生长素识别和外排的结构见解gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaPIN1gydF4y2Ba

生长素在调节植物生长发育的几乎每个方面都起着关键作用gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba}．生长素的一个显著特征是它的细胞间定向运输-生长素极性运输-使植物协调发育和适应外源信号gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．生长素出口商gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}由于它们的极性亚细胞定位决定了生长素的极性运输的方向性，并在生长素的不对称分布和植物发育中起着关键作用，它们对这一过程至关重要并受到了相当大的关注gydF4y2Ba^{7 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaPIN1到PIN8共有两个保守结构域，n端和c端结构域，并由一个不太保守的亲水环路连接gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．根据亲水环的长度，pin可分为长pin (PIN1-PIN4和PIN7)、短pin (PIN5和PIN8)和中间pingydF4y2Ba^8gydF4y2Ba(PIN6)。短的pin通常位于内质网，而长pin位于质膜上，受胞吞作用和循环利用的动态调节gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．NPA是生长素输出和生长素极性转运的抑制剂，在建立生长素外排在生长素极性转运中的关键作用方面发挥了重要作用。NPA直接针对pingydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}，但其作用机制尚不清楚。gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2BaPIN1和PIN2(也称为EIR1)是第一个被识别的pingydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaPIN1广泛表达，在胚胎、根尖分生组织、维管组织以及器官发育中起着重要作用gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}．gydF4y2Bapin1gydF4y2Ba缺乏导致裸露的，针状的花序gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．在本研究中，我们开始确定PIN1的结构，揭示底物识别的基础和NPA的抑制机制。gydF4y2Ba

PIN的生长素外排活性已被证明使用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba原生质体，烟草培养细胞，酵母，人类海拉细胞和gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍gydF4y2Ba卵母细胞gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．值得注意的是，在卵母细胞中，只有当PIN与D6蛋白激酶等激酶共表达时，才检测到生长素外排活性gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba(D6PK)。我们表示gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaHEK293F细胞中的PIN1(扩展数据图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)及其运输活动的特征。在负载试验中，共表达PIN1和D6PK的细胞积累的放射性同位素标记[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA与单独转染D6PK的细胞相比(图5)。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)．在外排试验中，在将生长素转移到无同位素缓冲液后，随着时间的推移测量放射性标记的生长素，残留[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA在对照条件下基本保持不变，但在共表达PIN1和D6PK的细胞中IAA显著降低(图6)。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)．值得注意的是，仅表达PIN1会导致[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]与对照细胞相比，负载和流出实验中的IAA，但低于共表达D6PK的细胞(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．这些结果表明，PIN1在HEK293F细胞中表达时可介导生长素的主动外排，并进一步被D6PK激活。pin1介导的生长素外排被NPA抑制(图。gydF4y2Ba1 b, dgydF4y2Ba)，与卵母细胞的结果相似gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

PIN极性和转运活性受多种蛋白激酶调控gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．在长pin的亲水环中已经发现了几个磷酸化位点，包括PIN1中的三个苏氨酸残基(T227、T248和T286)和四个丝氨酸残基(S231、S252、S271和S290)gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}．我们生成了三种苏氨酸(分别为T3A和T3E)或四种丝氨酸(分别为S4A和S4D)的不可磷酸化和拟磷突变体，并检查了它们的转运活性(扩展数据图)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．与D6PK共表达时，非磷酸化T3A和S4A突变体的转运活性与野生型相比略有下降(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．值得注意的是，在单独表达的拟磷突变体中，外排活性没有进一步增强(扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，提示HEK293F细胞中D6PK对PIN1的激活可能是由于其他位点的磷酸化gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．质谱分析HEK293F细胞中与D6PK共表达的纯化野生型PIN1，鉴定出14个磷酸位点，包括已知的S252和S290位点(扩展数据表)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．仅对PIN1表达的分析也鉴定出10个磷酸基，这可能有助于其微弱的外排活性(扩展数据表)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

纯化后的PIN1蛋白表现出良好的溶解行为(扩展数据图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．为了便于冷冻电子显微镜(cro - em)分析，我们使用体外纳米体合成平台生成了合成纳米体(sybodies)gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．在微尺度荧光实验中使用能增加PIN1热稳定性的联体gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba，我们制备了复杂样品，并进行了结构测定(扩展数据图。gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)．使用一个选定的sybody (Sybody-21)(扩展数据图。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)，我们确定了PIN1的二聚体结构(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 d jgydF4y2Ba)．地图密度是高质量的，能够从头建立模型(扩展数据图。gydF4y2Ba3比gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．大多数亲水环缺失——可能是由于其固有的灵活性——并且没有报道的磷酸基可见，排除了磷酸化对PIN1调控的进一步结构分析。体结合在亲水环的近膜区(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．我们还在3D分类过程中发现了一个单体PIN1(扩展数据图。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba)，然而，这类课程并没有产生高分辨率的地图。因此，我们主要对二聚PIN1结构进行了分析。gydF4y2Ba

PIN1的跨膜结构域有十个跨膜片段(TM1到TM10)，如先前报道的，N端和C端均位于细胞外gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba)．PIN1采用NhaA折叠;这种褶皱首先在细菌钠中观察到gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba逆向转运gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba和哺乳动物钠共有gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba换热器gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba和根尖钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)同源物，如ASBTgydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}和ASBTgydF4y2Ba_YFgydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}．TM1到TM5和TM6到TM10形成两个倒置重复序列，可以很好地叠加(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．TM1、TM2、TM6和TM7形成支架结构域，TM3到TM5和TM8到TM10形成转运体结构域(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．TM1, TM2和TM7组成二聚体界面，主要由疏水残基组成(扩展数据图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)．TM6是不连续的，其前半部分倾斜，几乎与膜表面平行。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

两个不连续的倒置螺旋——tm4和tm9在跨膜结构域的中心交叉;这种特征螺旋在asbt和Na的底物配位和输运中是必不可少的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转运蛋白gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．两个脯氨酸，TM4的P111和TM9的P579，分别位于交叉处，然后分别是一个天冬酰胺(N112)和谷氨酰胺(Q580)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．值得注意的是，P579L突变gydF4y2Bapin1-4gydF4y2Ba等位基因被报道破坏PIN1的功能，证实了这些脯氨酸的重要作用gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．在ASBT的内向结构中gydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}，二纳gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba鉴定了两个结合位点，一个(Na1)位于交叉中心附近，另一个(Na2)位于细胞质附近gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转运体在相似的位置上有带正电的残基，模仿钠离子的作用gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．在PIN1中，Na1和Na2位置没有密度，周围的残渣组成不同。一个带正电的残基R547存在于Na1位置，并与S108、A576和L578的骨架相互作用，从而稳定了TM4和TM9的交叉结构(图5)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．Na2位点的中性电荷残基Q580与S106和L110的骨架相互作用(图5)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．PIN1也不太可能在Na2位置结合钠，因为大多数极性或带负电荷的残基都存在于ASBT的相同位置gydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}被疏水或中性带电残基所取代。gydF4y2Ba

TM5之后的一小段(残基165-211)形成了由三个β-链组成的细胞质结构域(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．该结构域与邻近的跨膜片段紧密结合，包括TM5、TM6a和TM9b。β链主要通过疏水相互作用与TM5和TM6a结合，β1 -β2连接子通过盐桥与TM5和TM9b相互作用。TM5中的R471与β1 -β2环中的V177、D178和I181的主干相互作用。TM5中的K472与S183侧链相互作用，TM9b中的E590与R187相互作用(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

每个PIN1单体都有一个溶剂可达的腔体，该腔体向细胞内一侧具有弱正电位开口(图2)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)，暗示一种向内的状态。因此，PIN1更好地对准ASBT的内向结构gydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}和ASBTgydF4y2Ba_YFgydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)，而支架区域显示出较大的变化(扩展数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在整个纯化过程和冷冻样品制备之前，由于IAA的存在，我们获得了总体分辨率为3.2的电子显微镜图Å(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 h, jgydF4y2Ba)．在细胞腔底部附近出现了一个额外的电镜密度，可以与IAA对接(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba)．在IAA和TM4的交叉区域之间也观察到一个小的密度，我们将其建模为水分子(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．整体的iaa结合结构与载脂蛋白状态基本相同(扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．IAA结合位点周围的残基在两种结构中几乎相同(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．在结构中，IAA通过氢键和疏水相互作用进行协调(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．IAA的羧基在TM6b中与N478相互作用。水分子是IAA咪唑环酰胺基与N112相互作用的桥梁。咪唑环被包裹在V51和I582之间，两者都位于环平面的4 Å范围内(图5)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．所有相互作用的残基(V51, N112, N478和I582)在pin中高度保守(扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．N112, N478和I582是不变的，而V51在PIN5和PIN8分别被亮氨酸和异亮氨酸取代。gydF4y2Ba

我们还确定了PIN1的npa结合结构(扩展数据图。gydF4y2Ba3 i, jgydF4y2Ba)．在细胞内袋的底部，我们发现了一个与NPA完全吻合的密度，它与IAA结合位点的位置相似(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 b、dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)．NPA结合结构与载脂蛋白结构基本相同，尽管NPA周围的残基略有改变，提供了更好的配位(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．NPA紧密协调(图;gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba):萘基排在V51和I582之间，羧基与N112和Y145的侧链以及I582和V583的主链原子形成氢键，苯环排在Y145、L114和V583之间。因此NPA保留了IAA与PIN1的结合模式，因为V51、N112和I582都参与了两个配体的结合。事实上，NPA和IAA具有化学相似性，都包含一个疏水环和一个带负电荷的基团(扩展数据图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．而NPA与PIN1之间的相互作用由于NPA中多了一个苯甲酸基团而包含了更多的氢键。值得注意的是，这一组突出到由TM5和交叉区域形成的口袋中(扩展数据图。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)．对于NhaA褶皱转运体，交叉区域被认为经历了局部重排，导致了完成运输周期的构象变化gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．NPA的苯甲酸基团可能降低了交叉区迁移能力，从而使PIN1停留在向内构象。gydF4y2Ba

我们首先在生理细胞质pH (pH 7.0)下测试了IAA与PIN1的结合亲和力。我们确定了解离常数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba等温滴定量热法(ITC) (83 μM)和表面等离子体共振法(SPR) (186 μM)(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．pH值为5.5时gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2BaITC和SPR分别为168 μM和268 μM(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)，均在相似的范围内，且仅在pH 5.5时较pH 7.0时增加了约两倍，说明PIN1与IAA的结合受pH影响不大。PIN1还能结合其他天然生长素，包括吲哚-3-丁酸、吲哚-3-丙酸和4-氯吲哚-3-乙酸(扩展数据图)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了确认PIN1结构中底物结合位点的位置，我们生成了几个变体，并使用ITC检查了IAA结合(扩展数据图)。gydF4y2Ba7汉英gydF4y2Ba)．N112和I582突变到丙氨酸阻止了IAA的结合(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba)．的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2BaV51A突变体为1.39 mM，约为野生型的17倍，表明结合亲和力明显降低(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．N478A突变对凝胶过滤中的表达水平和溶液行为有不利影响，阻碍了进一步的分析，表明N478在结构稳定方面有功能。gydF4y2Ba

我们还研究了NPA与野生型PIN1的结合。与IAA相比，NPA具有较高的亲和力gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba约0.15 μM(图;gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，与先前的迹象一致，NPA是一种有效的抑制剂，并表现出对植物膜整体成分的高亲和力结合gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．NPA与N112A突变体之间的结合在很大程度上受损，这与N112参与IAA和NPA识别的结构观察相一致(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba)．NPA与Y145A突变体之间未观察到结合(扩展数据图)。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba)．值得注意的是，IAA与Y145A之间的结合也受到了损害(扩展数据图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．Y145在运输过程中是否参与了IAA在其他状态下的直接结合，还是在维持关键结合位点上发挥了结构作用，还有待进一步研究。gydF4y2Ba

这些结合实验支持了结构研究预测的生长素结合位点，并证实了NPA在同一位点具有较高的亲和力。gydF4y2Ba

我们的结构分析确定了可能对PIN1的稳定性和转运活性至关重要的残基，包括与Na位置相似的R547和Q580gydF4y2Ba^+gydF4y2BaASBT中的结合位点gydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}其中，R187、R471和K472带电残基介导胞质β-片结构域与跨膜段之间的相互作用，以及iaa配位残基V51、N112、N478和I582。我们生成了这些残基的丙氨酸突变体，并测量了它们的生长素外排活性。R547A和Q580A突变体明显增加[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA保留和净流出减少，表明运输活动严重受损(图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这表明这些残基对PIN1的转运活动至关重要，可能是通过模仿Na的作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在ASBTgydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}稳定交叉螺旋。gydF4y2Ba

接下来，我们分析了介导胞质β-片和跨膜段之间相互作用的残基。突变R471到丙氨酸导致几乎检测不到表达(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．R187A突变体表现出轻微的外排活性下降，而K472A表现出相当大的损伤(图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明该区域的结构完整性对运移活动至关重要。值得注意的是，该段的序列仅在长pin之间是保守的(扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．其具体功能有待进一步研究。gydF4y2Ba

我们还利用V51A、N112A和I582A突变体表征了iaa配位残基的转运活性，但没有使用N478A突变体，后者表现出蛋白表达受损。V51A、N112A和I582A突变导致外排活性降低，尤其是I582A(图2)。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)．与ITC的结果一致，Y145A突变体的IAA转运活性受到很大程度的损害(图1)。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)，表明其参与了NPA抑制和IAA外排。与ITC的结果一起，观察到的结合袋代表了PIN1中一个重要的iaa协调位点。具体来说，PIN1的N112在asbt中是保守的，而在NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转运蛋白，它被一个带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸残渣所取代(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．这加强了交叉螺旋在衬底识别中的关键作用，并为我们的PIN1结构提供了强大的功能支持。gydF4y2Ba

在这里，我们描述了PIN1的结构和底物结合剖面，PIN1是中国主要的PIN生长素输出体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．在现有的向外和向内结构以及相应的功能分析的基础上，提出了一种具有特征的NhaA折叠运输机的升降式交替存取机构gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}．从这个角度来看，转运蛋白结构域在膜的一侧拾起底物，沿着支架结构域滑动发生构象变化，并将底物释放到膜的另一侧(扩展数据图)。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)．虽然类似的模型对于基于pin1的IAA传输是合理的，但确认该机制需要在传输周期中捕获更多的状态，特别是面向外部的结构。NPA和IAA直接竞争PIN1的胞内结合袋。由于NPA与PIN1之间具有较高的亲和力，一旦NPA被结合，即使在更高的浓度下，IAA也被禁止进入结合口袋(扩展数据图)。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

pin1介导的生长素转运的能量来源仍然未知。由于IAA作为弱酸的化学性质，在不同的pH值下，其质子化或去质子化形式的比例有所不同。在生长素转运的化学渗透假说中，外质体中质子化的疏水IAAH容易通过脂质双分子层扩散。一旦进入中性或碱性的细胞内pH环境，它主要存在于脱质子的IAA中gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba形式和由pin等运输工具促进的输出是必不可少的gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}．我们的体内实验结果支持这一模型，表明没有PIN1表达，几乎不会发生IAA外排(图2)。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)．质膜上相同的pH梯度被认为为生长素的输出提供了能量。然而，我们没有发现pH 5.5和6.5之间IAA的相对保留率有任何显著差异(扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．同样，我们没有检测到pH值对IAA与PIN1结合有太大影响(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)．这两个发现都表明PIN的转运可能不利用pH梯度。尽管如此，这需要进一步的验证，最好使用体外运输系统。gydF4y2Ba

总之，我们的研究为生长素外排和生长素极性转运机制提供了结构性的见解。他们为未来基于结构的pin功能分析和用于农业用途的生长素类似物设计建立了一个框架。gydF4y2Ba

蛋白表达及纯化gydF4y2Ba

全长的DNA序列gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaPIN1可在Uniprot (gydF4y2Bahttps://www.uniprot.orggydF4y2Ba)，其登录码为Q9C6B8，并被克隆到pCAG载体(Invitrogen)中，带有n端Flag标签用于低温电镜样品制备或额外的c端AVI标签用于体选择。所有PIN1变体都是用N-terminal Flag标记以相同的方式生成的。HEK293F细胞(信和生物)转染PIN1质粒，转染密度为3 × 10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba所使用的HEK293F细胞系尚未经过验证，支原体污染检测为阴性。对于1-l细胞培养，1.5 mg质粒与4 mg线性聚乙烯亚胺(PEI) (polyciences)在50 ml培养基中预混合30分钟。然后将混合物添加到细胞培养中，孵育15分钟。转染细胞在37°C下培养60 h，然后以3000转/分的速度离心收集10 min。将微球重悬在含有25 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1.5% (w/v) DDM (Anatrace)和含有1mm苯甲基磺酰氟、抑肽酶(1.3 mg ml)的蛋白酶抑制剂鸡尾酒的裂解缓冲液中gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})、蛋白酶抑素3 (0.7 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和leupeptin (5 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．4℃孵育2 h后，用14000转/分离心分离上清液1 h，用抗flag M2亲和凝胶(Sigma)在4℃孵育45 min。树脂用10 ml缓冲液冲洗3次，每次含有25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.06% (w/v)甘薯蓣皂苷元(Anatrace)。用洗涤缓冲液加200 μg ml洗脱蛋白gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}标志肽。洗脱液用100 kda截断的Centricon (Millipore)浓缩，并使用Superose 6 Increase柱(GE Healthcare)在含有25 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl和0.02% (w/v) GDN的缓冲液中通过尺寸排除层析进一步纯化。为了测定IAA结合结构，从洗涤剂提取蛋白开始，整个过程中加入10mm IAA钠盐(Sigma)。凝胶过滤缓冲液含有10 mM IAA钠盐，25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl和0.02% (w/v) GDN。gydF4y2Ba

细胞生长素运输试验gydF4y2Ba

答:芥gydF4y2Ba将PIN1的野生型或突变体D6PK (Uniprot登录码:Q9FG74)分别亚克隆到pCAG载体中。HEK293F细胞密度为1.5 × 10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba每毫升细胞均转染空载体或PIN1构建物，或以3:1的质量比共转染PIN1和D6PK。转染24小时后，离心收集细胞，重悬进行负载试验或流出试验。对于PIN1突变体的所有特征，除非另有说明，细胞均与D6PK共转染。细胞计数用Coulter计数和显微镜观察确定。对于所有检测系统，500 μl不等的细胞悬液含有3 × 10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba细胞。对于[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA积累试验，细胞重悬并在37°C下与PBS柠檬酸缓冲液孵育，pH 5.5 (10 mM NagydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}HPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 1.8 mM KHgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH由无水柠檬酸调整)，含16 nM [gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA(比活性25 Ci mmolgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}美国放射性标记化学品)。在指定的时间点通过离心停止加载过程。然后用pH为7.4的冰冷PBS缓冲液清洗细胞两次，并用相同的缓冲液加1% Triton X-100重悬以进行细胞裂解。用液体闪烁计数法(Tri-Carb 2910TR, PerkinElmer)测定细胞裂解过程中的放射性。为了进行生长素外排实验，细胞首先被加载在pH为5.5的PBS柠檬酸缓冲液中，外加40 nM [gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA浸泡5分钟，然后用[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]不含iaa的PBS柠檬酸缓冲液。重新悬浮后(定义为零时间点)或在其他指定时间点立即服用500 μl。将细胞离心，用1ml冰冷的PBS缓冲液(pH值7.4)洗涤两次，用相同的缓冲液加1% Triton X-100重悬进行闪烁计数。对于PIN1突变体，[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA保留率表现为相对于0分钟测量的10分钟剩余放射性，净流出量表示为放射性标记的量[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA测量在0分钟减去保留[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]IAA在10分钟测量。对于NPA抑制实验，细胞用[gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH] 10 μM NPA存在时的IAA (Sigma)。gydF4y2Ba

PIN1的生物素化用于体选择gydF4y2Ba

纯化PIN1 (1.3 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}用BirA生物素化(66 μg ml)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，在缓冲液中加入150 mM NaCl, 0.02% (w/v) GDN, 10 mM乙酸镁，5 mM ATP, 28 μM生物素和25 mM HEPES pH 7.4，温度为4℃。反应16 h后，加入1 mM ATP和13 μg ml继续进行生物素化gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}再注射5小时。将反应混合物与Ni-NTA树脂孵育以去除his标记的BirA。通过凝胶过滤在Superose 6 Increase 10/300 GL色谱柱上进行分离(GE Healthcare)。含有PIN1的馏分浓缩并以小比例在液氮中快速冷冻，并在−80°C保存后使用。gydF4y2Ba

杂交体的体外转译和选择gydF4y2Ba

在体外翻译sybodies时，9.3 μl的混合物(PUREfrex 2.1 kit, Genefrontier)含有1.8 μl无核酸酶水，4 μl溶液I, 0.5 μl溶液II, 1 μl溶液III, 0.5 μl 10 mM半胱氨酸，0.5 μl 80 mM还原性谷胱甘肽，0.5 μl 60 mM氧化性谷胱甘肽，0.5 μl 1.875 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}二硫异构酶DsbC (Genefrontier)首先在PCR循环器中37°C孵育5分钟。加入0.7 μl的sybody mRNA文库启动反应。37°C孵育30 min后，加入100 μl陈冰洗净液(0.02% GDN, 150 mM NaCl, 50 mM醋酸镁，0.5% BSA, 0.5%肝素，1 μl RnaseIn, 50 mM Tris-acetate pH 7.4)， 20000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下加热5分钟。将上清液与50 nM生物素化的PIN1混合，在冰上孵育20分钟，进行溶液筛选。将混合物加入12 μl链霉亲和素珠(Dynabeads Myone Streptavidin T1)中，与WTB缓冲液(50 mM Tris-acetate pH 7.4, 150 mM NaCl, 50 mM acetate镁)预平衡，并添加0.5% BSA孵育10 min。用WTB- d缓冲液(WTB缓冲液中GDN为0.008%)洗涤三次，再用RD洗脱液(100 μg ml)洗脱gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酵母RNA, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-acetate pH 7.4)。用Rneasy Kit (Qiagen)纯化洗脱后的mRNA，用引物(5’-CTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCTTG-3’)和2 μl RNA转录酶(Agilent)在40 μl的反应中进行逆转录。cDNA纯化(machery - nagal)并使用引物对进行pcr扩增(5 ' -ATATGCTCTTCTAGTCAGGTTCAGCTGGTTGAGAGCG-3 '和5 ' - tatagctcttcatgcgctcacagtcacttgggttac -3 '用于凹库和环库，5 ' -ATATGCTCTTCTAGTCAAGTCCAGCTGGTGGAATCG-3 '和5 ' -TATAGCTCTTCATGCAGAAACGGTAACTTGGGTGCCC-3 '用于凸库。扩增后的DNA产物用IIs型酶切酶BspQI纯化消化，并连接到用同样酶处理过的载体pDX_init上。将结扎产品改造成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba电穿孔SS320感受态细胞生成噬菌体展示库。gydF4y2Ba

在越来越严格的条件下，用交替珠进行了三轮噬菌体展示。第一轮在96孔镀67 nM neutravidin(赛默飞世尔科学公司)中进行。纯化后的噬菌体与50 nM生物素化PIN1在室温(20 - 22°C)下孵育20分钟，然后加入96孔板。用TBS-D缓冲液(0.01% GDN, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.4)洗涤三次后，用0.25 mg ml洗脱噬菌体颗粒gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}胰蛋白酶。洗脱后的噬菌体颗粒被扩增并应用于第二轮噬菌体展示。将12 μl MyOne Streptavidin C1珠与50 nM生物素化的PIN1和噬菌体颗粒在100 μl摇盘液中孵育10 min。用5 μM的非生物素化PIN1在室温下孵育3分钟，以挑战较弱的粘结剂。噬菌体展示过程以与第二轮相同的方式重复，除了生物素化和非生物素化PIN1的浓度降低了10倍。利用片段交换(FX)克隆技术将噬菌体中的符号编码片段交换到pSb_init载体中，进行进一步的酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba

将上述得到的pSb_init质粒转化为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaMC1061活性细胞。单菌落接种，在96孔板中37°C培养4 h。然后将预培养物播种到1 ml Terrific肉汤中(1.2%色氨酸，2.4%酵母提取物，1% NaCl, 4 ml甘油，0.231% KH)gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， k为1.254%gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}HPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)，添加25 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氯霉素，37℃培养。2 h后，温度降至22℃。再用0.02% (w/v) L-(+)-阿拉伯糖诱导半体表达17 h。收集细胞微球，用TES缓冲液(0.5 μg ml)裂解gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}溶菌酶，0.5 mM EDTA, 20% (w/v)蔗糖，50 mM Tris-HCl pH 8.0)。在TBS缓冲液(150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.4)中进一步培养，并添加1mm MgClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}在4°C下，以3220 g离心30 min。用含联体的上清部分进行ELISA检测。gydF4y2Ba

将max - sorp培养皿(Thermo Fisher Scientific)与蛋白A在PBS中4°C孵育16小时。去除多余的蛋白A，用TBS缓冲液清洗一次，用添加0.5% BSA的TBS堵塞，用TBS清洗三次。在TBS-BSA- d缓冲液(TBS中添加0.5% (w/v) BSA和0.02% GDN)中以1:2 000稀释的抗myc抗体(Sigma)加入96孔板与蛋白a结合，多余的抗体用TBS- d缓冲液(TBS中添加0.01% GDN)洗涤三次。将上述10微升的周浆提取物加入96孔板，室温孵育20分钟。然后用TBS-D缓冲液清洗三次。在培养皿中加入50纳摩尔生物素化的PIN1或对照蛋白。室温孵育20 min后，用TBS-D缓冲液洗涤三次。将链霉亲和素与辣根过氧化物酶(HRP)结合添加到每个孔中，在室温下孵育20分钟。用TBS-D缓冲液洗涤三次，然后用ELISA显影缓冲液(51 mM Na)显影gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}HPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 24 mM柠檬酸，0.006% (v/v) HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}OgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 0.1 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}3, 3, 5, 5 ' -tetramethylbenzidine)。ELISA信号在平板阅读器650 nm处用吸光度法检测。gydF4y2Ba

生物层干涉测定法gydF4y2Ba

PIN1与sybody的结合亲和力在30°C下使用HIS1K生物传感器用Octet RED96系统(ForteBio)进行BLI测量。传感器首先在动能缓冲液(25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01% GDN)中平衡10分钟。对于BLI测量，记录基线相位120 s。将传感器浸泡在2 μg ml中监测加载相gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在动力缓冲液中标记了他的躯体。通过将传感器浸泡在不同浓度的PIN1分析物中360秒来监测结合，并通过将传感器浸泡在无PIN1的缓冲液中600秒来记录解离相。数据拟合为1:1的化学计量平衡解离常数gydF4y2BaKgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba，关联速率常数gydF4y2BaKgydF4y2Ba_在gydF4y2Ba，解离速率常数gydF4y2BaKgydF4y2Ba_从gydF4y2Ba使用Octet数据分析软件9.0版本进行计算。gydF4y2Ba

微尺度荧光热稳定性试验gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba-(4-(7-二乙基氨基-4-甲基-3-香豆素基)苯基)马来酰亚胺(CPM, Sigma)法测定PIN1与不同联体的热稳定性。将CPM染料以4mg ml溶解在二甲基亚砜(DMSO)中gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}使用前将其稀释40倍至含有25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.025% DDM的缓冲液中。将两微克纯化的PIN1蛋白与子体(1:4摩尔比)混合，在冰上孵育30分钟。将稀释后的CPM (1.5 μl)加入蛋白中，置于冰中，在黑暗中充分混合。反应混合物(共20 μ l)受控加热，升温速率为3°C mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在LightCycler480 (Roche)实时PCR仪中。激发波长设置为440 nm，发射波长设置为488 nm，连续测量荧光强度。在从室温到90°C的温度范围内进行测定。gydF4y2Ba

低温电镜样品制备和数据采集gydF4y2Ba

为了制备PIN1和sybody (sybody-21用于最终结构测定)配合物，将纯化后的PIN1和sybody-21以~1:3的摩尔比混合后注入凝胶过滤。未对纯化的体进行稀释。对于apo或iaa结合的PIN1冷冻- em样品制备，将等分(4 μ l)纯化的蛋白质添加到辉光放电的孔碳网格(Quantifoil Au R1.2/1.3, 300目)中，用Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific)在8°C下100%湿度下用4 s时间进行印迹，并浸入液氮冷却的液态乙烷中。为了制备NPA结合PIN1的低温电镜样品，首先将纯化后的PIN1与终浓度为100 μM的NPA (Sigma)在室温下孵育30 min，然后应用于网格。栅格被加载到300kv的Titan Krios (FEI)电子显微镜中，配备了生物量子能量过滤器和K2或K3直接电子探测器(Gatan)。图像记录采用EPU或SerialEM超分辨率模式。离焦值范围为−1.5 ~−2.3 μm。图像堆栈的曝光时间为3秒，剂量分为32帧，总剂量为50 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

图像处理gydF4y2Ba

在扩展数据图中给出了数据处理的流程图。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba．使用RELION 3.1实现的MotionCor2进行运动校正和剂量加权gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}．用CTFFIND4估计离焦值gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．在人工检查后，使用RELION选择良好的显微照片进行自动颗粒挑选。提取采摘颗粒并应用于二维分类。然后从好的级别的粒子导入到cryoSPARC (v.3.2.0)gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba用于进一步的数据处理。在载脂蛋白结构分析中，通过从头算三维重建将粒子分为五类。两类分别代表二聚体和单体PIN1，被选择进行非均匀细化。经过非均匀细化，在3.7 Å获得了含有919,145个粒子的二聚体形式的EM图。使用三个手动生成的低通过滤参考的异构细化和随后的非均匀细化，得到了一个总体分辨率为3.3 Å的映射，包含302,862个粒子。进一步的对比度传递函数细化，从头分类和非均匀细化使用cryoSPARC进一步提高了分辨率。最后，从210,597个粒子中获得了PIN1载apo二聚态的总体分辨率为3.1 Å的地图，这是用金标准傅里叶壳相关在0.143准则下的高分辨率噪声替代方法估计的gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}．使用ResMap估计局部分辨率变化gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．对于单体状态，从257,731个粒子中获得了总体分辨率为5.9 Å的最终EM地图。对于iaa结合的二聚态的数据处理，进行了类似的程序，并使用250,009个粒子获得了总体分辨率为3.2 Å的EM图。从头开始三维重建时未观察到PIN1单体状态对应的类。对于npa结合的二聚态的数据处理，进行了类似的程序，并使用215,094个粒子获得了总体分辨率为3.2 Å的EM图。gydF4y2Ba

模型构建和细化gydF4y2Ba

载脂蛋白、二聚体PIN1的3.1 Å图用于COOT从头建立模型gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．以Phe、Tyr、Trp和Arg等大残基为指导序列分配，并考虑氨基酸的化学性质，便于建模。通过PHENIX在真实空间中进行结构细化gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba．模型的过拟合是通过在两个独立地图中的一个中根据金标准的细化方法进行细化，并将细化后的模型与另一个地图进行测试来监测的。改进后的模型分别停靠到IAA或npa结合的二聚物PIN1的地图中，并由PHENIX进一步改进。三维重建和模型细化的统计数据可以在扩展数据表中找到gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

等温滴定量热法gydF4y2Ba

用MicroCal iTC200微热量计(MicroCal)测定IAA和PIN1变体之间的结合亲和力。在含有0.02% GDN、25 mM HEPES pH 7.0(或MES pH 5.5)和150 mM NaCl的缓冲液中纯化的野生型或突变型PIN1浓缩至0.05 mM左右进行等温滴定量热法滴定。蛋白用溶解在与25°C粒径排除层析所用缓冲液相同的5 mM IAA滴定。为了测定NPA与PIN1的结合亲和力，在含有1% DMSO、0.02% GDN、25 mM HEPES pH 7.0和150 mM NaCl的缓冲液中，用100 μM NPA滴定至0.01 mM的纯化蛋白。数据采用Origin 7.0 (MicroCal)软件拟合。gydF4y2Ba

表面等离子体共振gydF4y2Ba

在Biacore 8K体系(Cytiva)上进行IAA、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-丙酸(IPA)和4-氯吲哚-3-乙酸(4-Cl-IAA)的SPR实验，温度为25℃，流速为30 μl mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．通过胺偶联化学将纯化的野生型PIN1蛋白固定在系列S CM5传感器芯片(Cytiva)上。不同浓度的配体在pH 7.0缓冲液(25 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 0.01% GDN, 2% DMSO)或pH 5.5缓冲液(25 mM MES, pH 5.5, 150 mM NaCl, 0.01% GDN, 2% DMSO)中流过芯片表面。数据采用Biacore Insight Evaluation Software Version 3.0.12，采用稳态亲和绑定模型进行分析。gydF4y2Ba

蛋白质序列和坐标gydF4y2Ba

序列为8引脚和D6PK在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba均可在Uniprot (gydF4y2Bahttps://www.uniprot.orggydF4y2BaPIN1: Q9C6B8、PIN2: Q9LU77、PIN3: Q9S7Z8、PIN4: Q8RWZ6、PIN5: Q9FFD0、PIN6: Q9SQH6、PIN7: Q940Y5、PIN8: Q9LFP6、D6PK: Q9FG74。ASBT和NapA的坐标可在蛋白质数据库(PDB)中公开获取，并具有以下登录代码gydF4y2Ba_{纳米gydF4y2Ba}: 3zux, asbtgydF4y2Ba_YFgydF4y2Ba: 4N7W和NapA: 5BZ2。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba