体可能足以控制两个RuvB马达的核苷酸循环。然而，在其他六聚体AAA+ ATP酶马达中，连续的ATP水解事件应该导致相应的底物脱离亚基绕环进行。为了在这些马达中操作核苷酸循环，假定的转换器相互作用物必须能够到达AAA+ atp酶马达的每个亚基。这可能为环状AAA+ atp酶马达嵌入多聚支架内，如蛋白酶体或ClpA/X-P提供了理论依据gydF4y2Ba^{50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}．或者，RuvA的调节功能可以由底物直接执行。gydF4y2Ba

进一步，我们表明核苷酸周期是构象变化的时空连续体，通过这种构象变化，RuvB AAA+ ATP酶马达将ATP中保留的化学能转化为杠杆作用。的RuvAgydF4y2Ba^D3gydF4y2Ba转换器中的-结合亚基是这一过程的核心，因为它们与RuvA核心复合物的物理连接产生了将RuvB电机转变为分子杠杆所需的支点。值得注意的是，当DNA被撬动时，它仍然与它的结合界面相联系;因此，我们的数据使我们能够从簇开关(遵循核苷酸周期)中分解杠杆动作(核苷酸周期中的连续步骤)。这揭示了核苷酸循环有助于促进DNA拉拔，同时也启动了RuvB六聚体的簇开关。这个启动事件，虽然不是核苷酸循环本身的一部分，但对于核苷酸循环在环周围的传播至关重要，因此，对于持续的DNA易位至关重要。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．值得注意的是，针对核酸和蛋白质易位的六聚体AAA+ ATP酶在其同源底物周围共享一个保守的不对称螺旋结构，进一步认为每个水解ATP分子具有相似的易位率gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba}．类似地，DNA、RNA和蛋白质底物的牵引被认为是由一个共同的序列核苷酸循环驱动的gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}．基于它们共同的几何和机制特性，我们的研究结果表明，大多数环状AAA+ atp酶易位酶可能作为分子杠杆，有效地将与其核苷酸周期相关的构象变化的一致波转化为其中央孔的固定高度，作为促进底物易位的共同基本机制。gydF4y2Ba

最后，我们的研究结果表明，RuvB电机在变换器中是最可变的，它从初始态(s0和s0)的混合构象变化gydF4y2Ba_t1gydF4y2Ba)到核苷酸周期(s1-s5)中观察到的时空连续统。由于功能性DNA损伤反应对于细胞内的细菌病原体应对细胞内的氧化环境至关重要，状态特异性靶向转导器可能为抑制RuvB马达——进而通过小分子干扰进行同源重组提供了一种有前途的途径。gydF4y2Ba

蛋白质工程，表达和纯化gydF4y2Ba

RuvA从gydF4y2Ba美国沙门氏菌感染gydF4y2Ba融合到C-端四组氨酸标签上，利用NcoI和SacI限制位点克隆到pET-52b(+)表达载体(Novagen)。重组蛋白的表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变BL21 (DE3)。细菌细胞在37℃的LB培养基中培养，LB培养基中添加100µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄西林在600 nm处吸光度约为0.6。添加1 mM β-异丙基诱导RuvA表达gydF4y2BadgydF4y2Ba-1-巯基半乳糖吡喃苷(IPTG)和培养物在37°C下进一步培养3 h。细胞在4250的温度被制成颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下放置10分钟，在20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8缓冲液(缓冲液1)中洗涤，在100 mM NaCl, 5%甘油，100 mM Tris-HCl pH 8缓冲液(缓冲液2)中重悬，并在−80℃保存。为了纯化蛋白质，将细胞悬浮液解冻，添加完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma Aldrich)，通过超声裂解，并通过离心(Beckman jia -25.50, 17,500 rpm, 1 h, 4℃)清除产生的细胞裂解液。将上清液应用于与缓冲液2平衡的5ml HisTrap色谱柱(GE Healthcare)上，用添加500 mM咪唑的缓冲液2梯度洗脱固定化蛋白。将峰组分汇集在一起，对缓冲液2进行透析，并加载到Superdex 200 10/300GL尺寸排除柱(GE Healthcare)中，平衡在100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 5%甘油，100 mM Tris-HCl ph8缓冲液(缓冲液3)中。收集含有RuvA的峰组分，并在液氮中冷冻，并在−80℃保存。n端截断的RuvB(16-333)从gydF4y2Ba美国酸奶gydF4y2Bac -末端融合到烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割位点上，接着是连接子和HA标签，并使用NcoI和HindIII限制位点克隆到pProEX HTB表达载体(赛默飞世尔科学公司)。蛋白的表达和纯化如描述的那样进行gydF4y2Ba美国沙门氏菌感染gydF4y2Ba．在透析步骤中进行TEV裂解。重组RuvA和RuvB蛋白通过SDS-PAGE进行纯度评估，然后用考马斯西R-250染色，估计纯度高于95%(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba表3)。gydF4y2Ba

DNA基板gydF4y2Ba

假日连接与移动(HJ-X26)gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba和不可移动(HJ-Y2Ap，由Y2AgydF4y2Ba^17gydF4y2Ba)的核心是通过退火合成的寡核苷酸(Sigma Aldrich)制备的补充信息表3，按照先前发表的协议gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba．简单地说，用天然6% PAGE (TAE缓冲液)纯化寡核苷酸，并在退火缓冲液(缓冲液4)(25 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8)中按适当比例混合。退火反应在0.2 ml的试管中进行，并覆盖一层薄薄的矿物油以防止水分蒸发。混合物加热到95°C 10分钟，然后每10分钟以10°C的温度步骤降低温度。为了得到均匀的四向Holliday结制剂，退火反应中加入DNA样品缓冲液(New England Biolabs)，用天然6% PAGE (TAE缓冲液)分离。从凝胶中切割出四向Holliday结对应的条带，在5 mM Tris-HCl ph8中孵育洗脱。在dna结合试验(电迁移位移试验(EMSA))中，一个寡核苷酸链被标记为放射性gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP (3000 Ci mmolgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})在5 '端退火之前。在分支迁移活性测定中，用ATTO 647N荧光标记一条寡核苷酸链。gydF4y2Ba

RuvAB-HJ的体外重建gydF4y2Ba

RuvAB-HJ粒子按照所述进行了重组gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba，只是稍加修改。将纯化的Holliday结和RuvA混合，加入5mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．混合物在37°C孵育30分钟，并应用于Superdex 200 10/300GL柱上的大小排除层析与100 mM NaCl和5 mM MgCl平衡gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM Tris-HCl pH 8缓冲液(缓冲液5)。含有RuvA-HJ配合物的峰组分与纯化的RuvB在10 mM MgCl存在下混合gydF4y2Ba_2gydF4y2BaATPγS和ADP等摩尔比(1 mM)。为了形成RuvAB-HJ配合物，混合物在37℃下孵育10分钟，然后冷却到4℃。在玻璃化之前，所有样品都用负染电镜分析RuvAB-HJ络合物的形成。gydF4y2Ba

分支迁移活性测定gydF4y2Ba

按所述测量分支迁移活性gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．简单地说，分支迁移反应(20 μl)包含20 nM纯化的荧光标记合成HJ-X26和不同数量的纯化RuvA和RuvB蛋白在缓冲6 (15 mM MgCl)中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， DTT 1 mM, 50 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BSA, 2 mM ATP, Tris-HCl pH 8)。在37°C孵育指定时间后，用蛋白酶K处理(2 mg ml)消化RuvA和RuvB蛋白gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和0.5% SDS在37°C孵育10分钟。在反应中加入甘油(最终浓度为30%)，在6%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳(135 V, TAE缓冲液，35分钟)测定分支迁移。ChemoStar Touch ECL和荧光图像(INTAS科学成像)显示Holliday结和Holliday结衍生物对应的条带。gydF4y2Ba

电迁移位移凝胶试验gydF4y2Ba

不同数量的纯化RuvA蛋白与5 ' -孵育gydF4y2Ba^32gydF4y2Bap标记合成Holliday结(HJ-Y2Ap)， 37℃，5 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BSA, 30 mM Tris-HCl 8缓冲液(缓冲液7)。在反应中加入DNA样品缓冲液(New England Biolabs)，在6%聚丙烯酰胺凝胶(1× TAE)中电泳分析复合物形成。电泳在0.5× TAE缓冲液中，4℃，150 V, 1.5 h。凝胶被晒干，用放射自显影技术观察DNA条带。gydF4y2Ba

为低温电子显微镜准备网格gydF4y2Ba

在新切割的云母片上沉积无定形碳(1-1.5 nm)(徕卡ACE60碳涂层)，在120°C下烘烤0.5 h。用氯仿浸渍60 s，晾干30 min清洗定量网格。连续碳网格是通过在水面上漂浮新鲜制备的无定形碳和清洁的强辉光放电(在25 mA下3分钟)Quantifoil网格。网格干燥1小时，然后在120°C烘焙30分钟，并在控制真空下保存最多2周。gydF4y2Ba

负染色电镜gydF4y2Ba

在使用样品之前，使用GloQube Plus辉光放电系统(电子显微镜科学)在25 mA的条件下对栅格进行30秒的正辉光放电。4微升新鲜制备的RuvAB-HJ配合物被应用到碳涂层铜网格上，并孵育30秒。吸除样品，然后用4µl的染色液(2%乙酸铀酰)染色30 s。多余的污渍被擦掉，网格风干至少2分钟。使用Thermo Fisher Scientific Talos L120C TEM和4K Ceta CEMOS相机对网格进行成像。gydF4y2Ba

低温电镜样品制备和数据收集gydF4y2Ba

新鲜的体外重组RuvAB-HJ复合体在玻璃化之前在冰上孵育30分钟(数据集t1)或约5小时(数据集t2)。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-十二烷基-β-麦芽糖苷(DDM)添加到浓度~0.005%之前，将蛋白质样品应用到网格。4微升的最终RuvAB-HJ样品被两次应用到辉光放电(30秒，25毫安)的黄金量化箔网格(2/2 300网格)上，其中包含一层薄的(1-1.5纳米)无定形碳(内部制造)。简单地说，在4°C水平位置涂抹第一个样品1分钟后，液体从侧面被吸掉。重复该过程，将样品浸入丙烷:乙烷(63:37)混合物中，使用Vitrobot Mark V (Thermo Fisher Scientific)，设置为100%的湿度和4°C。印迹时间从4-7秒不等。玻璃化样品在Thermo Fisher Scientific Titan Krios TEM上成像，工作电压为300 kV，配有场发射枪(XFEG)和带10 eV狭缝的Gatan生物量子能量过滤器和Gatan K3电子探测器。在数据采集过程中，狭缝每6小时重新居中一次。对于t1数据集，在×81,000公称放大倍率(样本水平每像素1.1 Å)的电子计数模式下，共记录了10057张显微照片，包括33帧，时长3秒(总电子曝光为53 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}，对应1.6 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})使用Thermo Fisher Scientific EPU数据收集软件。离焦范围设置在−0.3 ~ 3 μ m之间。对于t2数据集，使用在电子计数模式下操作的Gatan K2 Summit直接电子探测器和狭缝为10 eV的Gatan能量滤波器，在×130,000公称放大倍率下(在样本水平上每像素1.09 Å)分别记录了30,053张包括20或25帧的显微照片。累积电子暴露量为30.7 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}(对应1.24或1.55 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}在−0.3 ~ 4 μ m离焦范围内曝光5 s(扩展数据表1)。gydF4y2Ba

Cryo-EM图像处理和原子模型构建gydF4y2Ba

使用Relion (3.0b和3.1版本)进行单粒子分析gydF4y2Ba^{58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba}．使用MOTIONCOR2(在Relion中实现)对显微图像帧(电影)进行运动校正gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba，剂量加权(使用1.24或1.55 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}每一帧是t2和1.55 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}使用CTFFIND4 (v4.1.14)估计对比度传递函数(CTF)参数。gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．使用CrYOLO (v1.4)自动从运动校正显微照片中提取粒子gydF4y2Ba^62gydF4y2BaGautomatch (v0.56)gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba或者用人工挑选的粒子子集训练的Relion Autopick。在t1数据集中，大约选取了400万个坐标。粒子图像提取盒大小为80像素(bin = 4)，并进行多轮2D分类。只保留同质类的粒子，共计948,812个粒子(重复删除后)。通过重新提取360像素的盒子大小的粒子，以RuvB环(1,881,624个粒子)和中央的RuvA-HJ(948,812个粒子)为中心进行聚焦分类。随后，进行了三轮细化、逐粒子CTF和贝叶斯抛光。此外，对于RuvA-HJ重建，RuvB环出现的信号被减去。对于t2数据集，大约900万个坐标用于粒子提取，随后进行4次分组和多轮二维分类，总共得到1,786,669个粒子。从这些粒子中，确定了三组粒子，并生成了三个粒子子集:(1)含有两个RuvB马达的三方RuvAB-HJ粒子(717,780)，(2)含有一个RuvB马达的二部RuvAB-HJ粒子(549,364个粒子)，以及(3)缺少RuvA的RuvB - hj复合物(519,525个粒子)。在重建RuvA-RuvB-HJ三方配合物时，只使用了第1组的粒子。 At first, an ab initio model was created in Relion using a smaller subset of particles (ngydF4y2Ba= 50000)。随后的分类和改进导致了一致重建，产生了~8的分辨率Å。第2组的粒子被用来重建RuvAB-HJ二部结构(~3.9 Å)。将一个RuvB电机对应的信号减去后的第1组粒子生成伪二部粒子。聚焦重建程序按照t1数据集的描述执行，结果分别是RuvB电机和中央RuvA-HJ亚复合体的三维重建。使用组合粒子堆栈(第1组和第2组)中的粒子重建了RuvA-HJ亚复合体。对于RuvB结构，总共提取了约230万RuvB电机(从所有三组中)，集中，3D分类，并独立细化子集。随后，每粒子CTF、贝叶斯抛光和3D细化进行了两次。应用这个过程可以得到9种不同的RuvB电机结构，分辨率从2.9到4.1 Å不等。使用Relion 3.1计算局部分辨率估计值、金标准分辨率(傅立叶壳相关系数= 0.143)和锐化映射(b因子范围:每聚焦细化30-80)和多体细化gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

首先用SWISS-MODEL生成RuvA和RuvB的同源模型gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．对于RuvA，蛋白数据库(PDB)条目1BVS作为结构模板，PDB条目1HQC作为结构模板gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba作为RuvB的参考模型。使用UCSF Chimera中的fit-in-map工具将模型安装到电子显微镜地图中(v1.13)gydF4y2Ba^67gydF4y2Ba．使用Rosetta (v3.12)对初始模型进行细化gydF4y2Ba^68gydF4y2Ba通过StarMap v.1.1.12控制gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba．在ISOLDE (v1.1.2)中进行了进一步的交互改进gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba， UCSF ChimeraX中的分子动力学引导结构细化工具(v1.2.5)gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba．最后，用Phenix对得到的坐标文件进行优化。real_space_refine (v1.19.1 - 4122)gydF4y2Ba^72gydF4y2Ba使用参考模型约束，严格的旋转器匹配和禁用网格搜索设置。MolProbity服务器gydF4y2Ba^73gydF4y2Ba, EMringergydF4y2Ba^74gydF4y2Ba(通过凤凰)gydF4y2BaZgydF4y2Ba-score用于验证模型几何形状和模型与地图的拟合(扩展数据图。gydF4y2Ba3 e mgydF4y2Ba，扩展数据表1)。gydF4y2Ba

可视化和分析gydF4y2Ba

使用UCSF Chimera(1.13)、ChimeraX (v1.1和v1.2.5)和PyMOL(2.4.1)进行可视化和分析。二面角分析使用以下残基:(1)大atp酶残基:残基36、73、80、174、55、155、170、94和121;(2)小atp酶:残基249、227、209、196;(3)头:余数282、284、265、306和263。在三角角分析中，质心确定的残基如下:(1)大atp酶:残基20-180;(2)小atp酶:残基181-256，(3)头:残基257-325。对所有模型中每个Cα原子与相应质心的距离进行方差分析(模型与RuvB亚基C对齐)。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

关于研究设计的进一步信息可在gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba