RASA2gydF4y2Ba消融T细胞可以提高抗原敏感性和长期功能gydF4y2Ba

CAR - T细胞在一些侵袭性恶性血液肿瘤中已经发生了转变，T细胞受体(TCR)转基因T细胞(TCR T细胞)在实体肿瘤的早期临床研究中显示出了有希望的结果gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．然而，许多癌症，特别是实体肿瘤，对目前的T细胞疗法没有反应，或在最初的反应后迅速进展。在肿瘤内，免疫抑制微环境对抗肿瘤免疫的有效性构成了实质性的障碍gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}．此外，持续暴露于抗原可导致T细胞功能障碍，强调需要平衡效应功能和工程T细胞的长期持久性gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．选择性基因的靶向操纵正在作为一种策略进行测试，以提高过继T细胞疗法的疗效gydF4y2Ba^{5克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．然而，人类T细胞的最佳基因靶点还没有被系统地探索。大规模的CRISPR筛选可以加速基因扰动的发现，从而提高工程T细胞的功效gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba}．我们之前在原代人T细胞中开发了一个发现平台，并将其应用于识别T细胞增殖的新遗传调控因子gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．在这里，我们描述了在肿瘤微环境(TME)中常见的几种免疫抑制条件下进行的无偏倚遗传筛查，揭示了肿瘤微环境(TME)的消融gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba基因作为T细胞克服多种抑制信号的策略。我们发现，消融RASA2增强了对抗原的敏感性，改善了CAR - T和TCR T细胞的效应功能和持久性。最后，我们证明了抗原特异性T细胞的rasa2消融术可以增强肿瘤控制并延长液体和固体肿瘤的多种临床前模型的生存期。gydF4y2Ba

抑制TME和T细胞内在检查点可以影响工程T细胞靶向实体肿瘤的疗效gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．我们开发了一种系统的方法来识别可以使T细胞抵抗TME中遇到的一系列抑制信号的遗传扰动。我们之前使用了CGS-21680，一种腺苷激动剂gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba，模拟腺苷A升高gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对低氧TME中高水平腺苷的反应的抑制信号gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．在这里，我们扩展了这一策略，以模拟TME中T细胞功能的多重挑战。为了模拟内在的检查点信号，我们专注于钙和钙调神经磷酸酶信号的抑制剂(他克莫司和环孢素)，这是T细胞激活的一个关键途径，在肿瘤浸润的T细胞中经常被抑制gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．为了在TME中模拟一个突出的外部抑制信号，我们使用了TGFβ，一种限制肿瘤内T细胞功能的典型抑制细胞因子gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．最后，作为T调节细胞(TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞)是多种肿瘤类型T细胞功能障碍的重要介质gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba，我们调整了我们的筛选平台，以分析细胞-细胞相互作用，从而揭示基因赋予抵抗效应T细胞抑制TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞。gydF4y2Ba

为了确定对这些抑制条件的抗性调控因子，我们在原代人T细胞中应用了单引导RNA (sgRNA)慢病毒感染，并使用Cas9电穿孔(SLICE)混合全基因组crispr敲除(KO)屏幕gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．在这里，我们分析了在多个独立供体和抑制条件下的原代人T细胞中总共六种不同的全基因组筛选(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在上述每种条件下，我们通过流式细胞术进行细胞分选，鉴定了促进T细胞增殖的基因靶点，从而在重新刺激细胞后，在分裂细胞(低羧基荧光素琥珀酰亚酯(CFSE)染色)中富集的sgrna，而非分裂细胞(高CFSE染色)中富集的sgrna。正如预期的那样，在屏幕条件下，与非分裂细胞相比，高度分裂的细胞中靶向必需基因的向导减少了，并且基因命中与人类T细胞的高表达相关gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)．在所有筛选之间共享的高分裂细胞与非分裂细胞中富集的基因命中分析集中在两个候选抗性靶基因上:gydF4y2BaTMEM222gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．屏幕命中的交叉比较突出了使用类似抑制线索(例如，他克莫司和环孢素)执行的屏幕之间的共享命中的程度(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．对高分裂细胞中sgrna的对比分析为每种抑制条件指定了选择性命中，以及为额外验证提供了更一般的抗性概况(补充表)gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．基因命中的一个子集对单个屏幕更具体，例如，gydF4y2Ba图gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTGFBR1gydF4y2Ba分别在腺苷和TGFβ条件下得分较高(扩展数据图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．通过crispr介导的敲除对所选基因的阵列验证证实了这些无偏筛的潜力，可以发现T细胞抵抗tme相关抑制线索的新调节因子(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．例如，定位gydF4y2BaPDE4CgydF4y2Ba或gydF4y2BaNKX2-6gydF4y2Ba使T细胞抵抗腺苷抑制，然而gydF4y2BaNFKB2gydF4y2BaKO对钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司和环孢素产生耐药性。值得注意的是，我们观察到TGFβ和腺苷耐药之间的相互作用，支持先前描述的这些免疫抑制信号之间的相互作用gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}．我们验证了其他基因靶点，在抑制条件下赋予抗性，例如gydF4y2BaPFN1gydF4y2Ba，gydF4y2BaFAM49BgydF4y2Ba(亦称gydF4y2BaCYRIBgydF4y2Ba)，gydF4y2BaCBLBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba．虽然公布的数据支持的作用gydF4y2BaCBLBgydF4y2Ba，gydF4y2BaFAM49BgydF4y2Ba而且gydF4y2BaPFN1gydF4y2Ba调节T细胞功能，据我们所知，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba以前没有被定义为免疫细胞的调节器gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

我们之前发现gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba作为一种基因靶点，当它被敲除时，可以促进T细胞增殖和体外癌细胞杀伤能力gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．观察到gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在多种免疫抑制环境下，消融术也能促进T细胞的增殖能力，我们随后的工作重点是描述其影响gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba过继细胞治疗临床前模型中的消融。RASA2是一种通过加速活性RAS- gtp水解为RAS- gdp来抑制RAS信号输出的RasGAPgydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．在这些屏幕中，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在抑制T细胞增殖方面，RasGAP家族是独一无二的gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-靶向指南在多个供体中富集于分裂的T细胞中(图。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．相比之下，以编码RAS鸟嘌呤核苷酸交换因子(RasGEF)的基因为靶标的导则gydF4y2BaRASGRP1gydF4y2Ba在T细胞分裂过程中被消耗殆尽，证实了其作为TCR和RAS信号通路的积极调节因子的已知作用gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．跨组织整体基因表达模式分析gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba显示,gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在CD8中选择性表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba人类T细胞，这种模式不同于其他RasGAP家族成员，但与观察到的T细胞非常相似gydF4y2BaRASGRP1gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba)．有针对性的gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在另外两个供体中，使用单独的CRISPR引导进行消融，在所有四种可溶性因子抑制条件下，都再现了在筛选中观察到的增殖优势(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2模拟gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们进一步测试了gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在这些免疫抑制条件下，缺乏T细胞对癌细胞的体外杀伤增加。gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在这一系列的抑制条件下，与对照编辑的T细胞相比，消融促进了TCR T细胞对癌细胞的杀伤(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．与TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}RASA2失活使效应T细胞对T细胞产生抗性gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞介导的增殖抑制(图;gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．这种对抑制的抵抗在T存在下进行的癌细胞杀伤实验中也很明显gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba)．缺乏rasa2的效应T细胞保持了其强大的细胞毒功能，而对照T细胞在抑制T存在时无法控制肿瘤细胞的生长gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞。这些发现支持了这样的观点，即RASA2通常是T细胞增殖和细胞毒功能的负调控因子gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融术对多种抑制过继T细胞抗肿瘤活性的机制具有抗性。gydF4y2Ba

接下来，我们试图定义失活RASA2对人类T细胞中RAS-GTP水平和下游信号事件的影响。RASA2被预测会减弱RAS信号，RAS信号是T细胞中控制细胞激活、增殖和分化的多种途径的主要交集gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．Jurkat T细胞白血病细胞系和原代人T细胞表达正常的RAS蛋白，正如预期的那样，在缺乏致癌基因的细胞中表达RAS蛋白gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba突变gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba在两种细胞类型中，基础RAS-GTP水平均较低，但在TCR刺激下升高(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．我们发现敲除RASA2会导致更高的RAS- gtp水平响应TCR刺激，这与其作为RAS的gtp酶激活蛋白的已知功能一致。这些生化数据与我们的CRISPR筛选结果一致，这些结果支持RASA2在调节T细胞中RAS输出的非冗余作用，而其他gtpase激活蛋白无法挽救。MEK和ERK是RAS-GTP在MAPK信号通路中的关键下游效应子gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．与TCR激活后RAS-GTP水平升高一致，我们观察到与相应对照相比，RASA2-KO原代T细胞中MEK和ERK磷酸化水平更高。尽管RASA2-KO T细胞与对照细胞遵循相似的MAPK信号传导总体动力学，但它们达到了磷酸化(p)ERK和pMEK水平的更高峰值(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．RASA2-KO T细胞也有更高水平的刺激诱导的S6磷酸化，这是MAPK信号级联的下游中介。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba)．总之，这些数据支持RASA2作为调节MAPK信号通路对TCR刺激反应的RasGAP的作用。gydF4y2Ba

我们也确认了gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融术不会导致不受控制的T细胞增殖，这可能会降低其作为T细胞治疗中基因编辑靶点的效用。在没有TCR刺激的情况下，对照和RASA2-KO T细胞的活力都稳步下降，而白细胞介素-2 (IL-2)的停用加剧了这种下降(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．我们发现RASA2-KO T细胞仍然依赖于TCR刺激MAPK信号(由pERK指示)、增殖(由CFSE染色指示)和激活(由CD69表达指示)，除了CD69表达变化外，基线水平没有一致的变化gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．此外，与对照T细胞相比，我们检测到在TCR刺激下，rasa2缺陷T细胞中多种效应细胞因子水平更高，而在未受刺激的细胞中没有发现差异(图2)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．总之，这些结果表明，在TCR刺激的T细胞中，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融促进了关键信号通路的级联，以促进更有效的效应功能。值得注意的是,gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在没有TCR刺激的情况下，消融不会导致细胞因子依赖的丧失或不受控制的增殖。gydF4y2Ba

我们接下来测试是否烧蚀gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在体外扩增对低水平目标同源抗原的敏感性。在大范围抗cd3和抗CD28(抗cd3 /CD28)浓度下，与对照T细胞相比，RASA2-KO T细胞具有更高水平的ERK磷酸化、激活和增殖(图2)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．为了用更生理的刺激来测量这种抗原敏感性，将NY-ESO-1抗原特异性T细胞与预先加载了越来越高浓度同源NY-ESO-1肽的T2细胞联合培养。该实验证实，RASA2 KO在一系列肽浓度范围内导致更高水平的pERK，有效地使T细胞对抗原敏感(图2)。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．抗原敏感性的提高对于能够检测和杀死低靶抗原表达的癌细胞的T细胞工程尤为重要gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}．为了测试这一点，我们设计了T细胞来表达一种靶向CD19表面蛋白的CAR，并编辑它们来破坏其中任何一种gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba或控制位点(扩展数据图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．我们使用基于cd28的CD19 CAR，被报道是一种高度敏感的CAR，来测试是否丢失gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba表达可能进一步提高对低抗原靶点的敏感性gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．这些CAR - T细胞与经过工程改造表达一系列CD19水平的癌细胞共同培养，并通过膜联蛋白染色检测癌细胞的杀伤。尽管RASA2- ko和对照CAR - T细胞都能有效地杀死表达高CD19水平的白血病细胞，但与低抗原表达的对照T细胞相比，RASA2失活增强了白血病靶细胞的体外杀伤(图2)。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba)．总的来说，这些数据表明缺乏RASA2的T细胞即使对低水平的抗原也敏感，这可以增强它们检测和杀死抗原暗淡的癌细胞的能力。gydF4y2Ba

接下来，我们分析了RASA2-KO细胞的下游转录网络。首先，为了评估T细胞激活的关键转录程序，我们使用了一套Jurkat T细胞转录报告系统。利用激活蛋白1 (AP-1)、活化T细胞核因子(NFAT)和核因子κ B (NFкB)的响应元件设计了这些报告系，这些响应元件驱动mCherry荧光报告的表达。这些研究表明gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融显著增加TCR刺激诱导的AP-1和NFкB的转录活性，并在较小程度上增加NFAT，这与RAS和MAPK信号通路的下游转录效应一致(图2)。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．为了系统地分析原代RASA2-KO T细胞的转录变化，我们在与靶癌细胞共培养48小时后，对RASA2-KO细胞或对照编辑的抗原特异性T细胞进行了全转录组rna测序(RNA-seq)分析。在RASA2-KO T细胞中上调最多的两个基因是gydF4y2BaDUSP6 shpgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSPRED2gydF4y2Ba，它们会减弱RAS信号，并可能作为一种反馈机制，对RAS信号的增加做出反应gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．基因集富集分析(GSEA)强调了在RASA2-KO T细胞中上调的多个关键通路，包括与细胞周期、转录活性和细胞代谢相关的通路(图2)。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba)．值得注意的是，考虑到代谢状态对T细胞功能的重要性，缺乏rasa2的T细胞表现出与氧化磷酸化和糖酵解相关的基因表达增加(扩展数据图。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba)．为了测试这些代谢变化是否普遍存在于超激活的T细胞中，我们分析了先前在crispr扰动的原代人类T细胞中生成的单细胞RNA-seq (scRNA-seq)数据集gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．我们比较了RASA2-KO T细胞中差异表达的基因与缺失的T细胞中差异表达的基因gydF4y2BaCBLBgydF4y2Ba，编码一种典型的TCR信号负调控因子。而RASA2或CBLB的失活则增加了gydF4y2BaGZMBgydF4y2Ba，gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCDKN3gydF4y2Ba和降低的表达gydF4y2Ba出售gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTCF7gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)，我们的分析显示gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba还诱发了一种独特的基因特征。这一特征包括参与线粒体活动的核心基因的差异表达，如gydF4y2BaMrpl12, tomm40, tfamgydF4y2Ba而且gydF4y2BaUCP2gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}．RASA2的代谢调控被强调为驱动氧化磷酸化的基因之间的强负相关gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba来自免疫细胞的数千个转录数据集的表达(扩展数据图。gydF4y2Ba5 e, fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．总的来说，我们对RASA2 KO T细胞转录状态的分析显示了一种增强的效应记忆状态(即减少gydF4y2BaTCF7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba出售gydF4y2Ba与更高的氧化磷酸化状态相结合，这通常与中央记忆T细胞有关gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

据我们所知，rasa2在T细胞生物学中没有被描述的作用，我们接下来评估了它在T细胞中的内源性转录调节。分析我们之前发表的scRNA-seq数据集gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba透露,gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在人T细胞刺激后下调(扩展数据图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．对两个已发表的小鼠急性细菌感染RNA-seq数据集的进一步分析gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba以及一大批体外激活的人类T细胞gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba证实T细胞刺激会急剧下调gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba表达水平(图;gydF4y2Ba2 l, mgydF4y2Ba)．刺激后RASA2的急性内源性减少可能给T细胞一个增强效应功能的窗口，以及基因消融gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba可能会通过完全和持久的RASA2缺失来放大这一现象。此外，通过分析外部数据集，我们测试了RASA2是否可能在T细胞功能障碍中发挥作用。与检查点在调节T细胞功能中的作用一致，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba暴露于慢性感染的小鼠T细胞上调了多少gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba或者重复抗原刺激gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba以及肿瘤浸润T细胞gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 ngydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 h,我gydF4y2Ba)．已发表的人类患者scRNA-seq数据集gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}也显示出更高的gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba与外周T细胞相比，肿瘤浸润T细胞的水平下降，提示RASA2在TME中抑制T细胞反应的潜在作用(图2)。gydF4y2Ba2 ogydF4y2Ba)．对已发表的全基因组CRISPR抑制和CRISPR激活T细胞产生细胞因子的数据集的分析进一步支持了这种负调控因子的作用gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba，这表明压抑的gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba倾向于增加效应细胞因子的产生，并且gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba激活倾向于减少这些细胞因子的产生(扩展数据图。gydF4y2Ba5 jgydF4y2Ba)．最后，我们发现转基因过表达RASA2在人T细胞中抑制T细胞活化和体外扩增(扩展数据图)。gydF4y2Ba5 k - ngydF4y2Ba)．总之，这些观察结果表明，在急性刺激期间下调的RASA2可以在慢性刺激的T细胞中上调，作为内在信号检查点抑制T细胞功能。gydF4y2Ba

我们接下来测试是否消融gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba我们发现在肿瘤浸润T细胞中上调，可以改善慢性抗原暴露诱导的T细胞功能障碍。我们建立了一种重复刺激实验，其中抗原特异性T细胞与新鲜靶细胞以1:1效应靶(E:T)的比例共培养，每48小时重复一次(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．这种重复刺激实验显示抗原特异性T细胞相对富集，T细胞活力和激活水平下降，代谢谱改变，关键细胞表型标志物进行性变化，总体上与功能失调的T细胞状态一致gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3罪犯gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．在功能水平上，T细胞在反复暴露后逐渐失去了控制癌细胞扩张的能力(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

RNA-seq分析gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba重复刺激T细胞的表达表明，尽管gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba急性刺激后水平下降，重复暴露肿瘤后水平升高(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．这些发现进一步表明，在慢性刺激的环境下，RASA2可以作为一个检查点来抑制T细胞的反应。我们在重复刺激实验的功能水平上进行了测试，发现gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融通常限制了许多功能障碍的表型。例如,gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融限制了反复暴露肿瘤时观察到的T细胞活力下降(扩展数据图)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．我们还观察到，在重复刺激后，RASA2-KO T细胞与对照编辑的T细胞相比，表现出更高水平的磷酸化mapk信号、激活和多种效应细胞因子(图2)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)．rasa2缺陷T细胞的增强效应状态是通过ELISA检测被刺激T细胞上清液中的免疫调节细胞因子和细胞溶解分子独立证实的(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．RASA2gydF4y2Ba-gydF4y2BaKO T细胞被发现处于比对照细胞更有效的记忆分化状态(扩展数据图)。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)．典型T细胞衰竭基因相似gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba和对照编辑的T细胞经过多次刺激后，表明RASA2-KO T细胞在体外没有差异耗尽(扩展数据图。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)．RNA-seq分析显示，RASA2-KO T细胞表达较高水平的与细胞周期相关的基因(gydF4y2BaVRK1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAURKAgydF4y2Ba而且gydF4y2BaKNL1gydF4y2Ba)、脂肪酸代谢(gydF4y2BaSLC27A2gydF4y2Ba)和线粒体在重复刺激后与对照编辑的T细胞进行比较(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．鉴于代谢适应度在抵抗T细胞功能障碍方面的重要性，我们在这个重复刺激实验中评估了对照和RASA2-KO T细胞在功能水平上的代谢特征gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．基于流式细胞术的检测证实，缺乏RASA2的CAR - T和TCR - T细胞的线粒体质量和活性高于对照细胞(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．海马实时细胞代谢分析显示gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba与重复刺激后对照编辑的T细胞相比，消融导致基础和最大耗氧率以及细胞外酸化率增加(图2)。gydF4y2Ba3 h,我gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7汉英gydF4y2Ba)．而对照T细胞在慢性刺激后不能使用替代能源，RASA2-KO T细胞尽管反复暴露抗原仍保持这种能力(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．总之，通过一系列不同的表型指标，RASA2消融术限制了慢性癌症抗原暴露引起的功能障碍。gydF4y2Ba

接下来，我们测试了其对癌细胞的杀伤能力gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-消融的T细胞被反复暴露于肿瘤抗原所影响。尽管T细胞gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在第一次刺激时，消融在我们的癌细胞杀伤试验中具有中等优势，这种优势在多次刺激后变得更加明显(图。gydF4y2Ba3 j, kgydF4y2Ba)．对照编辑的T细胞在每次刺激后控制癌细胞生长的能力都会逐渐下降，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-烧蚀的T细胞在多次刺激后仍保持其强大的杀伤能力(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这种杀死癌细胞的优势在多个人类献血者和效应T细胞与癌细胞的比率中通常是一致的(图。gydF4y2Ba3 lgydF4y2Ba)．我们接下来测试了这种对T细胞功能障碍的抵抗是否gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在TRAC CAR - T细胞中重复了损失。gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba经编辑的TRAC cd19特异性CAR - T细胞与表达cd19的癌细胞反复共培养(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)．从TCR T细胞模型中可以看出，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在重复暴露癌细胞后，经过基因编辑的CAR - T细胞继续有效地杀死靶细胞，而经过对照编辑的CAR - T细胞无法控制肿瘤细胞的生长(图2)。gydF4y2Ba3米gydF4y2Ba)．使用两种不同的CD19是一致的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba癌细胞系和多个人类献血者(扩展数据图。gydF4y2Ba8汉英gydF4y2Ba)．重复刺激后的这种杀伤优势是特异性的，当RASA2-KO或对照TRAC CAR - T细胞与抗原阴性癌细胞共培养时，缺乏癌细胞杀伤就证明了这一点(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 f, ggydF4y2Ba)．总的来说，这些结果表明，T细胞反复暴露于其靶抗原逐渐失去控制癌细胞生长的能力gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba可以使TCR T和CAR - T细胞对这种功能失调状态产生抗性。gydF4y2Ba

为了确定这些发现的翻译相关性，我们继续测试在多个过继T细胞治疗的临床前模型中，消融RASA2是否会改善工程T细胞的性能。首先，我们将表达NY-ESO-1的A375黑素瘤细胞移植到免疫缺陷NSG小鼠的侧翼(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．T细胞被改造表达1G4 ny - eso -1特异性TCRgydF4y2Ba^45gydF4y2Ba并被编辑到消融gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba或安全港管制地点(gydF4y2BaAAVS1gydF4y2Ba)经尾静脉注射转移。转让gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba与接受对照编辑T细胞的小鼠相比，-缺陷T细胞显著减缓肿瘤生长并提高生存率(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)．为了测试TCR T细胞中RASA2的消融是否可以改善对含有相同NY-ESO-1抗原的液体肿瘤的控制，我们将经过工程改造的Nalm6白血病细胞在同源主要组织相容性复合体I类分子(MHCI)上表达NY-ESO-1注入小鼠尾静脉(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．在这个白血病模型中，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-缺陷TCR T细胞也改善了肿瘤控制(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 c, dgydF4y2Ba)．因此,gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融增强了tcr工程过继T细胞疗法在液体和固体肿瘤模型中的疗效。gydF4y2Ba

为了测试体内RASA2-KO的这种优势是否适用于CAR - T细胞环境，我们通过将CD19-28z CAR敲入到细胞中来生成cd19特异性CAR - T细胞gydF4y2BaTRACgydF4y2Ba先前描述的轨迹gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba，并同时中断其中任何一种gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba或者gydF4y2BaAAVS1gydF4y2Ba轨迹。这些CAR - T细胞经静脉移植到移植了Nalm6白血病细胞的NSG小鼠中(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 egydF4y2Ba)．汽车在gydF4y2BaTRACgydF4y2Ba与逆转录病毒载体表达的CAR相比，基因座已被证明可以减少T细胞功能障碍并增加持久性gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．尽管如此，我们发现gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba缺陷的TRAC CAR - T细胞在肿瘤控制方面比对照的TRAC CAR - T细胞有明显的优势，通过生物发光成像在用多个不同的人类献血者的细胞处理的小鼠队列中测量(图2)gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 f-hgydF4y2Ba)．这种减轻的肿瘤负担导致接受治疗的小鼠的生存时间显著延长gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-缺陷的TRAC CAR - T细胞(图;gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9我gydF4y2Ba)．尽管所有注射了对照编辑CAR - T细胞的小鼠都必须在第60天安乐死，但大多数注射了RASA2-KO人类T细胞的小鼠活过了第60天，其中一部分小鼠表现出超过100天的持久反应。gydF4y2Ba

为了更好地理解这种观察到的肿瘤控制优势，我们在CD19 CAR - T细胞治疗后的两个时间点评估了Nalm6白血病移植小鼠的骨髓。我们发现，与对照组CAR - T细胞相比，RASA2-KO CAR - T细胞处理的小鼠中CAR - T细胞数量显著增加，Nalm6细胞数量减少(图2)gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)．在这个体内模型中，骨髓中的RASA2-KO CAR - T细胞也显示出比对照CAR - T细胞更低的典型衰竭相关抑制受体的表面表达(图2)。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba)．进一步对这些细胞进行表型分析，CD4水平无明显差异gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba到第16天，RASA2-KO细胞的成分或分化状态略有倾斜(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 j, kgydF4y2Ba)．为了直接比较T细胞在同一骨髓生态位中的相对扩张和持久性，我们将大致相同比例的RASA2-KO和对照T细胞混合转移到携带Nalm-6的小鼠体内，发现随着时间的推移，RASA2-KO CAR - T细胞在骨髓生态位中的竞争明显优于对照CAR - T细胞(图2)。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 l, mgydF4y2Ba)．我们在骨髓中观察到的持久性优势，以及在体外重复的癌细胞杀伤实验中观察到的持久性优势，使我们测试RASA2 KO是否在体内控制重复的白血病注射方面赋予CAR - T细胞优势。这些实验需要优化，这样当小鼠已经复发时，给定供体的CAR - T细胞剂量不会太低，也不会太高，以便所有小鼠都能强有力地控制肿瘤的再挑战。我们发现了一个T细胞供体，在先前确定的低“压力测试”CAR - T细胞剂量下，证明了对初始肿瘤负担的相对持久控制gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba，然后我们在单独的小鼠队列中重新引入Nalm6细胞3次，间隔7-11天。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．我们发现RASA2-KO CAR - T细胞在减少肿瘤负担和增加肿瘤再挑战模型中的存活率方面优于对照CAR - T细胞，这证明了这一点gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融可以改善体内功能持续性(扩展数据图。gydF4y2Ba10 b, cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了评估单独过继T细胞转移对小鼠健康的影响，我们向非荷瘤小鼠注射T细胞，并随着时间的推移进行监测。此外，为了评估肿瘤抗原刺激的T细胞，我们用对照和RASA2-KO CD19 TRAC CAR - T细胞治疗了另外一组患有Nalm6白血病的小鼠，以实现肿瘤清除，并在CAR - T细胞注射后观察这些小鼠116天。在这两个队列中，通过视觉检查和体重，在接受RASA2-KO和对照TRAC CAR - T细胞的小鼠中没有观察到差异，与对照TRAC CAR - T细胞相比，RASA2 KO没有改变受体动物的血细胞计数或组织病理学结果(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 e, fgydF4y2Ba)．总的来说，这些数据表明，在使用TRAC CAR - T细胞的临床前模型中，RASA2可以在CAR - T细胞中被烧蚀，以提高抗肿瘤疗效和生存率，并且没有明显增加安全风险。gydF4y2Ba

最后，考虑到开发用于实体肿瘤的CAR - T细胞疗法的主要临床挑战，我们测试了RASA2 KO是否也可以增强实体肿瘤临床前模型中的CAR - T细胞功能。我们使用了我们之前描述的腹膜内局部骨肉瘤(LM7)模型gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba表达EphA2的T细胞。CD28z汽车gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba)．我们将LM7骨肉瘤细胞系注射到NSG小鼠的腹膜中，然后注射经工程改造表达epha2特异性CAR的T细胞(图2)。gydF4y2Ba4 lgydF4y2Ba)．肿瘤负荷的生物发光测量显示gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在该模型中，与对照CAR - T细胞相比，CAR - T细胞中的基因修饰可以显著减缓肿瘤生长并延长生存期(图2)gydF4y2Ba4 m-ogydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 h-jgydF4y2Ba)．在这组小鼠中，清除肿瘤的亚组中，RASA2-KO CAR - T细胞能够在第174天清除肿瘤(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 kgydF4y2Ba)．总之，我们发现gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融可以改善TCR T和CAR - T细胞对抗一系列液体和实体肿瘤的临床前模型的性能，突出了其在多种免疫治疗适应症方面的巨大转化潜力。gydF4y2Ba

外在和内在的抑制信号是目前过继T细胞疗法的主要挑战gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．大规模的CRISPR基因筛选提供了一个强大的发现平台，以揭示使T细胞抵抗这些抑制信号的遗传扰动gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba}．在这里，我们使用这样一个筛选平台来模拟各种肿瘤相关的抑制条件，并发现这些筛选集中在gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba作为一个有前途的候选目标，工程抗性的多种抑制信号。我们的结果表明，在没有gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在抗原暴露时，T细胞经历了增加的RAS信号和激活。这种对目标抗原的放大反应可能会减轻我们所测试的抑制因素所带来的一些抑制效应。值得注意的是，这种对抗原的信号反应的增强并没有使这些细胞出现功能障碍。相反，RASA2 KO通过反复暴露癌症抗原，赋予T细胞更持久的癌症杀伤能力。这些对重复抗原相遇的增强的近端信号反应可能会导致下游转录程序的改变，从而帮助保存T细胞的功能。例如，我们注意到gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融导致AP-1和NF-κB转录程序升高，但NFAT反应差异不明显。这种模式被预测可以抵消T细胞无能和/或衰竭，这可能是由无对抗的NFAT信号导致的gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．此外，我们观察到有利于氧化磷酸化的代谢状态的转录重编程，这在慢性抗原暴露后线粒体适应性的功能分析中得到了证实，这表明gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融可以通过改变T细胞的代谢状态来预防功能障碍。我们还发现gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在多个慢性刺激模型中，水平都有所升高。尽管据我们所知，RASA2以前没有被认为在T细胞生物学中起作用，但我们在这里证明，RASA2是T细胞信号转导的关键细胞内检查点，其消融导致工程人T细胞中抗原敏感性增加和持久效应功能。gydF4y2Ba

工作亮点gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba作为一个有希望的基因靶点，用于工程改进的下一代T细胞。gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在体外，T细胞对抗原暗淡靶细胞的反应增强，这可以通过扩大T细胞信号的动态范围，极大地扩大临床中可用的抗原受体库。进一步的临床前试验是必要的，以探索的有效性和安全性gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融在T细胞疗法中。一个担忧可能是gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba功能缺失突变虽然不常见，但与一些癌症有关，最突出的是黑色素瘤和多发性骨髓瘤。然而，值得注意的是gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba通常与其他肿瘤抑制因子(如NF-1)共同突变，表明单一突变的转化潜力降低gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．使用基因组靶向CAR与CRISPR集成可能有助于降低额外基因的插入突变风险，这些基因可能作为肿瘤抑制因子，这可能与慢病毒或逆转录病毒CAR转导有关。值得注意的是，我们观察到这些RASA2-KO T细胞的适应性优势是刺激依赖的，这表明gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba损失增加抗原敏感性，但不驱动本构增殖。这种刺激依赖性可能与RASA2中的PH结构域有关，该结构域与脂质第二信使磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸结合，但不与磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸结合gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸仅以活性状态存在，并将RASA2招募到质膜上，这表明RASA2的GAP活性依赖于活跃的PI3K信号gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．这种对PI3K信号的依赖表明，RASA2可能在细胞激活环境中作为RAS信号的诱导负调控因子。尽管这种刺激依赖减轻了使用的一些担忧gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在治疗上，这些细胞也可以被改造成自杀开关和合成电路，以更严格地控制T细胞产物gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．我们的数据确定RASA2是T细胞反应的强大调节因子，需要继续进行工作来测试不同TCRs和car对非预期抗原靶点的增强反应性。值得注意的是，将RASA2敲除与TRAC CAR敲入相结合，消除内源性TCR，应降低增强潜在自身反应性T细胞的风险，并提高安全性gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}．额外的tcr阳性细胞消耗策略可以进一步降低这种风险。总的来说，我们的研究结果证明了这一点gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融增加了T细胞疗法的效力和持久性，这是这些疗法在临床上失败的两个关键领域。结合对压制性线索的抵抗，这使得gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba消融术是产生更有效的T细胞治疗血液学和实体肿瘤适应症的有前途的新策略。gydF4y2Ba

健康供体原代T细胞的分离gydF4y2Ba

从StemCell Technologies(200-0092)购买经鉴定的健康捐赠者的白细胞标本，并持有机构审查委员会批准的同意书和协议。对于筛查，从vititalant(前身为太平洋血液中心)购买经机构审查委员会批准的同意书和协议的鉴定健康献血者的Trima单采后的白细胞减量室残留物。原代人T细胞使用EasySep人T细胞分离试剂盒(17951)根据制造商的协议使用EasySep磁铁进行分离。将细胞置于合适的培养容器中，用12.5 μl ml的Immunocult (Stem Cell Technologies, 10971)激活细胞gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．细胞在10℃下培养gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞密度为每毫升，用50iu ml的IL-2培养gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(除非另有说明)。细胞在添加5%胎牛血清、50µM 2-巯基乙醇和10 mM的X-Vivo-15培养基中培养gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BalgydF4y2Ba半胱氨酸。外周血单个核细胞(pmcs) 5 × 10冷冻gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每瓶细胞使用Bambanker (Bulldog Bio)无血清细胞冷冻培养基。gydF4y2Ba

在抑制条件下合并CRISPR-KO屏幕gydF4y2Ba

如前所述，进行池化CRISPR-KO筛选gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．简而言之，如上所述刺激分离的T细胞，24小时后用慢病毒库转导它们以表达全基因组Brunello sgRNA文库gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba．转导24 h后，用PBS清洗T细胞一次，用Cas9蛋白电穿孔，按上述方法培养扩增。第14天，T细胞用CFSE染色，并在他克莫司(TOCRIS 3631，终浓度5 nM)、环孢素(TOCRIS 1101，终浓度50 nM)、CGS-21680 (TOCRIS 1063，终浓度20µM)或TGFβ1 (Biolegend 781802，终浓度10 ng ml的存在下用Immunocult刺激gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．对于TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞状况，供体CD4匹配gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD127gydF4y2Ba^低gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}在第0天使用磁富集(STEMCELL 18063)分离细胞，用抗cd3 /CD28刺激，并在培养中扩增，直到与cfse染色的效应T细胞以1:1的比例混合。对于所有筛选，在重新刺激后3天，染色的T细胞被分为CFSE高群体和低群体并裂解，并准备基因组DNA，如前所述，为每个样本进行下一代测序gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．我们用了四个人做刺激，TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞筛查，两名供体进行腺苷、环孢素和他克莫司筛查，一名供体进行TGFβ筛查。屏幕点击被MAGeCK识别gydF4y2Ba^52gydF4y2BaV0.5.9使用默认参数的配对分析。仅针对他克莫司和环孢素，收集分裂细胞，并与仅刺激筛选中匹配供体的未分裂细胞进行比较。在80%以上的样品中，读取计数低于50的导览被过滤掉了。补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba详细的指导和基因水平计数，日志折叠变化和MAGeCK评分。寻找共享命中，基因级日志gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}折叠变化值按比例计算得到gydF4y2BazgydF4y2Ba分数。a以上基因gydF4y2BazgydF4y2Ba- 95%百分位的得分(gydF4y2BazgydF4y2Ba-score >1.54)定义为共享命中分析的命中数，生成图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba，详见补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．为了定义抑制条件特异性命中，使用MAGeCK软件将cfse低(高分裂)细胞中的sgRNA计数与仅刺激(stim)条件进行了比较。分析结果见补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．通过对必需基因的退出分析来衡量筛选的质量，我们使用了由DepMap确定的必需基因gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba基因级测井采用GSEAgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}褶皱的变化。为了分析原代人T细胞中屏幕点击的表达，使用DICE数据库，平均两种活化CD4细胞的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

CRISPR KO在原代人T细胞中使用Cas9-RNP电穿孔gydF4y2Ba

T细胞如上述分离和刺激48小时后，使用Amaxa P3 Primary Cell 96孔4D-Nucleofector Kit (Lonza, V4SP-3960)电穿孔Cas9-sgRNA-RNP。将冻干的crRNA和tracrrna (Dharmacon)在无核酸酶双相缓冲液(IDT 1072570)中以160 μM的浓度重悬。除非另有说明，对照编辑的T细胞被靶向gydF4y2BaAAVS1gydF4y2Ba序列GGGCCACTAGGGACAGGAT，和gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-编辑的T细胞被靶向gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba-目标序列AGATATCACACATTACAGTG。在某些情况下，如图图例中所示，ctrl组表示非目标控制指南GGTTCTTGACTACCGTAATT。crrna和tRNAs在37°C下以1:1 v/v比络合30分钟。sgRNAs与Cas9 (Stock 40 μM)以1:1 v/v比例混合，37℃孵育15 min，形成RNP复合物。计数T细胞，以1 × 10重悬于P3缓冲液中gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba每20 μl，与3 μl RNPs混合，加入96孔电穿孔板。使用EH115方案电穿孔细胞，加入80 μl T细胞培养基(X-Vivo-15, Lonza)，在37℃下电15 min后立即恢复。一旦恢复，细胞被转移到X-Vivo-15培养基中含有50 IU ml IL-2的适当培养容器中gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

Cell line认证和测试gydF4y2Ba

细胞系来源如下:A375 (ATCC, CRL-1619)， A375-CD19(在本研究中生成)，T2细胞(ATCC, CRL-1992)，表达荧光素酶，GFP和不同水平CD19的Nalm6细胞(由J.E.生成)，表达NY-ESO-1的Nalm6细胞(由J.E.生成)，Nalm6细胞系(最初从ATCC, CRL-3273购买)，LM7骨肉瘤细胞(由MD安德森癌症中心的Eugenie Kleinerman于2011年提供给G.K的实验室)，Jurkat报告细胞(由加州大学旧金山分校的Kole Roybal赠送)，Jurkat细胞(原购于ATCC，克隆E6-1)， HEK293T细胞(Lenti- XTM 293T细胞系，Takara Bio目录编号:632180)。ATCC和Takara Bio的细胞株提供分析证书。流式细胞术常规检测各细胞系相关抗原表达。使用ATCC STR分析单元验证服务对LM7单元进行常规验证。用Nalm6、A375、LM7和293T细胞检测支原体。使用LookOut支原体PCR检测试剂盒(Sigma Aldrich，目录编号:;MP0035)或MycoAlert支原体检测试剂盒(龙沙，目录编号:; LT07- 218) at St. Jude. The following cell lines were used for short-term assays and not tested for mycoplasma: T2, Jurkat reporter lines. Our results pertain to the performance of primary human T cells. The International Cell Line Authentication Committee register was consulted and no commonly misidentified lines were used.

慢病毒的产生和TCR的T细胞转导gydF4y2Ba

将lentii - x 293T细胞系(Takara Bio 632180)细胞以每15厘米培养皿中1800 - 2000万个细胞的数量播种gydF4y2BalgydF4y2Ba在DMEM + 5% FBS + 1%青霉素-链霉素中培养。用sgRNA转移质粒和第二代慢病毒包装质粒pMD2转染细胞。G (Addgene 12259)和psPAX2 (Addgene 12260)使用Lipofectamine 3000转染试剂按照制造商的方案(L3000001)进行转染。转染6小时后，将转染培养基更换为DMEM + 5% FBS + 1%青霉素-链霉素含病毒促进剂，按制造商说明书(Alstem VB100) 500倍。收集24小时和48小时的病毒上清液，以300度旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C浸泡10分钟，以去除细胞碎片。慢病毒颗粒用Alstem沉淀液(Alstem VC100)浓缩，并在4°C保存过夜。病毒在1500度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置30分钟，然后在冰冷的PBS中以原来体积的100倍重悬，并在- 80°C保存，直到进一步使用。T细胞转导时，TCR刺激24 h后，将浓缩慢病毒以1:25 v/v的比例直接加入到T细胞中，与X-Vivo-15培养基倾斜搅拌。gydF4y2Ba

CRISPR敲入CD19 CARgydF4y2BaTRACgydF4y2Ba使用腺相关病毒gydF4y2Ba

腺相关病毒(AAV)-ITR质粒含有cd191928z CAR和gydF4y2BaTRAC -gydF4y2Ba如前所述，针对同源定向修复的同源臂被使用gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．含AAV-ITR的质粒经HEK293T细胞与pHelper和pAAV Rep-Cap质粒经聚乙烯亚胺转染后包装成AAV6。用碘黄醇梯度超离心进一步纯化aav。采用dnnasei (NEB)处理、蛋白酶K (Qiagen)酶切的AAV样品，用引物对左侧同源链(正向:CTTTGCTGGGCCTTTTTCCC，反向:CCTGCCACTCAAGGAAACCT)进行定量PCR测定AAV。定量PCR采用SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad 1725201)在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行。gydF4y2Ba

T细胞如前所述被分离和激活gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．T细胞活化48小时后，使用4D Nucleofector 96孔单元(Lonza)电穿孔RNP转染细胞。将60 pmol Cas9蛋白与120 pmol sgRNA (Synthego, TRAC guide RNA (gRNA): ACAGGGUUCUGGAUAUCUGU)在37℃孵育产生一个RNP反应。将200万个细胞电穿孔并稀释到培养基中，在37°C, 5% CO下孵育gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}．重组AAV6供体载体在电穿孔后30 ~ 60分钟加入培养，在指定感染倍数(10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba)，并与细胞一起孵育过夜。电穿孔后的第二天，编辑过的细胞重悬在T细胞生长培养基中，在标准培养条件下进行扩增，并保持在10的密度gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba用山羊抗小鼠Fab染色CAR，用流式细胞术评估敲入效率(Jackson ImmunoResearch, 115-606-003)。gydF4y2Ba

TCR T和CAR - T细胞体外抗癌试验gydF4y2Ba

抗原特异性T细胞与预镀的RFP共培养gydF4y2Ba^+gydF4y2BaA375或GFPgydF4y2Ba^+gydF4y2BaNalm6肿瘤细胞在一个96孔的平板中，从2:1的E:T比例开始，然后用对数gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}连续稀释三份。对于目标癌细胞，使用A375 (ATCC, CRL-1619)进行TCR - T检测。对于CAR - T检测，表达cd19的RFPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba如前所述，通过内源性CD19基因前的SFFV启动子(靶向CATGGTGGTCAGACTCTCCG)的靶向非病毒敲入产生A375黑素瘤细胞gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．对CD19表达均匀低的细胞进行分类。不同CD19表达水平的Nalm6细胞系和表达J. Eyquem生成的NY-ESO-1抗原的Nalm6细胞系。对于膜联蛋白检测的实验，根据制造商的说明使用了膜联蛋白V染料(Essen Bioscience)红色(4641)和绿色(4642)。使用IncuCyte Zoom活细胞成像技术(Essen Bioscience)每2-3小时对平板进行一次成像，持续72-96小时。招标书gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或“绿色荧光蛋白”gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba随着时间的推移，记录每口井的对象数量。癌细胞生长被计算为任何给定时间点的计数，由计数归一化gydF4y2BatgydF4y2Ba= 0。对于显示置信区间为灰色阴影区域的时间轨迹，通过使用R包gam v1.20拟合广义加法模型来平滑轨迹。拟合模型还用于插值轨迹，并计算给定时间间隔曲线下的面积。gydF4y2Ba

屏幕验证实验gydF4y2Ba

对于阵列筛选验证实验，从两个供体中分离T细胞，并使用RNPs编辑，RNPs中含有如上所示的靶向感兴趣基因或对照指南的gRNAs。用于该阵列验证的基因是根据刺激条件下的对数折叠变化、假发现率(FDR)、T细胞中的表达水平和相对对数选择的gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}在不同屏幕上的折叠变化(补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．每个基因选择两个grna，一个来自屏幕点击，一个由在线工具设计的正交指南(gydF4y2Bahttps://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-toolgydF4y2Ba)．导轨序列详见《补充表》gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba．在分离后第9天，用CFSE对T细胞进行染色以跟踪细胞分裂，并用6.25 μ l ml刺激T细胞gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}免疫培养10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba用于基因靶点验证的药物剂量如下:环孢素，50 nM;他克莫司0.25 nM;Cgs-21680, 100µm;TGFβ， 10ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．在功能性癌细胞杀伤实验中，使用IncuCyte系统。为了验证TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞电阻TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}按照上述方法分离细胞，并与供体匹配的cfse染色效应T细胞以不同细胞对细胞的比例混合。在功能性癌细胞杀伤实验中，使用IncuCyte系统。gydF4y2Ba

Western blot检测活性RAS蛋白和磷酸化蛋白gydF4y2Ba

为了进行免疫印迹实验，T细胞在RPMI (Gibco 21870076)中在37°C下血清饥饿2小时。饥饿后，用12.5 μl ml免疫培养液刺激细胞0、5、10、30、60 mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在37°C的水浴中。在每个时间点之后，用冰冷的PBS淬灭刺激，细胞在300℃下旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下加热5分钟。将每个颗粒重新悬浮在Pierce RIPA缓冲液(Thermo Fisher 89901)中，在4°C下孵育40分钟。细胞裂解物储存在−80°C，直到进一步使用。使用Pierce BCA蛋白测定法(Thermo Fisher 23227)测定蛋白浓度。每个样品15微克蛋白质加载到4-15%三甘氨酸SDS凝胶(Bio-Rad)上，然后使用Biorad Trans-Blot转移系统转移到PVDF膜(Bio-Rad)上。用5%的牛奶在TBST中阻塞膜，在4°C下与一抗孵育过夜。使用的一抗:p-ERK (4370)， p-MEK(9154)(细胞信号技术)，vinculin (MAB3574) (Millipore Sigma)， RASA2 (HPA035375) (Sigma Aldrich)， β-肌动蛋白兔单克隆(辣根过氧化物酶(HRP)偶联)(Cell Signaling 5125)，抗兔HRP抗体(Cell Signaling 7074)，抗小鼠IgG, HRP连接抗体(Cell Signaling 7076)， RASA2兔抗人GAP1m (NBP1-89794 Novus Biologicals)， GAPDH小鼠抗人GAPDH (sc-47724 Santa Cruz Biotechnology)，山羊抗兔IgG-HRP (111-036-045 Jackson免疫研究)和山羊抗小鼠IgG-HRP (sc-2005 Santa Cruz生物技术)。gydF4y2Ba

膜在UCSF的Azure生物系统600成像系统上成像，并在圣裘德的奥德赛Fc成像系统(LI-COR生物科学)上成像。gydF4y2Ba

对于活性RAS试验，T细胞和Jurkat细胞(ATCC(克隆E6-1))在RPMI (Gibco 21870076)中在37°C下血清饥渴2小时。饥饿后，用12.5 μl ml的Immunocult刺激T细胞5mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在37°C的水浴中。一旦孵育完成，用冰冷的PBS淬灭刺激，细胞在4°C, 300℃下旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。进一步的检测按照RAS活化检测试剂盒(Cytoskeleton BK008)的方案进行。gydF4y2Ba

western blot凝胶的密度分析采用ImageJ v1.52q软件。使用“Analyze”菜单下的set measurements选项，我们将测量值设置为分析的平均灰色值。接下来，使用矩形工具定义感兴趣的区域(ROI)，在感兴趣的带周围绘制一个框架。使用相同的ROI来量化所有波段。使用与蛋白质相同的框架，测量该蛋白质的背景。我们重复加载控制的步骤并记录测量结果。为了进行分析，将波段/控件的像素密度倒置，其背景表示为255−gydF4y2BaXgydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaXgydF4y2Ba是蛋白质带或加载控制带的值。蛋白质条带和加载对照的净值由反向条带值减去反向背景值来计算。相对定量值计算为净蛋白质带值与该车道净负荷控制带值的比值。gydF4y2Ba

流式细胞仪检测gydF4y2Ba

对于细胞表面活化标记物，2 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba到5 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaTCR T细胞在96孔的圆底板中每孔播种。12.5 μl ml免疫培养刺激TCR T细胞gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在37°C下放置4-6小时。CAR - T细胞通过与CD19共培养而受到刺激gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNalm6白血病细胞，1:1 E:T比，37℃，4-6小时。然后，将细胞离心，用200 μl细胞染色缓冲液洗涤一次，用抗体(100 μl染色缓冲液中每5 μl抗体)在4℃黑暗条件下染色30 min。用Attune NXT细胞仪(Invitrogen)读取样品，用FlowJo 10.7.1分析。对于衰竭和分化标记，细胞不刺激，而是如上所述进行染色。使用的抗体:Brilliant Violet 421 CD69 (Biolegend 310930)， FITC抗人CD154 (Biolegend 310804)， PE抗人CD25 (Biolegend 302606)， FITC抗人CD279 (PD-1) (Biolegend 621612)， Brilliant Violet 711 CD223 (lag3) (Biolegend 369320)， Brilliant Violet 421抗人CD366 (tim3) (Biolegend 345008)， PE抗人CD39 (Biolegend 328208)， PE抗人CD62L (Biolegend 304806)， PE CD19 (Beckman Coulter IM1285U)和APC CD19 (Beckman Coulter IM2470U)。gydF4y2Ba

磷酸化流式细胞术:2 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba到5 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaTCR T细胞每孔接种于96孔圆底平板(Corning 877254)， 12.5 μl ml免疫培养法刺激gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在37°C下加热5、10和30分钟。对于CAR - T细胞染色，CAR - T细胞与CD19共培养活化gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNalm6白血病细胞在圆形底96孔板中，E:T比例为1:1，在400孔板中短暂旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba37℃孵育5分钟。处理结束时，用预热的BD Phosflow Fix Buffer I (BD Biosciences 557870)在37℃下固定细胞10分钟。细胞用染色缓冲液(FBS)清洗一次(BD Biosciences 554656)。接下来，通过添加BD Phosflow Perm Buffer III渗透细胞，并在−20°C下孵育30分钟至一夜。清洗两次，用抗体(每100 μl染色缓冲液中含有5 μl抗体)在室温黑暗中孵育30分钟，然后用染色缓冲液(FBS)洗涤两次。使用Attune NXT细胞仪(Invitrogen)读取样品，并使用FlowJo 10.7.1分析。所使用的抗体:抗mek1 (pS218)/MEK2 (pS222) (BD 562460)， Alexa Fluor 488抗erk1 /2磷酸化(Thr202/Tyr204) (Biolegend 675507)， PE抗erk1 /2磷酸化(Thr202/Tyr204) (Biolegend 369506)， Brilliant Violet 421抗rps6磷酸化(Ser235/Ser236) (Biolegend 608610)， PE Mouse抗4ebp1 (pT36/pT45) (BD 560285)， Brilliant Violet 421抗akt (pS473) (BD 562599)， PE抗p38 MAPK磷酸化(Thr180/Tyr182) (Biolegend 690204)。gydF4y2Ba

细胞内细胞因子染色:12.5 μl ml免疫培养刺激TCR T细胞gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}brefeldin A (eBioscience 00-4506-51)在37°C作用4-6小时。用于CAR - T细胞刺激，T细胞和CD19gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNalm6白血病细胞以1:1 E:T比例共培养，与布莱菲丁A在37℃孵育4-6 h。接下来，用Fix & Perm Cell Permeabilization Kit (Thermo Fisher Gas004)对细胞进行固定和渗透，并与氟铬偶联抗体(100 μ l染色缓冲液中每5 μ l抗体)在室温下黑暗中孵育20分钟。使用Attune NXT细胞仪(Invitrogen)读取样品，使用FlowJo 10.7.1分析。使用的抗体:PE小鼠抗人IFNγ (BD Biosciences 554701)， BV711小鼠抗人IL-2 (BD Biosciences 563946)， Pacific Blue抗人TNF (bioolegend 502920)。gydF4y2Ba

为了进行有丝分裂追踪器探针染色，将T细胞置于96孔板中，每孔20万个细胞，在25 nM的有丝分裂追踪器绿色FM (M7514)或有丝分裂追踪器红色CMXRos (M7512)中，在100µl的温X-Vivo培养基中孵育30分钟。然后用温的完全X-vivo培养基按1:1的体积淬灭细胞，旋转，用温的X-vivo培养基洗涤两次，5% FBS/PBS重悬，然后在Attune流式细胞仪上分析。gydF4y2Ba

用于骨髓分离细胞流式细胞术实验的抗体和试剂包括:PE-Cyanine7抗人CD8a (eBioscience 25-0087-42)， APC-Cy7小鼠抗人CD45 (BD Biosciences 557833)， BUV395小鼠抗人CD4 (BD Biosciences 563550)， BV421小鼠抗人CD62L (BD Biosciences 563862)， BV650小鼠抗人CD45RA (BD Biosciences 563963)， BV480小鼠抗人CD279 (PD-1) (BD Biosciences 566112)， PerCP-eFluor 710抗人CD223 (LAG-3) (eBioscience 46-2239-42)， BUV737小鼠抗人CD19 (BD Biosciences 564303)，BV785抗人CD366 (Tim-3) (Biolegend 345032)， PE CD127 (IL7RA) (Biolegend 351304)， PE抗人EGFR (Biolegend 352904)， 7-AAD (Invitrogen A1310)，计数珠(Invitrogen C36995)对于这些抗体染色，细胞在100µl总染色缓冲液中2µl抗体中重悬(参见“骨髓CAR - T细胞分离、处理和染色”)。gydF4y2Ba

测定抗原剂量-反应曲线的滴定法gydF4y2Ba

T细胞被分离、激活，用含有NY-ESO-1 1G4 TCR的慢病毒转导，并如上所述对RASA2或AAVS1进行编辑。TCR T细胞(2 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba到3 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba)每孔播种，用Immunocult刺激。在pERK染色中，将T细胞(包括转导和未转导的T细胞作为对照)在37℃下以50 μl ml的Immunocult最高剂量刺激2 min、5 min、10 mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}连续稀释2。T细胞在37℃下以12.5 μl ml的Immunocult最高剂量刺激24 h，作为活化标记物gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}连续稀释2。后续染色按上述方法进行。gydF4y2Ba

为了测量T细胞对抗原特异性TCR再刺激的敏感性，用Immunocult刺激原代人T细胞，24小时后用浓缩慢病毒转导以表达ny - eso -1特异性T细胞受体，24小时后如上文所述，rnp -编辑RASA2或AAVS1。抗原提呈T2细胞gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba(ATCC CRL-1992)装上NY-ESO-1gydF4y2Ba_{157 - 165gydF4y2Ba}肽SLLMWITQV (Thermofisher)在37°C孵育1小时。肽的最高终剂量为18 μM，随后按log5连续稀释。用培养基洗涤两次，去除未结合的肽。加入抗原特异性编辑的T细胞，让其与T2细胞相互作用10分钟，然后通过添加固定缓冲液，使用流式细胞仪进行pERK染色，停止反应。gydF4y2Ba

使用Jurkat细胞系的转录报告gydF4y2Ba

激活蛋白1 (AP-1)、活化T细胞核因子(NFAT)和核因子κB (NF-κB)转录活性的Jurkat T细胞报告系统是Kole Roybal(加州大学旧金山分校)提供的礼物，并如前所述生成gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．用12.5 μl ml的Immunocult对Jurkat报告细胞进行tcr刺激gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，然后连续稀释2，以达到一定的激活水平。每24小时用流式细胞仪检测细胞mCherry水平。gydF4y2Ba

转基因的产生gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba

创造一个转基因生物gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba利用In-Fusion克隆试剂盒(Takara)将RASA2 ORF (NM_001303246.2, GenScript)克隆到逆转录病毒pSFG载体中，并在N端添加一个Flag标签。将GFP或CAR转基因插入与RASA2相同的逆转录病毒pSFG主干中，作为转基因过表达对照。为了生成表达转基因RASA2的T细胞，使用与CAR - T细胞生成相同的方法进行细胞转导。简而言之，逆转录病毒颗粒是通过将编码rasa2的SFG逆转录病毒载体、编码MoMLV gag-pol的Peg-Pam-e质粒和编码RD114包膜蛋白的质粒瞬时转染HEK293T细胞而产生的。48小时后收集上清液，过滤后冷冻，用于T细胞转导。western blot检测RASA2基因表达。gydF4y2Ba

重复刺激试验gydF4y2Ba

肿瘤细胞在共培养前一天在完整的RPMI培养基中播种。完整的RPMI培养基包括RPMI (Gibco 21870076)、10%胎牛血清、1%胎牛血清gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺，1%青霉素链霉素。第二天，将RPMI培养基替换为T细胞培养基，在肿瘤细胞上以1:1的E:T比例和IL-2, 50iu ml接种抗原特异性T细胞gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．随后每48小时重复共培养一次。对于每一次共培养，使用Vi-CELL XR细胞计数器和活力分析仪收集和计数T细胞，并以1:1的E:T比重复到新鲜的靶肿瘤细胞上。在使用T细胞进行任何检测之前，使用EasySep Release Human CD45阳性选择试剂盒(Stem Cell 100-0105)收集、计数和纯化T细胞或通过流动分选纯化T细胞。在ELISA实验中，用靶细胞(A375)刺激TCR T细胞5次后，根据制造商的说明，使用LEGENDplex Human CD8/NK Panel 13-plex (bilegengend 740267)收集共培养上清液并进行分析。gydF4y2Ba

RNA-seq基因表达分析gydF4y2Ba

T细胞在24孔板中进行重复刺激试验，每48小时将T细胞转移到新播种的癌细胞中。每次刺激后，使用BD FACSAria Fusion对培养的T细胞进行分类，从与靶癌细胞共培养的T细胞中获得纯的NY-ESO-1多聚体阳性T细胞，并在TRI试剂(Sigma T9424)中重悬。根据制造商的方案，使用Direct-zol RNA MicroPrep试剂盒(Zymo Research R2061)提取总RNA，并按照前面描述的方法准备测序gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba由加州大学伯克利分校的功能基因组学实验室进行测序，并由加州大学伯克利分校的文森特·j·科茨基因组学测序实验室进行测序。评价动力学gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba在重复刺激试验过程中，NY-ESO-1 TCR或anti-CD19 CAR - T细胞被靶细胞和TCR刺激5次gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或汽车gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba每次刺激48小时后对细胞进行FACS分选(NGFRt报告)。细胞在TRI试剂(Sigma T9424)中重悬。根据制造商的方案，使用Direct-zol RNA MicroPrep试剂盒(Zymo research R2061)提取总RNA，并按照前面描述的方法准备测序gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba由加州大学伯克利分校的功能基因组学实验室进行测序，并由加州大学伯克利分校的Vincent J. Coates基因组学测序实验室进行测序。比较基因之间的表达gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba细胞经过上述重复刺激试验，使用可释放的人类CD45阳性选择试剂盒(Stemcell technologies 100-0105)进行五次刺激后分离，制成颗粒，并将RNAlater (Thermofisher, AM7020)发送到加州大学戴维斯基因组中心的DNA技术和表达分析核心进行批量标记-测序rna -测序。gydF4y2Ba

为了分析基因表达，使用Kallisto将reads映射到人类参考转录组(GRCh38 Ensembl release 96)gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba使用默认参数。在80%以上的样本中，计数为零的基因被过滤掉。用R包DESeq2进行差异基因表达gydF4y2Ba^57gydF4y2BaV1.32.0，控制供体方差。差异基因表达分析结果见补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．R包fgseagydF4y2Ba^58gydF4y2Ba采用v1.18.0进行GSEA，根据DESeq2检验统计量和MSigDB v7.2标志基因集进行基因排序gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba参照基因列表。gydF4y2Ba

GEO和BioGPS发表的基因表达数据集分析gydF4y2Ba

为了确定RasGAP基因家族的组织特异性表达，从BioGPS网站下载了人类U133A基因图谱，并使用BioMart将探针id与基因符号匹配。为了便于基因之间的比较，每个基因的表达值被缩放到最小为0，最大为1。在扩展数据图中，只有前2%的表达组织被标记。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba．该数据集中显示了所有可用的RasGAP家族成员的数据。gydF4y2Ba

找到相关的基因gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba免疫细胞中的表达(扩展数据图。gydF4y2Ba5 e, fgydF4y2Ba)， R包correlationAnalyzeRgydF4y2Ba^60gydF4y2Ba使用V1.0.0。仅使用定义为“正常”(非肿瘤)和“免疫”组织的数据集来寻找与RASA2表达的Pearson相关系数(R)。符号相关系数被用来排序所有基因基于他们的相关gydF4y2BaRASA2gydF4y2BaGSEA的表达和分析如上所述。gydF4y2Ba

生成图。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba我们发表的来自原代人T细胞的scRNA-seq CROP-seq数据是从基因表达综合(GEO)登录中下载的gydF4y2BaGSE119450gydF4y2Ba并加工生成基因表达和sgRNA条形码矩阵，如前所述gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．受刺激细胞间差异表达的基因表达gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba使用Seurat的FindMarkers函数分析sgRNA和非靶向控制指南(ctrl)gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba4.0 R包。只有来自受刺激样本的细胞有这两种gydF4y2BaCD3DgydF4y2Ba，gydF4y2BaCBLBgydF4y2Ba，gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba使用非靶向(ctrl) sgRNA计算图中各基因的平均表达量。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

生成图。gydF4y2Ba2 l, ngydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 h,我gydF4y2Ba，经处理的RNA-seq数据集从GEO (gydF4y2BaGSE89307gydF4y2Ba，gydF4y2BaGSE86881gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGSE138459gydF4y2Ba分别)。对于每个数据集，的表达式gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba从计数矩阵中提取，并缩放到最小值为0，最大值为1，以便进行基因间比较。无花果。gydF4y2Ba2米gydF4y2Ba， RASA2的表达数据从DICE数据库中下载gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba（gydF4y2Bahttps://dice-database.org/gydF4y2Ba)．对于人类TIL数据(图;gydF4y2Ba2 ogydF4y2Ba)，每个数据集的RASA2表达式数据从门户网站下载(gydF4y2Bahttp://crc.cancer-pku.cngydF4y2Ba而且gydF4y2Bahttp://lung.cancer-pku.cngydF4y2Ba)．仅使用来自外周和肿瘤样本的标记为“CD8 T细胞”的细胞数据进行分析。gydF4y2Ba

海马化验gydF4y2Ba

通过细胞外通量分析进行代谢表型分析。通过评估OCR测定线粒体底物依赖性和最大呼吸水平。使用96孔细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)测量OCR。简而言之，使用CD45分离试剂盒(100-0105)从培养物中分离TCR T细胞或CAR - T细胞，并将其镀在预涂有poly-的96孔板上gydF4y2BadgydF4y2Ba-赖氨酸(103729-100)在4 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba每孔用50 μl Seahorse XF RPMI添加10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸和2 mM谷氨酰胺(Seahorse XF RPMI测定培养基包装103681-100)。电镀后，将细胞留在培养箱中1小时，以确保与孔的粘附。在显微镜下观察，确认粘附均匀、融合后，加入补充的Seahorse XF RPMI培养基130 μl，使体积达到180 μl /孔。然后将这些镀好的细胞置于CO中1小时gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}在使用Seahorse仪器开始测量之前，在37°C的自由培养箱中。海马水藤应激试验采用海马XF Cell水藤应激试验试剂盒(103015-100)，底物氧化应激试验采用安捷伦XF底物氧化应激试验试剂盒，具体为XF长链脂肪酸氧化应激试验试剂盒(103672-100)、XF葡萄糖/丙酮酸氧化应激试验试剂盒(103673-100)和XF谷氨酰胺氧化应激试验试剂盒(103674-100)。使用的药物最终浓度为:寡霉素1.5 μM;羰基氰化物,gydF4y2BapgydF4y2Ba-三氟甲氧基苯腙(FCCP)， 1 μM;鱼藤酮+抗霉素A, 0.5 μM;依托莫西，4 μM;Uk5009, 2 μm;BPTES 3 μM。实验是按照制造商的说明进行的。所有海马分析均在海马XFe96分析仪上进行。gydF4y2Ba

NY-ESO-1 TCR T细胞与A375或Nalm6异种移植模型gydF4y2Ba

8 - 10周大的男性或女性NOD-SCIDgydF4y2BaIl2rggydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}(NSG)小鼠(gydF4y2Ba亩骶gydF4y2Ba(品系#005557)是从Jax购买的或内部培育的。所有小鼠都按照UCSF IACUC批准的规程进行安置和治疗。小鼠被安置在UCSF LARC动物护理设施的海伦·迪勒家族癌症中心或UCSF帕纳萨斯。它们被安置在一个单独的无特定病原体的房间里。它们被安置在通风笼中，每个笼中最多5只老鼠，在12小时的光照周期中自由地提供食物和水，并控制温度和湿度条件(19-23°C和30-70%)。UCSF使用的IACUC协议包括UCSF临床前治疗核心(IACUC协议an194778 - AN179937的延续)和马森实验室(AN180228-03B)。为了确保同等的治疗前肿瘤负荷，小鼠在T细胞注射前按肿瘤负荷随机分组。对于A375黑素瘤异种移植研究，NSG小鼠植入1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba第0天皮下注射A375黑色素瘤细胞。第7天，1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaNY-ESO-1 TCRgydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞通过静脉注射注入尾静脉。用卡尺测量A375细胞进展。对于NY-ESO-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNalm6白血病研究，NSG小鼠静脉注射0.3 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba表达ny - eso -1的Nalm6白血病细胞在第0天，其次为0.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba对照编辑或RASA2-KO ny - eso -1特异性TCR T细胞。使用Xenogen IVIS成像系统(Xenogen)和Living Image软件(Xenogen)进行生物发光成像，以获取成像数据集。当肿瘤测量最大尺寸达到2厘米时，或当小鼠表现出IACUC协议中描述的发病迹象时，如呼吸窘迫、驼驼的姿势、对治疗无反应的病变、身体状况评分为2或更低、体重减轻15%、活动能力受损或下降、肿瘤溃疡或干扰正常功能、干扰正常功能的神经体征时，在IACUC批准的终点对小鼠进行人道安乐死。毛发梳理和勃起减少，或直肠脱垂。在任何实验中都没有超过这些限制。在所有体内实验中，被分配到不同实验组的小鼠的性别、年龄和住所都是匹配的。没有使用统计方法来预先确定样本量。样本量是根据初步实验和先前发表的结果估计的。我们努力使最小样本量达到gydF4y2BangydF4y2Ba= 5只小鼠每个治疗组，这证明足以重复观察统计学显著性差异。每个图例中说明了样本量。对于所有的体内实验，小鼠随机化和注射总是由临床前治疗核心的一名失明成员或马森实验室的一名失明成员完成。肿瘤负荷的测量、小鼠的监测和肿瘤负荷分析由临床前治疗核心的成员进行，这些成员对实验组不知情。对于体内细胞表型和再挑战实验，当临床前治疗中心的工作人员不可用时，J.C.收集数据，并没有对各组进行盲法。为了进行骨髓和脾组织的组织病理学分析，血液病理学家不了解实验组。gydF4y2Ba

CD19-CAR - T细胞和NALM6异种移植模型gydF4y2Ba

动物实验遵循UCSF机构动物护理和使用委员会批准的协议。8 ~ 12周龄NOD/SCID/IL-2Rγ-null (NSG)雄性小鼠通过Jax实验室或内部育种获得。小鼠静脉注射0.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba4 d后静脉注射0.1 ~ 0.2 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Bacd19特异性CAR - T细胞。通过上述生物发光成像监测肿瘤负荷。在所有体内CAR - T细胞实验中，小鼠在生物发光成像结果的基础上随机进行，以确保在T细胞转移前每组肿瘤负荷分布均匀。gydF4y2Ba

两组独立的NSG小鼠被平行处理，以评估CAR - T细胞单独对小鼠健康的影响。第一组注射0.2 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba如上所述，针对RASA2编辑的cd19特异性CAR - T细胞与对照指南。第二个队列作为抗原体验队列，其中NSG小鼠植入0.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaFFLuc-GFP NALM-6细胞，然后以肿瘤清除剂量注射cd19特异性CAR - T细胞。根据UCSF IACUC协议，对小鼠进行生物发光成像随访，并通过体重和任何发病迹象进行监测。生物发光测量表明，接受NALM6细胞的队列在第18天清除了这些肿瘤。经过长时间的监测，来自这些队列的小鼠在第116天被安乐死。小鼠组织(脾脏，骨髓和淋巴结)固定在磷酸盐缓冲福尔马林。在植入前，用含有市售脱钙液的甲酸对胸骨进行脱钙。组织进行石蜡包埋，切片，苏木精和伊红染色。组织最初由UCSF临床前治疗核心的一名失明成员审查，以寻找病理异常的证据，而不了解产生个体动物组织的实验。组织切片由一名盲目的UCSF血液病理学家复查。使用Hemavet 950仪器从这些小鼠的血液中测量全血细胞计数。gydF4y2Ba

在复攻实验中，对供体进行了测试，发现在0.2 × 10的相同CAR - T细胞剂量下，供体表现出持久的肿瘤控制gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba车gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba每只老鼠的CAR - T细胞。然后将同样的0.5 × 10植入另一组小鼠gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba4 d后静脉注射0.2 × 10的NALM-6细胞gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCD19汽车gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCAR - T细胞编辑gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba而不是以前的控制指南。在本例中，CAR - T细胞注射后，再给小鼠注射1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaFFLuc-GFP NALM-6细胞分别静脉注射7-11天。根据UCSF IACUC协议，我们对小鼠进行了一段时间的生物发光成像随访，并根据体重和上述任何疾病迹象进行监测。在任何实验中都没有超过这些限制。gydF4y2Ba

骨髓CAR - T细胞分离、加工及染色gydF4y2Ba

含nalm -6小鼠用2 × 10处理gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba来自捐赠者的TRAC CAR - T细胞先前测试了体内白血病控制效果，并在输注后的第7天和第16天安乐死。提取骨髓时，分离出每条腿的长骨，用PBS在研钵和杵中碾碎，然后用PBS通过细胞过滤器冲洗。然后将细胞离心，用ACK裂解缓冲液(118-156-721,Quality Biological)处理2 min进行红细胞裂解，用FACS缓冲液淬灭反应。每只小鼠剩余的细胞用300 μl的FACS缓冲液重悬。加入Fc阻断(每个样品10 μl) (130-092-575, Miltenyi Biotec)后，细胞进行CAR染色(每个样品1 μl) (115-606-07, Jackson ImmunoResearch)，室温孵育30分钟。洗净后，用2%正常小鼠血清(Millipore-Sigma)和Fc block (10 μl)重悬，室温孵育20 min。然后用相应的抗体混合物(100 μl /管染色容积;上述在流式细胞术方法部分发现的特异性抗体)在室温下孵育45分钟。染色后，细胞洗净重悬于300 μl FACS缓冲液中，计数珠(50 μl /样品)(C36950, ThermoFisher Scientific)，流式细胞仪分析。gydF4y2Ba

体内CD19 CAR - T细胞竞争实验gydF4y2Ba

CD19 TRAC CAR - T细胞如上所述，使用前面描述的CAR结构生成gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．简而言之，该结构包括一个pAAV-TRAC-1928z，包含1.2 kb的基因组TRAC，位于gRNA靶向序列的两侧，一个具有TRAC第一个外显子的自切割P2A肽，随后是1928z CAR和第二个自切割P2A肽。在本实验中，我们使用了该结构的一个版本，该版本包含或不包含截断形式的EGFR (EGFR-t)序列，随后是第三个自裂解P2A肽。如上所述，对这两种不同的CAR - T种群进行了编辑gydF4y2BaAAVS1gydF4y2Ba轨迹或gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba轨迹。最终的产物包括四种CAR - T细胞群，gydF4y2BaRASA2 -gydF4y2Ba编辑CD19 TRAC CAR - T细胞加和不加EGFRt，以及gydF4y2BaAAVS1 -gydF4y2Ba编辑CD19 TRAC CAR - T细胞加和不加EGFRt。然后将这些种群组合成两个混合种群，混合1 (gydF4y2BaAAVS1gydF4y2Ba不含EGFRt +的CD19 TRAC CAR - T细胞gydF4y2BaRASA2 -gydF4y2Ba编辑CD19 TRAC CAR - T细胞与EGFRt)和mix 2 (gydF4y2BaAAVS1 -gydF4y2Ba用EGFRt +编辑CD19 TRAC CAR - T细胞gydF4y2BaRASA2 -gydF4y2Ba编辑CD19 TRAC CAR - T细胞不含EGFRt)。这两个混合种群的混合百分比被证实约为50%:在输注到携带nalm6的小鼠的当天，每个混合输入种群的混合百分比为50%。注射后第7、16天处死小鼠，骨髓处理如上。通过CAR和EGFR染色来确定在这些时间点从骨髓中分离出的AAVS1-KO和RASA2-KO CAR - T细胞的最终百分比。gydF4y2Ba

EphA2-CAR RASA2-KO T细胞生成gydF4y2Ba

先前已经描述了编码EphA2 CARs的逆转录病毒载体的生成gydF4y2Ba^{48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba}．转染前2天，将HEK293T细胞以每10 cm培养皿1 - 200万个细胞的数量进行瞬时转染，获得逆转录病毒颗粒，并在含10%胎牛血清的DMEM中培养。细胞转染CAR逆转录病毒质粒，逆转录病毒包装质粒Peg-Pam3-E和编码RD114包膜蛋白的质粒，使用GeneJuice转染试剂按照制造商的方案(Novagen 70967)进行转染。转染48小时后，收集病毒上清液，以400度旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba用0.45- m过滤器过滤5分钟，去除细胞碎片。然后将病毒上清快速冷冻并在−80°C保存，直到进一步使用。gydF4y2Ba

为了生成EphA2-CAR RASA2-KO T细胞，根据irb批准的圣裘德儿童研究医院(SJCRH)的方案，从健康献血者的全血中获得人pbmc。为了产生CAR - T细胞，我们通过淋巴细胞梯度离心法分离出pmcs。第0天，在经过非组织培养处理的24孔板上刺激pmcs，这些板上预先涂有CD3和CD28抗体(抗CD3/CD28;Cd3: okt3, cd28: 15e8;Miltenyi研究)。重组人IL-7和IL-15 (IL-7: 10 ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；IL-15: 5 ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；培养第1天添加PeproTech)。用核糖核蛋白(RNPs)靶向电穿孔T细胞gydF4y2BaRASA2gydF4y2Ba第2天使用Lonza 4D电转换仪，第3天用EphA2 car编码逆转录病毒载体转导。sgRNA被设计用于靶向AGATATCACACATTACAGTG (g1)、AGGATCGACTTGTGGAACAA (g2)或非靶向引导序列AGTAGTCGGGATGTCGGCG。将3 μl 60 μM sgRNA (Synthego)与1 μl 40 μM Cas9 (Macro Lab, University of California, Berkeley)混合制备RNPs, sgRNA:Cas9比例为4.5:1，冷冻备用。对于RASA2 KO, 1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba将T细胞重悬于17 μl P3核载体主液(Lonza P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit S, V4XP-3032)中，加入3 μl RNP。使用EH-115程序电穿孔20微升细胞+ RNP。将1个20 μl电穿孔反应转移到48孔组织培养处理板的1孔中，其中RPMI 1640添加20% FBS, 1% Glutamax, 10 ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IL-7, 5 ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IL-15(恢复介质)过夜。第二天，使用电穿孔细胞进行CAR转导。gydF4y2Ba

T细胞转导时，将500 μl病毒上清液在RetroNectin (Clontech)涂层的24孔非组织培养板上旋转，温度为2000gydF4y2BaggydF4y2Ba90分钟。旋转后，去除病毒上清，电穿孔T细胞以2.5 × 10镀膜gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba每孔细胞在2毫升恢复培养基中。48小时后，car - T细胞从retronectin涂层板转移到组织培养板上，并在添加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、10 ng ml的RPMI 1640中扩增gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IL-7, 5 ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IL-15。T细胞转导后4-6天用CD19-PE(克隆J3-119, Beckman Coulter)评估CAR表达。未转导的T细胞被用作门控的阴性对照。样品用PBS (Lonza)和1% FBS (Cytiva)清洗和染色。LIVE/DEAD固定水死细胞染色试剂盒(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)用作活性染料。采用FACSCanto II (BD)仪获取流式细胞术数据，使用FlowJo v10进行分析。gydF4y2Ba

EphA2-CAR - T细胞和LM7异种移植模型gydF4y2Ba

动物实验遵循圣裘德儿童研究医院机构动物护理和使用委员会批准的协议。8 - 10周龄的雌性NSG小鼠来自SJCRH NSG菌落。小鼠被安置在圣裘德动物资源中心(ARC)的无特定病原体的个体套房中，该中心是完全经aaalac认证的设施。St Jude G.K.实验室使用的IACUC协议为623-100650。每个笼中最多5只小鼠被安置在通风笼中，在12小时的光照周期中自由地提供食物和水，并控制温度和相对湿度条件(19-23°C和30-70%)。被分配到不同实验组的小鼠性别、年龄和住所相匹配。当iacuc批准的生物发光终点肿瘤测量达到>10时，对小鼠进行人道安乐死gydF4y2Ba^{10克ydF4y2Ba}光子年代gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba或当小鼠表现出IACUC协议中描述的窘迫迹象时，如呼吸窘迫、驼驼的姿势、对治疗无反应的病变、15-20%的体重减轻、活动能力受损或下降、干扰正常功能的神经体征或梳洗减少。在任何实验中都没有超过这些限制。小鼠腹腔注射1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaLM7-GFP-ffluc骨肉瘤细胞。7 d后腹腔注射1 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaCAR - T细胞。该实验用来自两名不同健康捐赠者的CAR - T细胞进行了两次。在第二个实验中，长期无肿瘤存活的小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba控制KO = 1，gydF4y2BangydF4y2BaRASA2 KO = 3)再次挑战，腹腔注射1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba174天LM7-GFP-ffluc肿瘤细胞。通过生物发光成像监测肿瘤负荷。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba