体内单分子分析显示gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaRNA结构多样性gydF4y2Ba

COOLAIRgydF4y2Ba转录本可在近端位点多聚腺苷化，产生约400个核苷酸(nt)的I类转录本，或在远端位点多聚腺苷化，产生约600 - 750个核苷酸(nt)的II类转录本gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．不同的gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba异构体在功能上与r -环介导的染色质沉默、转录解抑制有关gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba寒冷条件下的转录沉默gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}通过尚不为人所知的机制。RNA的二级结构正在成为RNA功能的重要调节因子gydF4y2Ba^{8 gydF4y2Ba}．体外合成的结构分析gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba揭示了II类的进化守恒gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba结构，尽管低核苷酸序列相同gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．然而，知识的gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba体内结构是了解其功能和复杂性的必要条件gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba在活细胞中。目前的化学探测方法限制了这一目的，原因有两个:第一，不可能使用短读测序平台准确地描绘全长结构景观，并区分异构体之间共享区域的结构;其次，RNA构象的异质性使化学探测后RNA二级结构的查询变得复杂。尽管这些技术最近有所改进gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba补充讨论gydF4y2Ba)，直接识别不同RNA异构体和确定单分子体内构象的能力仍然困难。因此，我们开发了一种基于单分子的RNA二级结构探测方法，能够直接确定单个RNA异构体的结构构象。gydF4y2Ba

COOLAIRgydF4y2Ba都参与了调节gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba决定暖生植物冬季一年生或快速循环繁殖策略的转录输出gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba以及促进冷诱导的转录关闭，在春化过程中Polycomb抑制性复合物2稳定的表观遗传沉默之前gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．因此，我们描绘了所有主要异构体的体内RNA二级结构景观，即I类和II类gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba转录异构体(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)在野生型植物(ColgydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba)在温暖的条件下生长，经过两周的寒冷暴露gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba转录下调了吗gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．RNA结构测定采用引物延伸(SHAPE)化学探针分析体内选择性2 ' -羟基酰化gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗。SHAPE试剂，2-甲基烟酸咪唑内酯(NAI)，修饰所有四种RNA核苷酸的单链位点gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．提取的rna逆转录，修饰位点导致互补DNA (cDNA)突变(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．然后，我们将得到的cdna适配到PacBio平台进行单分子实时测序，我们称之为单分子RNA结构测序(smStructure-seq)。对得到的原始读数进行处理，以获得高精度的HiFi读数gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba根据nai -加合突变谱生成SHAPE反应性(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．为了对我们的smStructure-seq数据的重复性和准确性进行基准测试，我们计算了18S rRNA的SHAPE反应性。我们发现我们的smStructure-seq库具有很高的可重复性，Pearson相关性为0.95 (gydF4y2BaPgydF4y2Bavalue = 0.2 × 10gydF4y2Ba^{−16gydF4y2Ba})．通过比较我们的SHAPE反应与18S rRNA系统发育二级结构gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba，我们发现我们的smStructure-seq分析可以准确地研究体内的全长RNA结构(详细解释在扩展数据图的图例中提供。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们直接计算了I.i类，I.ii类，II类的SHAPE反应性配置文件。i和ii类gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba在温暖和寒冷条件下的异构体(图;gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．I. I类和I.ii类显示了相对较少的具有SHAPE反应性的核苷酸(超过95%的I类异构体的核苷酸在温暖生长的植物中没有显示nai -加合物突变)(扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．的gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaI类转录本与稳定的R-loop结构相关gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，这可能是低反应性的原因。在同一样品中，II类异构体的SHAPE反应性在温暖生长的植物中要高得多(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．II类之间的整体SHAPE剖面显著不同。i和ii类(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)，尽管这两种亚型大多由相同的序列组成。gydF4y2Ba

基于热力学参数的RNA结构分析旨在寻找热力学上有利的RNA结构gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．然而，长链非编码rna (lncRNAs)，如gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba，在共转录调控中动态参与，因此，热力学可能在确定体内RNA结构中起不完全作用gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．因此，我们为我们的smStructure-seq开发了一种分析方法，该方法采用了受单个SHAPE反应性谱约束的随机上下文自由语法(SCFG)，能够独立于热力学确定单RNA分子的RNA结构。我们将这种结构分析方法命名为DaVinci(通过随机上下文自由语法确定RNA结构构象的变化)。DaVinci可以从每个体内的SHAPE突变剖面中生成单个RNA结构的构象，从而构建广泛的RNA结构景观(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因为DaVinci利用每个单一的突变谱而不是平均的SHAPE突变谱，它可以在单分子分辨率上识别每种可能的构象。为了举例说明这一点，我们发现DaVinci可以识别HIV Rev反应元件(RRE)的一种神秘构象(构象3)。gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba基于化学反应性的聚类方法无法识别gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2中gydF4y2Ba)．当在RRE61中引入突变时，这种隐式构象成为主要构象(gydF4y2Ba补充讨论gydF4y2Ba；更多的验证显示在扩展数据图中。gydF4y2Ba2 f-hgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．利用达芬奇，我们确定了至少三种主要的结构构象gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaII级。我，the most abundant (Extended Data Fig.1gydF4y2Ba) II类异构体在温暖条件下(84.6%为温暖构象1;10%温构象2和5.4%温构象3;无花果。gydF4y2Ba2模拟gydF4y2Ba)．这些在体内的结构构象被组织成三个域(图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba):外显子1的5’结构域;外显子2的3 '主结构域(3m)或中心结构域;外显子2中也有3 '小结构域(3m)和柄结构域。所有三种热构象都显示出与体外II类的某种相似性。我的结构gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在5 '域和3m域有明显的差异，但在中心3m域有明显的差异(扩展数据图。gydF4y2Ba4 a、c、dgydF4y2Ba)．拓扑相似性(树对齐，TA)和碱基配对相似性(阳性预测值，PPV)的测量结果一致表明，离体结构与温暖条件下构象之间的大部分差异都在中心结构域(3m结构域)(扩展数据图)。gydF4y2Ba4模拟gydF4y2Ba)．值得注意的是，这一区域被认为是由一个天然的核苷酸多态性改变的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaVar2-6(参考。gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba)，以提高第II类的产量。iv(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，这是一份罕见的ColgydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．II级。我v increases方法gydF4y2Ba通过一种共转录机制的表达，该机制涉及gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba新生的成绩单gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．我们对携带Var2-6的基因型进行了smStructure-seqgydF4y2Ba方法gydF4y2Ba等位基因渗入ColgydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．II类的体内结构。我v has a very short helix 4 (H4) and a merged H5 to extend H6 (Extended Data Fig.5 b, cgydF4y2Ba)．这些结构变化发生在与之相辅相成的地区gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba转录起始位点(TSS)(扩展数据图)gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)．因此，最大的构象变化在远端聚腺苷酸化gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba暖生植物的H4和H6之间的区域，称为超变区;的序列是互补的gydF4y2Ba方法gydF4y2BaTSS(扩展数据图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然后我们确定gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba暴露在寒冷环境中两周的植物的异构体特异性结构。冷处理后，I类转录本的SHAPE谱仍然显示出较低的修饰率(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)和第II类。我was still the most abundant class II isoform (Extended Data Fig.1gydF4y2Ba)．我们确定了至少三个II类。我conformations (68.1% cold conformation 1; 17.8% cold conformation 2 and 14.1% cold conformation 3 in Fig.3.gydF4y2Ba)．冷构象1和2在结构上与热构象1和2相似，但它们的相对比例略有变化(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．冷构象3与热构象3不同，在冷构象3中，H4和H6之间的区域连接成一个长茎(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．总的来说，有两种主要的II类结构构象。我，the relative proportions of which change in response to cold, with a new conformation emerging in cold-grown plants (cold conformation 3). Comparing the warm-specific (warm conformation 3) and cold-specific (cold conformation 3) structural landscapes of class II.i, the greatest structural difference again occurs in the hyper-variable H4–H6 region complementary to the方法gydF4y2Ba扩展数据图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

相比之下，强冷的上调gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Baii类异构体gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba，与第II类相比，它包含一个额外的外显子。我，was found not to adopt major conformations (Extended Data Fig.6 a、bgydF4y2Ba)．一类整体平均结构模型。ii揭示了四个域(扩展数据图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)，显示了该亚型的高结构多样性，如高shannon熵所示(扩展数据图。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．这一特性可能涉及到与friida (FRI)隔离相关的功能。gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba的主要激活剂gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba转录。FRI与一系列与RNA聚合酶II相关的共转录调控因子相关gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba启动子区域在温暖条件下是隔离的，在ii类。二、依赖方式，转化成生物分子凝聚物gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba冷暴露后的启动子gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们的多个结构比较已经确定H4-H6是一个高度可变的区域(扩展数据图。gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．为了分析该区域的潜在功能作用，我们生成了转基因植物，其中DNA包含四个核苷酸突变(mut)，旨在通过缩短H4和H5来增加H4 - h6区域的隆起(图4 - h6)。gydF4y2Ba4模拟gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．这四个突变的结构效应被smStructure-seq证实(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．然后，我们进行了系统的特征gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Bamut系中的转录异构体:基因的剪接模式和表达水平gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba不受影响(扩展数据图。gydF4y2Ba8个模拟gydF4y2Ba)．然而，染色质结合的比例II类。i增加了mut行(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)，表明第II类之间的相互作用增强gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaRNA和gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba染色质。通过RNA纯化(ChIRP)分离染色质证实了这一点，这表明II类染色质的关联增加gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba在整个gydF4y2Ba方法gydF4y2Bamut线中的TSS区域(图;gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba)．这个5 ' ChIRP信号之前已经被证明对蛋白酶K敏感gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}．杂种系产生的未剪接和剪接蛋白水平均较低gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba成绩单(无花果。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)，因此开花较早(图;gydF4y2Ba4 h,我gydF4y2Ba)．第二个突变体(mut-r)，其中引入核苷酸以减少凸起并增加H4-H6螺旋，表现与野生型转基因相似(扩展数据图)。gydF4y2Ba7得了gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因为引入的突变很接近gydF4y2Ba方法gydF4y2BaTSS，它们可能会影响感觉gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba转录活性本身。因此，我们将相同的突变引入转基因，其中反义gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba由于插入了gydF4y2Ba号gydF4y2Ba《终结者》(gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba2.0)gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba转录水平在杂种gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba和野生型的相似吗gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba行(WT -gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba)，高于杂种系(图;gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)，支持的要求gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba在开花时间的变化引起的突变。的必要性gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba为了与染色质相关联以影响这些功能变化，通过与野生型杂交携带mut转基因的一条线进行了测试。F分析gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba植物使我们能够检查是否gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba源自mutt转基因的影响gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba野生型等位基因表达。我们发现gydF4y2Ba方法gydF4y2BaF的表达水平gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba株系约为野生型亲本株系的50%(扩展数据图。gydF4y2Ba8 ggydF4y2Ba）;因此，结构突变仅在局部起作用gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba表达式。综上所述，增加H4-H6区域周围的隆起促进了agydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba染色质关联，减少转录输出gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba缩短了开花的时间。gydF4y2Ba

考虑到H4-H6区域与gydF4y2Ba方法gydF4y2BaTSS区，我们推断其构象依赖gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba染色质结合可能包括直接结合gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba来gydF4y2Ba方法gydF4y2BaDNA。潜在的,gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba可以补充gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba沃森链形成DNA-RNA双链，虽然我们还没有发现gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba在5 '端形成一个显著的r环gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．另外,gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba能与双链DNA (dsDNA)结合形成DNA - rna三联体吗gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）;H4-H6区域周围的序列含量(图;gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba)能够与dsDNA在位点形成三重结构gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba体外TSS(扩展数据图。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)．但是，由于蛋白酶K的敏感性gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}啁啾信号，我们赞成的模型gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba与一种蛋白复合物结合，该蛋白复合物与gydF4y2Ba方法gydF4y2BaTSS。FRI是建立局部染色体环境的关键gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba，因此我们测试了FRI在功能中的参与程度gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba构象通过分析结构突变的转基因(mut)在两种活性gydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba和零gydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba基因型(扩展数据图。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)．结构突变影响gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba表达式只在gydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba基因型(扩展数据图。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)．因此，除了物理上的FRI与gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaII级。我我在cold conditions, the structurally variable region ofCOOLAIRgydF4y2BaII级。我genetically interacts with FRI to regulate方法gydF4y2Ba在温暖的条件下表达。个人如何gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba不同异构体的结构构象影响gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba转录将是一个令人兴奋的未来研究领域。gydF4y2Ba

综上所述，单分子RNA结构分析方法的发展使我们能够直接确定反义转录物的体内RNA结构gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba．这种方法使每一种交替处理的结构构象成为可能gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba待描述的异构体。在应对寒冷的条件下，比例gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba采用某种构象会发生变化，新的构象会出现。横跨整个结构景观gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba，我们发现了一种构象变化最大的结构元素，它与gydF4y2Ba方法gydF4y2BaTSS。我们验证了这种结构元素在调节中的功能作用gydF4y2BaCOOLAIR-FLCgydF4y2Ba染色质协会gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba这表明RNA构象变化在植物的环境反应中起着功能性作用gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．我们的研究为lncRNA转录异构体如何采用不同的RNA结构构象，以及这些结构构象如何在功能上影响与染色质的关联并控制转录提供了见解。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估期间没有对分配盲目。在所有情况下的采样都是通过从不同的工厂独立收集材料进行的。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

Col基因型gydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba^SF2gydF4y2Ba(坳gydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba)和Var2-6近等基因系已在前面描述过gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba-gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{无足轻重的人gydF4y2Ba}，gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{mut-rgydF4y2Ba}，gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{无足轻重的人gydF4y2Ba}-gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{mut-rgydF4y2Ba}-gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba转基因系是否携带约12 kb的野生型或突变型gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba基因组片段。gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{无足轻重的人gydF4y2Ba}通过位点定向诱变引入四个核苷酸突变产生。gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba-gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{无足轻重的人gydF4y2Ba}-gydF4y2Ba特克斯gydF4y2Ba是通过插入gydF4y2Ba号gydF4y2Ba的第一个外显子中的终结者片段gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba在野生型或突变型gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba分别是基因组片段gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{mut-rgydF4y2Ba}通过位点定向诱变插入与H4-H6区域大凸起互补的片段(GAAATAAAGCGAGAACAAATGAAAACCCAGGT)产生。施工所用底漆见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．这些片段随后被克隆到SLJ77515中。gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba)，并转化为gydF4y2Ba拟南芥flc-2 FRIgydF4y2Ba基因型gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba用浸花的方法。在水稻中鉴定了单插入的抗Basta基因分离为3:1的转基因株系gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生成纯合子TgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba行。TgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba与的纯合子系gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{无足轻重的人gydF4y2Ba}在gydF4y2Baflc-2星期五gydF4y2Ba背景与Col交叉gydF4y2Ba星期五gydF4y2Ba(WT)为FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba8 ggydF4y2Ba)或与gydF4y2Baflc-2星期五gydF4y2Ba背景gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba^{无足轻重的人gydF4y2Ba}星期五gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

种子表面消毒后，在半强度Murashige和Skoog培养基上播种。4℃保存2-3天。对于暖生植物，幼苗在温暖的条件下(光照16小时，黑暗8小时，恒定20°C)生长10天。对于冷处理，在温暖条件下进行10天的预生长期后，在5°C(8小时光照和16小时黑暗条件)下进行2周的处理。gydF4y2Ba

(+)SHAPE和(−)SHAPE smStructure-seq库的构造gydF4y2Ba

我们使用SHAPE试剂NAI进行体内RNA二级结构化学探测。NAI是按照以前报告的那样准备的gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．简而言之,gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba用20ml 1× SHAPE反应缓冲液(100mm KCl, 40mm HEPES (pH 7.5)和0.5 mM MgCl完全覆盖幼苗gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)装在50毫升的Falcon试管中。将NAI添加到1 M的最终浓度，并在振动筛上旋转(1000转/分钟)。这种高浓度的NAI可以穿透植物细胞并在体内修饰RNA。用新制备的二硫苏糖醇(DTT)猝灭反应后，用去离子水清洗幼苗，立即用液氮冷冻并研磨成粉末。总RNA采用热苯酚法提取gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}，然后按照制造商的方案进行DNase I处理。对照组使用DMSO(标记为(−)SHAPE)制备，步骤与上述相同。然后，将2µg (+)SHAPE或(−)SHAPE RNA样品添加到包含2µl 0.5µM RNA - dna杂化接头(5 ' - rargrarurcrgrgrararcrarcrgrurcrarcrgrurcrarcrgrurcrargrururgrarargrararcrcrgrcrgrargrargrargrargrargrararcrcrcrcrgrgrargrargrararcrcrcrcrcrccgatctn (N =等摩尔a, T, g, C)和5 ' - gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctn (2.25 M NaCl, 25 mM MgCl)的19µl缓冲体系中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 100 mM Tris-HCl, pH 7.5)， 2µl 10× DTT (50 mM;新鲜或冷冻原料)和1µl tgurt - iii酶(10µM;InGex)。反应体系在室温下预孵育30分钟，然后1 μ l 25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP和dTTP的等摩尔混合物;每个直径25毫米;rna级)。整个反应体系在管中60℃孵育120 min。为了从模板中去除tgurt - iii酶，加入1 μ l 5 M NaOH，样品在95°C下孵育3分钟。样品冷却至室温，用1µl 5 M HCl中和，然后用MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN, 28204)清理cdna。捕获类I和类IIgydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba与18S rRNA一起，用特异性引物进行10个循环PCR反应(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)使用KOD Xtreme热启动DNA聚合酶(Novagen)。将8个重复PCR反应的扩增DNA片段合并以获得足够的DNA。所得到的DNA样本使用固相可逆固定尺寸选择系统(BECKMAN COULTER)进行尺寸选择。分别为(+)SHAPE和(−)SHAPE smStructure-seq库生成两个独立的生物重复。纯化的DNA样本由华大基因使用PacBio Sequel 3.0构建PacBio文库。gydF4y2Ba

smStructure-seq数据分析gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba亚型gydF4y2Ba

从(+)SHAPE和(−)SHAPE库中的原始读取被转换为HiFi读取(循环一致序列)使用' ccs ' (gydF4y2Bahttps://github.com/PacificBiosciences/ccsgydF4y2Ba)，参数为“——minPasses=3”，以达到99.8%左右的预测精度(Q30)gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．HiFi读取使用解复用条形码算法Lima v.1.11.0 (gydF4y2Bahttps://github.com/pacificbiosciences/barcodinggydF4y2Ba)．导出的HiFi读取被映射到两者gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba参考文献和18S rRNA(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)使用BLASR (v.5.3.3)gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba——minMatch 10 -m 5——hitPolicy leftmost '。每一次读取都被转换成一个“位向量”。简而言之，每个位向量对应于单个读取，由一系列0(表示匹配)和1(表示不匹配和明确对齐的删除的突变)组成。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．为了生成总体的SHAPE反应性概况，在给定核苷酸上的突变率(MR)就是1的总数除以该位置上的0和1的总数。II类原始形状反应gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba然后使用下面的等式为每个核苷酸生成:gydF4y2Ba

其中(+)SHAPE对应于nai处理的样品，(−)SHAPE指dmso处理的样品。真负率，1−MRgydF4y2Ba_{(−)形状gydF4y2Ba}，表示特定位置的特异性。原始SHAPE反应性(gydF4y2BaRgydF4y2Ba)从数学上估计SHAPE修正的正似然比。原始SHAPE反应性被标准化为一个标准尺度，从0(无反应性)到1左右(高反应性)。gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba用来显示突变谱。gydF4y2Ba

第II类结构分析gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba达芬奇的异构体gydF4y2Ba

达芬奇的整个管道在扩展数据图中进行了说明。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．对于II类的每个测序读取，由上一步生成的位向量被转换为约束信息(“1”表示单链核苷酸)gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba亚型。单股约束被纳入DaVinci管道的SCFG发动机。SCFG引擎，包括一组用于SCFG的转换规则和每个非终端符号的转换规则的概率分布，由CONTRAfold提供gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba在CentroidFold中使用扩展函数实用程序gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba(——引擎CONTRAfold——采样)。收集由单个位向量衍生的约束生成的RNA结构。由于不同的结构在探测过程中可能具有相同的突变剖面，因此我们使用位向量约束的采样函数来捕获第ii类的多个结构gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba亚型。将收集到的所有RNA结构转化为点括号字符串，然后使用Forgi包中的rnaConvert转化为RNA结构元素gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba．提取数字化的RNA二级结构元素以创建数字矩阵，并进行降维，如PCA或多维缩放。对降维结果进行聚类gydF4y2BakgydF4y2Ba-表示使用gydF4y2BakgydF4y2Ba-means来自scikit-learn Python包的函数gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．的价值gydF4y2BakgydF4y2Ba设置为视觉确定。通过计算每个位置上最常见的RNA结构类型(即最大预期精度)来确定每个簇的代表性结构，并由位于簇中心且与最常见的RNA结构最相似的RNA结构确定。通过计算构象空间中所有碱基对的频率来计算碱基对概率。位置碱基对概率由gydF4y2Ba\ (P {} _ {} = \ mathop{总和\}\ limits_ {j} ^ {j} {P} _ {ij} \)gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ijgydF4y2Ba底的概率是多少gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和基底配对gydF4y2BajgydF4y2Ba，超过了它所有的潜力gydF4y2BaJgydF4y2Ba结对伙伴。单链可能性由1−表达式计算gydF4y2BaPgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba．此外，香农熵的计算为gydF4y2Ba\ ({E} _{我}= \ mathop{总和\}\ limits_ {j} ^ {j} - {P} _ {ij} {\ log} _{10} \离开({P} _ {ij} \) \)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

HIV-1 RRE、RRE61、cspA、TenA结构分析gydF4y2Ba

检测HIV-1 RRE的数据gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba均来源于RRE-invitroDMS_NL43rna。bam (gydF4y2Bahttps://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1gydF4y2Ba)．探测cspA 5’未翻译区域的数据gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba在37°C和10°C时，从序列读取档案(存取编号gydF4y2BaSRR6123773gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSRR6123774gydF4y2Ba)．我们在体外进行了包含茎环III、IV和V的折叠HIV-1 RRE61 RNA (3 pmol)的RNA结构探测实验gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba如前所述gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．对3 pmol的TenA rna进行NAI化学处理gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}在存在或不存在1 μ M硫胺焦磷酸(TPP)时。以20:80 (vol/vol)或50:50 (vol/vol)的比例混合nai修饰的RNA样本(tp处理的RNA和未tp处理的RNA)进行文库构建。如上所述，所有测序数据都映射到相应的参考文献。随后的位向量生成，并进行上述的达芬奇分析，包括为数字化RNA结构元素创建数字矩阵，降维，gydF4y2BakgydF4y2Ba-均值确定和代表性结构构造。RRE的硅结构集成分析采用RNAfold进行Boltzmann采样(10,000次)gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．硅内结构集成的后续分析与达芬奇分析相同，但仅包括为数字化RNA结构元素创建数字矩阵、降维、gydF4y2BakgydF4y2Ba-均值确定和代表性结构构造。gydF4y2Ba

总RNA提取和RT-qPCR进行基因表达分析gydF4y2Ba

如前所述，提取总RNAgydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．根据制造商的指南，在进行反转录之前，使用TURBO DNA-free (Ambion TURBO DNase kit, AM1907)消化基因组DNA。使用SuperScript III逆转录酶(ThermoFisher, 18080093)按照制造商的方案使用基因特异性引物进行逆转录。标准内参基因gydF4y2Ba哥伦比亚大学gydF4y2Ba（gydF4y2BaAt5g25760gydF4y2Ba)对基因表达进行归一化。所有引物均列在补充表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

染色质结合RNA测定法gydF4y2Ba

染色质结合rna提取如前所述gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．简单地说，2克温种或冷种的幼苗在液氮中用砂浆磨成细粉。然后用1%的材料(约200 mg细粉)进行总RNA提取，如上所述。用Honda缓冲液在50 ng μl的存在下制备剩余材料的核gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}tRNA, 20u mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}RNase抑制剂(SUPERase-In;Life Technologies)和1× cOmplete蛋白酶抑制剂(Roche)。核球在等体积的重悬缓冲液(50% (vol/vol)甘油、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、100 mM NaCl和25 mM Tris-HCl pH 7.5)中重悬，并用尿素洗涤缓冲液(300 mM NaCl、1 M尿素、0.5 mM EDTA、1 mM DTT和1% twein -20和25 mM Tris-HCl pH 7.5)洗涤两次。将两体积的洗涤缓冲液添加到重悬的核中，并涡旋1秒。用苯酚-氯仿去除染色质和蛋白质。上清中的rna用异丙醇沉淀，溶解并经dna处理。使用SuperScript III逆转录酶(ThermoFisher, 18080093)按照制造商的方案对染色质结合rna进行逆转录。基因特异性引物的混合物(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),gydF4y2BaEF1alphagydF4y2Ba（gydF4y2BaAt5g60390.2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}，以估计有多少RNA与基因组DNA结合(表达为(染色质结合RNA)/gydF4y2BaEF1alphagydF4y2Ba)，都参与了逆转录反应。总rna也按照制造商的方案使用SuperScript III逆转录酶(ThermoFisher, 18080093)进行逆转录。基因特异性引物的混合物(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),gydF4y2BaPP2AgydF4y2Ba（gydF4y2BaAt1g13320gydF4y2Ba)作为对照，加入到反转录反应中，估计II类的总表达水平(表达为(总RNA)/gydF4y2BaPP2AgydF4y2Ba)．用以下公式计算色谱结合比:gydF4y2Ba

ChIRP-qPCR化验gydF4y2Ba

ChIRP的执行与前面概述的一样，只是做了一些修改gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}．反义DNA探针设计针对远端外显子序列gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaII类，生物素化在3 '端;探针在补充表中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．然后，在室温真空条件下，用3% (vol/vol)甲醛交联3 g温生幼苗。交联后用0.125 M甘氨酸淬灭5 min。交联植物研磨成细粉，在50 ml细胞裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM蔗糖，25%甘油，20 mM KCl, 2.5 mM MgCl)中裂解gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 0.1% NP-40和5 mM DTT)。裂解液通过两层miraccloth (Merck, D00172956)过滤，并通过离心成粒。用10毫升核洗涤缓冲液(20mm Tris-HCl pH 7.5, 2.5 mM MgCl)洗涤球团两次gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 25%甘油，0.3% Triton X-100和5 mM DTT)。然后将核颗粒重新悬浮在核裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 1% SDS, 0.1 mM PMSF和1 mM DTT)中，并使用Bioruptor超声仪(Diagenode)进行超声处理。所有缓冲液均添加0.1 U μlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}RNaseOUT (Life Technologies)， 1 mM PMSF和Roche cOmplete片剂，以保持任何rna -蛋白质和蛋白质-蛋白质复合物的完整性。按照前面的描述执行以下步骤gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba．每个反应均使用30 μl预先阻断的Streptavidin C1磁珠(Thermo Fisher Scientific, 65001)。然后，在RNase+反应中加入20 μl的RNase A/T1 Mix (Thermo Fisher Scientific, EN0551)，而不是RNaseOUT。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)，在杂交(37°C 4 h)开始前;这些样本被用作背景噪声的对照。RNA用基因特异性引物用SuperScript IV逆转录酶(ThermoFisher, 18090050)洗脱和逆转录。gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2BaRT-qPCR检测富集和DNA洗脱。所有用于逆转录和RT-qPCR的引物均列在补充表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

电泳迁移率移位测定gydF4y2Ba

电泳迁移率移位测定(EMSAs)如前所述进行gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba使用末端标记有Cy5 (DNA)或FAM (RNA)的寡核苷酸。寡核苷酸序列见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．EMSAs使用自制的15%聚丙烯酰胺凝胶、40 mM三乙酸酯(pH 7.4)和10 mM MgCl进行gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba15伏厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．凝胶图像使用Typhoon FLA 9500荧光阅读器(GE医疗生命科学)拍摄。阳性对照rDNA增强子En3-PAPAS的序列是从以前的研究中获得的gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba