组蛋白H2B。8compacts flowering plant sperm through chromatin phase separation

在大多数动物中，精子染色质经历了广泛的凝结，这对雄性的生育能力是必不可少的。在动物精子成熟过程中，几乎所有的组蛋白都被富含精氨酸的小蛋白所取代，这有助于DNA的紧密包装gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba}．例如，在哺乳动物精子中，组蛋白仅保留在基因组的5-15%，而组蛋白携带的大部分调控信息丢失了gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．从组蛋白中解绕DNA需要DNA链断裂，在这个过程中观察到大量的DNA链断裂gydF4y2Ba^{6克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．此外，蛋白蛋白阻碍转录gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．蛋白蛋白的极端染色质压缩保护了基因组的完整性，使其免受遗传毒性因素的影响，并实现了小而流体动力的精子头部，增强了游泳能力gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．采用这样一个过程说明了精子适应性的高进化压力gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

精子凝结也发生在另一大群多细胞真核生物:植物中。与动物类似，绿藻和非种子植物(如苔类、苔藓和蕨类植物)也会产生活动精子，这些精子会在水中游动，到达卵细胞gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．与精蛋白介导的精子凝结进化以促进游泳的理论一致gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}这些物种的精子核被精蛋白和类精蛋白高度浓缩，转录的RNA很少，如果有的话gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

大约在1.5亿年前，开花植物与其他陆地植物分道扬镳，不再依赖水来施肥gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．开花植物产生不动的、转录活跃的精子gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．精子被包裹在花粉粒中，花粉粒是由称为小孢子的单倍体减数分裂产物有丝分裂产生的gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．小孢子分裂一次产生一个营养细胞和一个生殖细胞，后者随后分裂产生两个精子细胞gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．在受精过程中，营养细胞发育成花粉管，将精子输送到卵细胞gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．与花粉管生长所需的高代谢活性相一致，营养细胞中的染色质高度去致密，转录活跃gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}．相比之下，精子具有高度浓缩的、以组蛋白为基础的染色质和小核gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．在缺乏蛋白蛋白的情况下，开花植物精子染色质凝聚的机制尚不清楚。gydF4y2Ba

为了了解开花植物精子凝结的机制，我们对来自植物的精子细胞、营养细胞和体细胞进行了超分辨率成像和比较蛋白质组学分析gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba芥gydF4y2Ba．通过这些实验，我们鉴定出一种特异性表达的组蛋白变体H2B。在精子核质中与染色质聚集体共定位的。带有gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变扩大，染色质去致密，而H2B异位表达。体细胞中的8导致相反的表型。结果表明H2B。8is necessary and sufficient for nuclear and chromatin condensation. H2B.8 aggregates chromatin through a phase-separation mechanism that depends on a conserved intrinsically disordered region (IDR). H2B.8 specifically concentrates unexpressed AT-rich euchromatin, which reduces the nuclear volume while maintaining transcription. H2B.8-induced nuclear compaction is important for fertility, ash2b.8gydF4y2Ba突变减少了男性传播。总的来说，我们的研究结果解释了开花植物精子凝聚，并揭示了转录兼容染色质凝聚的新机制。gydF4y2Ba

以前的研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaDAPI染色显示，与体细胞和营养细胞相比，精子染色质高度凝聚，核尺寸较小gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．为了更详细地描述精子染色质，我们检查了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba使用超分辨率3D结构照明显微镜(3D- sim)观察精子核。在精子细胞的核质中观察到明显的染色质聚集体(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.相比之下，营养细胞和叶细胞中的染色质更为均匀，尽管叶细胞在核周围有浓缩的异染色质灶(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了了解精子聚集体中染色质的组成，我们对组蛋白H3赖氨酸9二甲基化(H3K9me2)进行了免疫染色，这是一种与沉默的异染色质相关的修饰gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．位于精子核周围的较大聚集体与H3K9me2信号共定位(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.这一结果表明异染色质结构域在精子中持续存在，正如之前报道的那样gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．然而，这些异染色质灶在精子细胞中比在叶细胞中显得更大。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.为了进一步研究这方面，我们量化了精子、二倍体叶核和生殖细胞(分裂为精子细胞的单倍体母细胞)细胞核中富含h3k9me2的异染色质病灶的总量。正如预期的那样，与二倍体叶核相比，单倍体生殖核中的异染色质焦点体积减少了一半(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba）.相反，精子的异染色质病灶比生殖细胞核的大27.5%(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)，这表明异染色质凝聚水平降低，或者基因组融入异染色质的比例增加。后一种情况的可能性较小，因为精子细胞中检测到的H3K9me2(与总H3相比)少于叶细胞(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.除了异染色质病灶外，精子中其他染色质聚集体的H3K9me2也被耗尽(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.这一观察结果表明，一种新的机制被用于压缩精子染色质中较少异色的部分。gydF4y2Ba

为了研究精子染色质压实的机制，我们寻找了精子特异性染色质因子。为此，我们对叶片核以及荧光激活细胞分选(FACS)分离的精子和营养核进行了质谱分析。我们发现了组蛋白H2B, H2B.8的变体(编码gydF4y2BaAT1G08170gydF4y2Ba)，占精子H2B的12.6%，但在营养细胞和叶细胞的细胞核中不存在(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba）.与此结果一致的是，RNA测序(RNA-seq)实验检测到丰富的RNAgydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba精子细胞的转录水平，但没有来自体细胞组织，如叶，根和整个幼苗(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba）.为了进一步研究发育过程中的蛋白表达模式，我们通过表达H2B产生了报告系。8-eGFP融合蛋白gydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba启动子的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（gydF4y2BapH2B.8: H2B.8-eGFPgydF4y2Ba）.共聚焦成像显示H2B。8is incorporated into sperm following the second pollen mitotic division step, when nuclei are compacted and chromatin aggregates (Fig.1 dgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba）.H2B.8was rapidly lost after fertilization, but reappeared during seed maturation (Extended Data Fig.1 dgydF4y2Ba）.没有H2B。8–eGFP was observed in any other cell or tissue except sperm and seeds (Extended Data Fig.1 c, dgydF4y2Ba)，这与最近发表的H2B表达分析一致gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

因为H2B的存在。8c或related with nuclear and chromatin condensation, we proposed that H2B.8-induced chromatin condensation is responsible for sperm compaction. To test this hypothesis, we generated two independenth2b.8gydF4y2BaCRISPR敲除突变体(gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2Ba和gydF4y2Bah2b.8-2gydF4y2Ba)(扩展数据图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，并通过共聚焦和3D-SIM成像检测其精子表型。两者的精核gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变体比野生型大40%左右(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，这表明H2B。8contributes to sperm nuclear compaction. Notably, sperm nuclei ofh2b.8gydF4y2Ba突变体比它们的前身生殖核小，后者也是单倍体(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.结果表明H2B。8is not the sole mechanism involved in sperm nuclear compaction. In further support of our hypothesis, chromatin was more homogenous and had reduced aggregation inh2b.8gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2汉英gydF4y2Ba）.确认…的作用gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba我们表达了这些表型的突变gydF4y2BapH2B.8: H2B.8-MycgydF4y2Ba和gydF4y2BapH2B.8: H2B.8-eGFPgydF4y2Ba转基因gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2Ba;除非另有说明，所有gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变体(下文简称该等位基因)。两种转基因都成功地挽救了gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba精子核达到野生型水平(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，这提供了H2B的证据。8驱动核凝聚。染色质聚集体也恢复gydF4y2BapH2B.8: H2B.8-eGFPh2b.8gydF4y2Ba精子(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba）.此外，这些恢复的聚集体与H2B共定位。8-eGFP(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)，这表明H2B。8is directly involved in forming the aggregates.

测试H2B是否。8is sufficient to drive chromatin aggregation and nuclear compaction, we ectopically expressed H2B.8 using a strong constitutive promoter (p35区域gydF4y2Ba）.与H2B共定位的独特染色质聚集体。8-eGFP诱导gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba体细胞核(图2)gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba）.约30%的细胞核含有大量小H2B。8总量;其余70%的聚集物较少，聚集物较大(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba）.H2B的总体积。8一个ggregates was comparable between the two types of nuclei (Extended Data Fig.2 hgydF4y2Ba)，这表明H2B。8-containing chromatin aggregates were fusing over time.p35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba表达也使根细胞的核大小减少22%(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba）.这些结果表明H2B。8is sufficient for chromatin and nuclear condensation.

H2B.8is distinguished from other拟南芥gydF4y2BaH2B变体通过一个更长的氨基末端尾部，包含一个93个氨基酸的IDR(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba）.系统发育分析显示H2B。8is specific to flowering plants and is present in all flowering plant species with published genomes, except the most basalAmborella trichopodagydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.值得注意的是，所有检测结果均为H2B。8homologues shared the insertion of an IDR in the histone tail (Fig.3gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，这表明了它的功能重要性。gydF4y2Ba

idr可以通过相分离驱动生物分子凝聚物的形成gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．此外，含idr蛋白的相分离可以介导异染色质灶的形成和凝聚gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}．在此基础上的知识和独特的H2B。8foci pattern in sperm and somatic cells that ectopically express H2B.8 (Fig.2摄氏度gydF4y2Ba)，我们提出H2B。8一个ggregates chromatin through IDR-mediated phase separation.

为了验证这一假设，我们使用重组荧光团标记的组蛋白八聚体和包含601核小体定位序列12次重复的DNA模板组装核小体阵列。然后，我们测试了这些核小体阵列的相分离特性(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.阳离子(K)的加入gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和/或毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba})，以生理上相关的浓度与H2B重组的染色质。8或一个c一个nonical H2B (H2B.2) that naturally lacks an IDR induced the formation of phase-separated droplets (Fig.3 bgydF4y2Ba）.这一结果与先前的发现一致，即在生理盐条件下，染色质在体外进行相分离gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}．与报道的染色质凝聚物的液体性质一致gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba，含有H2B的染色质液滴。8或H2B。2showed fluorescence recovery after photobleaching (FRAP; Extended Data Fig.3 dgydF4y2Ba)和接触后的液滴融合(扩展数据图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

H2B的FRAP。8chromatin droplets was slower than that of H2B.2 droplets (Extended Data Fig.3 dgydF4y2Ba)，这反映了内部液滴动力学的减少和更像凝胶的行为。进一步检验H2B是否。8confers different phase-separation properties to chromatin, we examined H2B.8-containing and H2B.2-containing nucleosomal arrays under different salt and array concentrations. Under the same physiological salt concentration, H2B.8-containing nucleosome arrays formed phase-separated condensates at lower chromatin concentrations (Extended Data Fig.3 fgydF4y2Ba）.此外，不像典型的染色质相分离需要生理阳离子的帮助gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}, H2B。8-containing nucleosome arrays formed phase-separated droplets under low or no cation conditions (or in the presence of high concentration of the chelating agent EDTA; Fig.3 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba）.检验该相分离特性是否依赖于H2B的IDR。8、利用H2B重组核小体阵列。8无IDR (H2B.8ΔIDR)(扩展数据图gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.类似于H2B。2-containing chromatin, H2B.8ΔIDR-containing nucleosome arrays did not phase separate at lower array concentrations (<50 nM; Extended Data Fig.3 fgydF4y2Ba)，在没有盐的情况下无法进行相分离(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba）.与idr通过无序状态而不是特定序列基序促进相分离的观点一致gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}含有H2B的染色质。8in which the IDR sequence was randomly scrambled (H2B.8-scrambledIDR) phase separated in a salt-independent manner (Fig.3 bgydF4y2Ba）.综上所述，我们的结果表明H2B的IDR。8介导一种新的染色质相分离形式。gydF4y2Ba

测试H2B是否。8phase separation is required for chromatin condensation in vivo, we ectopically expressed H2B.8ΔIDR (p35区域:H2B.8ΔIDR-YFPgydF4y2Ba)或典型的H2B。2个细胞。与全长H2B的效果相反。8, H2B。8ΔIDR or H2B.2 expression did not induce chromatin aggregation and had no effect on nuclear size in root cells (Fig.2 c, dgydF4y2Ba）.这一结果证实了染色质和核凝聚依赖于h2b - 8的IDR。接下来我们表达H2B。8ΔIDRgydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变植物(gydF4y2BapH2B.8:: H2B。8ΔIDR–eGFP h2b.8)，并检查精子核凝聚是否也依赖于IDR。不像全长H2B。8, H2B。8ΔIDR failed to rescue the sperm nuclear size phenotype ofh2b.8gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2, cgydF4y2Ba）.这一结果证明了IDR对精子核凝聚的重要性。gydF4y2Ba

除了IDR, H2B。8h一个s several amino acid differences to that of canonical H2Bs in the globular domain, including asparagine 234 (N234), which is canonically a lysine residue that is subject to monoubiquitylation^22gydF4y2Ba(扩展数据图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.H2B的无能。8ΔIDR营救gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba精子核表型(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)表明，没有IDR, H2B。8globular domain cannot mediate nuclear compaction. Nonetheless, as H2B monoubiquitylation is an important modification^30.gydF4y2Ba我们检查了N234是否对H2B很重要。8通过表达突变的H2B发挥功能。8with the 234th asparagine replaced by lysine (H2B.8-N234K). The expression of H2B.8-N234K fully complemented theh2b.8gydF4y2Ba精子核大小表型(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，这表明N234不是H2B所必需的。8功能。gydF4y2Ba

染色质和核凝聚对H2B IDR的依赖性。8might result from the disordered state of the IDR and associated phase-separation ability or from IDR-mediated recruitment of unknown chromatin-condensing factors. To test these hypotheses, we expressed H2B.8 with a randomly scrambled IDR sequence (H2B.8-scrambledIDR) or with the native IDR replaced by animal IDR sequences of similar negative charge (H2B.8-EWSR-IDR and H2B.8-TAF15-IDR)^31gydF4y2Ba并测量了它们对烟叶核大小的影响。类似于原生H2B的作用。8、H2B的表达。8-scrambledIDR H2B。8-EWSR-IDR和H2B。8-TAF15-IDR all effectively condensed the nuclei of tobacco epidermis (Extended Data Fig.3 hgydF4y2Ba）.这一结果表明H2B的功能。8relies on phase-separation ability instead of specific sequence motifs within the IDR. In line with this, although the presence of the IDR is conserved among flowering plants, the sequences of H2B.8 IDRs are diverse (Supplementary Table1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

进一步了解H2B。8一个ctivity, we determined the genomic localization of H2B.8 by performing native chromatin immunoprecipitation assay with sequencing (ChIP-seq) onpH2B.8: H2B.8-eGFPh2b.8gydF4y2Ba花粉使用gfp特异性抗体。该分析鉴定出H2B。8peaks that occupied about 17% of the sperm genome. This value was comparable with our mass spectrometry results, which showed that approximately 13% of canonical H2B is replaced by H2B.8 in sperm (Extended Data Fig.1 bgydF4y2Ba）.H2B.8was most enriched within so-called euchromatic transposable elements (TEs) (Fig.4 a、bgydF4y2Ba)，它们富含at，并且缺乏H3K9me2和其他异色标记gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．异色TEs，通常富含gc和h3k9me2gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba美国的h2b含量相对较少(无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba）.H2B.8was excluded from the bodies of transcribed genes compared with inactive genes and intergenic regions, and H2B.8 enrichment and gene transcription were anticorrelated (Fig.4得了gydF4y2Ba）.H2B.8distribution along chromosomes followed that of euchromatic TEs, with H2B.8 most abundant at the edges of pericentromeric regions (Fig.4 dgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

进一步了解H2B的染色质偏好。8和whether its localization pattern is intrinsically determined by H2B.8 or other sperm-specific components, we performed native ChIP-seq with seedlings of the ectopic H2B.8 expression line (p35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba）.这揭示了一种类似的H2B。8localization pattern to that in sperm, with enrichment in euchromatic TEs and intergenic regions (Extended Data Fig.4罪犯gydF4y2Ba）.同时具有异位H2B的能力。8to condense somatic cell chromatin and nuclei (Fig.2 c, dgydF4y2Ba)，这些结果表明H2B。8deposition does not rely on sperm-specific factors. Next, utilizing available seedling epigenomic data, we explored H2B.8 associations with other chromatin features. Principal component analysis (PCA) revealed that H2B.8 clustered with neither permissive nor repressive chromatin modifications but associated with GC content (Fig.4 egydF4y2Ba）.H2B的多元线性回归模型。8further showed that transcription and GC content were the best predictors of H2B.8 localization, with which strong anticorrelations exist (Fig.4 c fgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba）.这也许可以解释为什么H2B。8is strongly depleted from transcribed genes (Fig.4 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba）.在基因组的其余部分，很少有转录，H2B。8一个ccumulated at GC-poor elements, mostly euchromatic TEs and intergenic regions (Extended Data Fig.4 e, ggydF4y2Ba）.综上所述，我们的结果表明H2B。8localization is mostly driven by transcription and GC content rather than sperm-specific factors.

目前尚不清楚为什么是H2B。8localization is associated with transcription and GC content; however, our cytological observations provided indications. 3D-SIM showed that unlike the full-length H2B.8, which is largely devoid in heterochromatin, H2B.8ΔIDR preferentially located to heterochromatin when expressed in sperm or seedling cells (Fig.2摄氏度gydF4y2Ba）.为了验证这一观察结果，并检查H2B的基因组定位。8ΔIDR，我们对H2B进行了ChIP-seq。8ΔIDR异位表达(gydF4y2Bap35区域:H2B.8ΔIDR-eGFPgydF4y2Ba)幼苗，并将结果与gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba(和gydF4y2Bap35区域:H2B.2-eGFPgydF4y2Ba作为对照)幼苗。与细胞学结果一致，H2B。8ΔIDR preferentially located to pericentromeric heterochromatin, and its abundance along chromosomal arms was generally reduced compared with H2B.8 (Extended Data Fig.5gydF4y2Ba）.值得注意的是，虽然IDR的缺失显著降低了H2B的富集。8, H2B增高。8deposition in heterochromatic TEs, it did not disrupt the preferential depletion of H2B.8 from transcribed genes (Extended Data Fig.5 bgydF4y2Ba）.这一发现表明H2B的IDR。8is required for the preferential localization of H2B.8 in euchromatin, but not for its exclusion from transcribed regions.

染色质凝聚通常与转录抑制有关gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．因此，H2B的定位。8in the non-transcribing parts of the genome could arise through two mechanisms. Either H2B.8 suppresses transcription or it is excluded from transcribed regions. To test these hypotheses, we isolated wild-type andh2b.8gydF4y2Ba突变精子细胞并进行rna测序。在野生型和野生型中表达的12198个基因中gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba精子中没有明显的表达改变gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.同样，我们没有发现任何te在gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba(扩展数据图)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.野生型和野生型rna序列分析gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba幼苗进一步支持了H2B的可忽略效应。8转录(扩展数据图)gydF4y2Ba6 b, cgydF4y2Ba）.因此，我们的结果表明，与蛋白蛋白不同，蛋白蛋白以牺牲转录潜力为代价浓缩动物精子gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba, H2B。8condenses plant sperm without suppressing transcription.

直接检测H2B是否。8inhibits transcriptional activation, we exposedp35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba以及野生型幼苗对干旱胁迫的转录反应。可比较的转录组变化gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba和野生型幼苗在干旱处理后的表现(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba）.此外，干旱处理和对照的ChIP-seqgydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba幼苗显示H2B。8is evicted from genes induced by drought, such as高度ABA-InducedgydF4y2Ba1 (HAI1)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba还gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba)，而受干旱抑制的基因获得h2b8(无花果。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba）.这些结果表明H2B。8does not inhibit gene transcription but is instead removed by transcription. This process may underlie the localization of H2B.8 in unexpressed euchromatin.

探讨H2B的生物学意义。8-mediated sperm condensation, we performed reciprocal crosses between theh2b.8gydF4y2Ba杂合突变体和野生型。当gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba以杂合突变体为雄性，FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba后代携带基因的可能性要低30%左右gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba比野生型等位基因(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01, Fisher确切检验;补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba）.相比之下，的传播gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba与野生型等位基因在雌性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.64，费雪精确检验;补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)，证明H2B。8is important for male fertility. The fertility defect ofh2b.8gydF4y2Ba是不是由花粉萌发中断引起的gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba离体花粉粒萌发率与野生型相当(补充表)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.这个结果与H2B的零效应是一致的。8 .转录(图2)gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6模拟gydF4y2Ba)，并表明生育缺陷最有可能是由精子核增大引起的。gydF4y2Ba

人工杂交是一个有压力的过程，雌蕊(雌性器官)稍微干燥，在比正常情况下更早的发育阶段授粉。调查是否gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba在一个压力较小的交配环境中，我们研究了自花授粉产生的后代的分离率gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba杂合的植物。我们观察到预期的孟德尔分离比(gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 1462;补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，这表明gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba当植物在实验室条件下进行自交受精时，突变不会影响肥力。H2B。8is transiently expressed in mature seeds (Extended Data Fig.1 dgydF4y2Ba)，这个结果也证明了gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba在实验室条件下不影响种子发育。总的来说，我们的观测表明H2B。8is important for sperm fertility in challenging or stressful situations, such as those created by manual crossing. This finding might be relevant to reproduction under natural environmental conditions, which are usually less favourable than standard laboratory conditions.

除了3D-SIM观察到精子中染色质的整体凝聚外，异染色质病灶也有轻微的去凝聚(图2)。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba）.了解这是否是由H2B引起的。8，we performed immunostaining using H3K9me2-specific antibodies and measured the volume of H3K9me2 foci inh2b.8gydF4y2Ba突变体核。的gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变显著减少了精子中异染色质焦点的体积，使其降至与生殖核相似的水平(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba）.H3K9me2异染色质病灶扩大、去致密gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba幼苗核比野生型核多(图2)。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba）.大多数野生型细胞核显示高度浓缩的异染色质病灶，但在野生型细胞核中很少发现gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba幼苗核(扩展数据图)gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba）.大多数gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba幼苗核表现出适度分散的异染色质焦点(图2)。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)，让人想起精子中的那些(图2)。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba）.这一结果表明H2B。8c一个uses heterochromatin foci to decondense.

我们的数据还表明异染色质病灶的去浓缩依赖于H2B。8相分离，作为H2B的表达。8ΔIDR不影响异染色质(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba）.异染色质焦点也是相分离凝聚物gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}这表明两种凝析油之间存在相互作用。的确，尽管H2B。8和heterochromatic condensates were mostly distinct, some physical associations were observed (Fig.2摄氏度gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba）.总的来说，我们的结果表明，染色质通过H2B的冷凝。8phase separation affects heterochromatin condensation, probably because H2B.8-associated AT-rich euchromatic TEs are interspersed with heterochromatic TEs in pericentromeric regions (Fig.4 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba）.与H2B无关的其他假设。8相分离也似是而非;例如H2B。8might directly recruit factors that interfere with heterochromatin condensation.

了解H2B是如何。8mediates chromatin condensation, we performed genome-wide chromosome conformation capture analysis^35gydF4y2Ba(Hi-C)在异位表达H2B.8的幼苗上（gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba)和野生型对照。将Hi-C文库测序至千碱基分辨率(扩展数据图)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)，我们的野生型接触矩阵与之前发表的实验相当gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}(扩展数据图gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba）.如前所述gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}，拓扑关联域不存在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，但端粒经常与着丝粒相关(扩展数据图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

的比较gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba野生型的Hi-C数据显示了高阶染色质结构的改变。在染色体内，异位H2B。8c一个used increased short-range contacts (200 kb–1.1 Mb) (Fig.6gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba）.短程染色体内相互作用表明染色质凝聚，这表明H2B。8主要通过集中线性近端区域形成聚集体(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba）.支持这一观点的是，近距离接触的增加与本地H2B病毒密切相关。斯皮尔曼的gydF4y2BaρgydF4y2Ba= 0.97)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

中心周围区域(异染色质)和远端染色体臂(常染色质)之间的接触也增加gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba苗(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba）.同时，胞内粒之间的染色体间相互作用减少(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba）.这些改变与细胞学观察到的异染色质去浓缩和异染色质病灶与H2B的关联一致。8 .凝析油(图2)gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba）.H2B的作用。8was local, as the interactions between pericentromeric regions and chromosomal arms increased at regions with abundant H2B.8 (Fig.6摄氏度gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba）.这些观察结果支持了异染色质病灶分散是由H2B引起的假设。8-mediated aggregation of euchromatic TEs that are abundant in and near pericentromeric regions (Fig.4 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba）.综上所述，我们的Hi-C和ChIP-seq数据表明H2B。8一个chieves a form of global chromatin condensation through the binding and aggregation of transcriptionally inactive AT-rich sequences dispersed throughout the genome.

我们的研究结果揭示了H2B驱动染色质凝聚的机制。8诱导相分离(扩展数据图)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.精子核中的染色质聚集体减少gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，而异位表达H2B。8in somatic cells was sufficient to induce chromatin aggregates in an IDR-dependent manner (Fig.2摄氏度gydF4y2Ba）.Hi-C和细胞学观察显示H2B。8f或ms chromatin condensates by increasing interactions between H2B.8-enriched chromosomal regions (Figs.2摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 b, cgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba）.由于H2B。8deposition within AT-rich sequences in both pericentromeric regions and chromosomal arms (Fig.4 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)，广泛的染色体区域通过相分离浓缩。在间期体细胞中，常染色质占据了细胞核的大部分体积gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．因为H2B。8is abundant in euchromatin, H2B.8-induced chromatin condensation is highly effective at condensing nuclei (Fig.2 a, dgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

尽管它有效，H2B。8compacts nuclei without compromising transcription (Fig.5 a、bgydF4y2Ba）.对于有游动精子的物种来说，精子头的大小至关重要gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}在美国，DNA凝聚可能是最重要的，转录可能是次要的。蛋白蛋白可以极大地浓缩DNA，除了被子植物(开花植物)和裸子植物外，在大多数多细胞真核生物的精子中都发现了蛋白蛋白。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.这包括苔藓植物和蕨类植物，这两种植物都有活动的精子，并使用蛋白蛋白来凝结精子gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.相比之下，H2B。8is specific to flowering plants. Flowering plants have immotile sperm and may benefit from a less extreme approach that condenses nuclei without limiting transcription. This moderate level of condensation is still important for fertility, ash2b.8gydF4y2Ba突变可显著减少男性传播(补充表)gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba）.精子转录(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)和离体花粉萌发(补充表)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)不受gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba突变，生育能力下降可能是由于精子核增大引起的。我们推测，受精发生在深嵌在被子植物母体组织中的胚珠上，可能有利于较小的精子核。与这一观点相一致的是，裸子植物有暴露的胚珠，产生的精子具有未凝聚的核gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba缺少h2b(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.因此,H2B。8is an evolutionary innovation of angiosperms that achieves a moderate level of chromatin condensation that is compatible with active transcription.

植物生长条件gydF4y2Ba

一个。gydF4y2Ba芥gydF4y2Ba本研究中使用的植物(Col-0生态型)在22°C和70%湿度的长白天(16 h光照，8 h黑暗)条件下生长。在相同条件下，幼苗在无葡萄糖的萌发培养基上生长。gydF4y2Ba

CRISPR-Cas9突变体的产生gydF4y2Ba

的突变等位基因gydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba是使用CRISPR-Cas9技术生成的吗gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．四种单导rna (sgRNAs);补充表gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba)使用CHOPCHOP (v.3)设计。gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba并使用金门系统进行克隆gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．构念被转化为gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba菌株GV3101使用花浸渍野生型(WT) Col-0gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba芥gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．通过Sanger测序筛选转化子。选择的细胞系被带到下一代，产生不含Cas9的纯合突变体。行gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2Ba用dCAPS和EcoNI进行基因分型，而gydF4y2Bah2b.8-2gydF4y2Ba经PCR分型(补充表gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

向量克隆gydF4y2Ba

对于H2B。8reporter constructs (pH2B.8: H2B.8-eGFPgydF4y2Ba和gydF4y2BapH2B.8: H2B.8-MycgydF4y2Ba)，上游约2 kbgydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba克隆为启动子和gydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba扩增gDNA序列(补充表)gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba）.使用多位点网关技术(Thermo Fisher Scientific)， PCR产物分别连接到P4P1r和pDONR207上。将序列组装到表达载体pK7m34GW上，并在P2rP3中添加羧基末端eGFP或3× Myc标签。异位H2B。8expression vector (p35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba)以相同的方式生成，但使用gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba启动子。gydF4y2Ba

原生和异位H2B。8ΔIDR expression constructs (pH2B.8: H2B.8ΔIDR-YFPgydF4y2Ba和gydF4y2Bap35区域:H2B.8ΔIDR-YFPgydF4y2Ba，分别)通过重叠PCR去除IDR序列产生，而异位H2B.2（gydF4y2Bap35区域:H2B.2-YFPgydF4y2Ba)克隆自gDNA(补充表)gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba）.将产物连接到含有基因的pCAMBIA1300载体骨架上gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba启动子和c端eGFP/YFP使用In-Fusion克隆系统(Takara Bio)。gydF4y2Ba

的gydF4y2BapH2B.8: H2B.8-N234K-MycgydF4y2Ba通过重叠PCR生成构建物(补充表)gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba)，连接到pDONR207，随后结合到pDONR207gydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba使用MultiSite Gateway Technology (Thermo Fisher Scientific)在pK7m34GW表达载体中添加启动子和c端3x Myc标签。gydF4y2Ba

为gydF4y2Bap35区域:H2B.8-scrambledIDR-eGFPgydF4y2Ba，gydF4y2Bap35区域:H2B.8-EWSR1-IDR-eGFPgydF4y2Ba和gydF4y2Bap35区域:H2B.8-TAF15-IDR-eGFPgydF4y2Ba构建后的乱序didr(由Python 3.9随机打乱IDR的氨基酸序列:DEVIQDISANPPVLENEPVTPSEPTVQEDTRECIETPEETPISVPEGEATPETKVQGDNSDFSSQTRTVDLKEVPSVPPREGTPPTPVVDDVE);EWSR1-IDRgydF4y2Ba^31gydF4y2Ba(astdystysqaaaqqgysaytaqptqgygyttqayttqqqptdvsytqqqtayatsyggppgptptptppvqgygtgaydttttgqasyaqsaygqqpaypaygqqqpaataptrppgptpttsqpptsgpssydqssysyqqqqsysygqqpptsyppqtgsysqapsqysqqsssygqqqqfrqdhpssmgvygq)和TAF15-IDRgydF4y2Ba^31gydF4y2Ba(sdsgsygqsggeqqsystemygnpgsqgygqasqsysgygqttdssygqnysgsygqsqsgysqsyggyqqkssysqqpynnqgqqqnmessgsqggrapsydqpdygqqdqqsgydqhqgsydeqsnydqqhdsysqnqqsyhsq)序列分别通过gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba密码子的使用和合成。然后将合成的碎片融合gydF4y2BaH2B.8gydF4y2Ba(补充表gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba）.插入克隆到pCAMBIA1300载体，其中包含gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba启动子和c端eGFP。gydF4y2Ba

将上述向量变换为gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2BaT突变体gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}代或WT植物。单插入转基因株系gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}或TgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在本研究中使用了代，并且在每个实验中至少包括两个独立的转基因系。gydF4y2Ba

精子、营养体和叶核总蛋白提取gydF4y2Ba

如前所述，使用BD FACSMelody细胞分选器(BD Biosciences)，用FACS分离精子和营养细胞核(每种细胞类型分离两个重复)gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.每个重复共收集200万个分选细胞核(从大约40 ml开放花中分离)，加入0.45体积的3.2倍裂解缓冲液(10% SDS, 100 mM TEAB, pH 7.55)。细胞核在95℃裂解5分钟，然后在13000℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下静置8分钟。裂解液被放入一个新管中。加入十分之一体积的12%磷酸，用移液混合。然后，加入6倍体积的S-Trap缓冲液(90%水溶液MeOH, 100 mM TEAB, pH 7.1)，通过移液混合。在4000℃下离心，将蛋白装载到S-Trap Micro柱(Protifi)上gydF4y2BaggydF4y2Ba30岁。用150µl S-Trap缓冲液洗涤三次。蛋白在柱上用4µg胰蛋白酶在50 mM TEAB中于47°C下消化1 h。多肽经离心顺序洗脱(4000gydF4y2BaggydF4y2Ba50 mM TEAB 40µl, 0.2%甲酸40µl, 50%乙腈和0.2%甲酸35µl。gydF4y2Ba

液相色谱-质谱法gydF4y2Ba

洗脱后的肽溶液干燥，将肽溶解于0.1%三氟乙酸和3%乙腈中，进行液相色谱-串联质谱(LC-MS /MS)分析。精子和营养细胞核样品在Orbitrap融合三重质谱联用的UltiMate 3000 rslnano LC系统(Thermo Fisher Scientific)上进行纳米LC - MS/MS分析。样品以0.1%三氟乙酸为前柱，以20µl min的速度装载和捕获gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba3分钟。然后将捕集柱与分析柱(nanoEase M/Z柱，HSS C18 T3, 100 Å， 1.8µM, Waters)同步切换，使用溶剂A(水，0.05%甲酸)和溶剂B(80%乙腈，0.05%甲酸)的长梯度进行分离，流速为0.3µl mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba: 0-3分钟3% B(仅限疏水阀);3-14 min线性增加B至13%;14-113 min, B值提高到39%;113-123 min增加B至55%;然后上升到99% B，再平衡到3% B。gydF4y2Ba

数据是在正离子模式下通过以下质谱仪设置获得的。MS1/OT:分辨率120k，剖面模式，质量范围gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba300 - 1800，自动控粒4egydF4y2Ba^5gydF4y2Ba填充时间为50毫秒。MS2/IT，采用高能碰撞解离碎片化进行数据依赖分析，参数为:IT快速top30，质心模式，隔离窗口为1.6 Da，电荷状态为2-5，阈值为1.9egydF4y2Ba^4gydF4y2Ba，碰撞能量30，自动增益控制目标1.9egydF4y2Ba^4gydF4y2Ba，最大注射时间35 ms，动态排除1计数，排除15 s，排除质量窗口为±5 ppm。gydF4y2Ba

对于精子和营养核蛋白质组，使用MaxQuant (v.1.6.1.0)生成重新校准的峰列表。gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba使用TAIR10_pep_20101214进行无标记定量gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba蛋白质序列数据库(TAIR, 35386个条目)和MaxQuant污染物数据库(245个条目)。MaxQuant提供的无标签定量结果和默认参数与同一数据库上内部Mascot Server 2.4.1 (Matrix Science)的搜索结果一起使用。对于所有搜索，前体公差为6 ppm，片段公差为0.6 Da。该酶设置为胰蛋白酶/P，最多允许遗漏2条裂解，氧化(M)和乙酰化(蛋白n项)被设置为可变修饰，氨基甲基化(C)被设置为固定修饰。将检索结果输入到Scaffold 4 (Proteome Software)中，蛋白质的识别概率为99%，肽的识别概率为95%。gydF4y2Ba

组蛋白排列和疾病预测gydF4y2Ba

组蛋白DNA和蛋白序列比对使用CLC Main Workbench软件(v.8.1;试剂盒)。使用PONDR对内在障碍进行预测gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba使用VL-XT算法。原始数据使用R (v.3.6.0)中的ggplot2绘制。gydF4y2Ba^{48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

组蛋白H2B系统发育分析gydF4y2Ba

从Phytozome下载植物H2B蛋白序列gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba, CongeniegydF4y2Ba^51gydF4y2Ba、睡莲塘gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba， Magnoliid基因组gydF4y2Ba^{53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba}和UniProtgydF4y2Ba^55gydF4y2Ba．人类和酵母H2B序列从UniProt获得，并作为系统发育的外群。gydF4y2Ba

序列被导入到MEGA-XgydF4y2Ba^56gydF4y2Ba并使用带有默认参数的MUSCLE进行对齐。系统发育是使用邻居连接测试生成的，应用泊松模型，并允许统一的替代率。H2B.8homologues were identified owing to the distinct branch formed, separate from canonical H2B variants. Several representative H2B.8 homologues were searched using BLAST^57gydF4y2Ba查询这些同源物是否为开花植物所特有。H2B.8homologues are presented in Supplementary Table1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

共聚焦显微镜和分析gydF4y2Ba

如前所述分离出小孢子和花粉gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba用Hoechst 33342染色，用徕卡SP8X共聚焦显微镜检查。幼胚被解剖gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba用碘化丙啶染色成像。用体视显微镜从干种子中分离成熟胚。成熟胚胎和幼苗(包括根)用0.1% Triton X-100和0.5µg ml在PBS中染色gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba显微镜检查前DAPI 5-10分钟(Zeiss 880, airscan模式)。如前所述，用2周大的幼苗进行免疫荧光gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

利用ImageJ中的半自动流水线，从dapi染色的全花粉共聚焦图像中定量精子核大小。gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．简单地说，使用自动阈值获得核，然后使用高斯模糊处理平滑边缘。重复自动阈值，然后使用魔杖工具选择细胞核。然后测量核面积(μm)gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}）.分析的体细胞核为根尖伸长区的维管柱细胞。选择这样的细胞核是因为能够准确地识别组织内的细胞类型。使用ImageJ,gydF4y2BaZgydF4y2Ba-堆在根尖内分成不同细胞层的子堆。然后获得最大强度投影，以解释核深度的细微差异。图像分析采用与精核相同的半自动化方法。R进行统计分析;我们使用方差分析和Tukey事后检验进行两两比较。gydF4y2Ba

病灶在WT和gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba使用ImageJ插件FociPicker3DgydF4y2Ba^60gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对于DAPI和H2B。8colocalization (pH2B.8: H2B.8-eGFPgydF4y2Ba和gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba)，使用3D ImageJ Suite工具进行Otsu阈值分割gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．在每个分割的细胞核中提取DAPI和GFP通道的荧光强度测量。计算20 × 20体素区域的平均值。每个体积值通过除以整个相应核的DAPI或GFP强度之和进行归一化。根据GFP值将区域分为八个分位数，并根据DAPI强度绘制。gydF4y2Ba

H3K9me2疫源地的分类如前所述gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．H2B.8-mediated chromatin aggregates were classified in the same way.

量化H2B的大小和数量。8一个ggregates and H3K9me2 domains, we used the 3D ImageJ Suite tools^61gydF4y2Ba．在每个荧光通道中，我们使用Otsu阈值进行三维核分割gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．使用ggplot2在R中绘制段的数量和体积。gydF4y2Ba

3D-SIM和分析gydF4y2Ba

如前所述，从花粉(从大约1ml的花中收集)中分离精子和营养核gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba用200 μl Galbraith缓冲液(45 mM MgCl)重悬gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 30 mM柠檬酸钠，20 mM MOPS和0.1% Triton X-100, pH 7.0)。对于生殖核，人工从花蕾中分离双细胞花粉，并通过DAPI染色和荧光显微镜单独分期。在裂解缓冲液(15 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.5 mM精胺，80 mM KCl, 20 mM NaCl和0.1% Triton X-100)中，用剃须刀片切碎提取细胞核。将悬浮液通过35 μm过滤器(康宁)过滤到1.7 ml管中。核在500时成球gydF4y2BaggydF4y2Ba在200 μl裂解缓冲液中重悬3min。gydF4y2Ba

细胞核在4%无甲基甲醛(Thermo Scientific)溶液中固定5分钟。HiQA号1.5H盖片(CellPath)用10%盐酸洗涤30分钟，然后在H中洗涤三次gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O静置5分钟以去除杂质。固定的核在500度时旋转到盖上gydF4y2BaggydF4y2Ba用Shandon Cytospin 2酶孵育3分钟。用4%无甲基甲醛对细胞核进行印迹，重复固定5分钟。除去固定液，盖片在PBS中洗涤三次，每次洗涤5分钟。细胞核在加0.1% Tween-20 (PBST)的PBS中用3% BSA阻断30分钟。如果进行免疫染色，抗体在3% BSA的PBST中稀释200倍，然后在盖片上印迹到细胞核上。抗体孵育在4°C下过夜。用PBST洗涤3次，去除一抗5min。二抗与一抗类似稀释，然后加入细胞核。在室温加湿室中培养1小时。如果不进行免疫染色，该方案此时恢复。 PBST washes were repeated as before. Nuclei were stained in the dark with either DAPI or SYBR Green (Invitrogen) at 2 mg μl^1gydF4y2Ba或100倍稀释，分别稀释5分钟。DNA染色用H洗涤去除gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}5分钟。用13 μl Vectashield H-1000贴载介质将盖片粘附于载玻片上。在蔡司Elyra PS.1超分辨率显微镜上使用×63油浸透镜对细胞核进行成像。gydF4y2Ba

使用蔡司Zen Black软件对SIM进行三维重建。使用ImageJ的交互式3D表面绘图插件获取与图像相关的强度轮廓gydF4y2Ba^{62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

从WT和中获取体素强度gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba用Otsu阈值法对精子、细胞核进行分割，提取个体素。荧光强度通过除以总核强度归一化。用ggplot2在R中绘制入盒体素强度的密度。gydF4y2Ba

组蛋白纯化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

序列gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba芥gydF4y2Ba组蛋白H2B。8, H2B。8ΔIDR, H2B.8-scrambledIDR, H2B.2, H2A, H3, H3 mutant K9CC110A and H4 were codon optimized for protein expression inE。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba将(Genewiz)合成为pET30a+载体，带不可切割的c端8x his -标签，然后转化为gydF4y2BaE。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba菌株BL21和纯化如前所述gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．简而言之，在LB培养基中，30 μg ml, 37℃条件下，细胞生长至光密度0.5-0.6gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba卡那霉素。加入0.5 mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导组蛋白表达，37℃孵育4 h。每分钟4000转离心收集细胞。30min后用1x PBS重悬。重复离心，细胞重悬于洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA和5 mM 2-巯基乙醇)中。超声裂解细胞，并在18000 r.p.m.下粉碎碎片。20分钟。丢弃上清，用洗涤缓冲液和1% Triton X-100重悬颗粒。样品被超声处理，然后用洗涤缓冲液再洗涤两次。然后用展开缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 7 M盐酸胍和5 mM 2-巯基乙醇)重悬颗粒，在室温下混合1.5 h，使颗粒完全溶解。 The sample was centrifuged at 18,000 r.p.m. for 30 min. The supernatant was flash-frozen in liquid nitrogen and then stored at −80 °C.

组蛋白八聚体和核小体重构gydF4y2Ba

widom601序列12x177bp的DNA模板按照前面的描述进行克隆和纯化gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．177bp DNA序列序列如下:gydF4y2Ba

5 ' -GAGCATCCGGATCCCCTGGAGAATCCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGACAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGCTGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTACTCCCTAGTCTCCAGGCACGTGTCACATATATACATCCTGTTCCAGTGCCGGACCC-3 'gydF4y2Ba

各自的组蛋白八聚体如前所述重建gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．简单地说，将等量的四种组蛋白加入到展开缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 7 M胍HCl和5 mM B-ME)中，然后透析到折叠缓冲液(2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA和5 mM 2-巯基乙醇)中，然后使用Superdex 200柱(Cytiva)进行纯化。gydF4y2Ba

如前所述，核小体使用盐透析方法组装gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．组蛋白八聚体和DNA模板在TEN缓冲液(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA和2 M NaCl)中混合，在TEN缓冲液中4°C透析16-18 h，在TE缓冲液(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)中缓慢泵送持续稀释，使NaCl浓度从2降低到0.6 M。样品在HE缓冲液(10 mM HEPES pH 7.5, 0.1 mM EDTA)中透析4小时后收集。在低浓度(2.5 μg DNA和相应的八聚体在50 μl重构体系中)下组装核小体阵列以评估其质量，并用FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV透射电镜检测组蛋白八聚体与DNA模板的化学计量。gydF4y2Ba

Alexa Fluor 594 H3 K9CC110A标记和标记核小体重构gydF4y2Ba

将1.5 M过量的Alexa Fluor 594 (AF594)- c5 -马来酰亚胺(Invitrogen)添加到组蛋白展开缓冲液中，然后在室温下黑暗孵育4小时，对组蛋白H3 K9CC110A进行荧光标记。通过添加10 mM DTT来淬灭偶联反应，通过Superdex 200 Increase 10/300柱(Cytiva)在打开缓冲液中流动af594标记的组蛋白H3来去除游离荧光团。然后将荧光标记的H3与相应的组蛋白结合在展开缓冲液中进行如上所述的组蛋白八聚体重建。组蛋白H3突变体C110A不影响核小体结构或定位gydF4y2Ba^66gydF4y2BaH3突变体K9CC110A通常用于将甲基赖氨酸类似物安装在半胱氨酸上，其功能与天然对应物相似gydF4y2Ba^{67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba}．重组前将荧光标记和未标记的组蛋白八聚体按1:100的比例组合，以减少荧光标记过程中对样品的潜在影响gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

体外染色质凝析物形成gydF4y2Ba

体外相分离实验如前所述进行gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．简单地说，实验记录在384孔玻璃底板(Cellvis)上，并用光学透明胶膜密封。使用前，384孔板用5K mpeg -硅烷聚乙二醇化，用BSA钝化。核小体阵列样品首先在染色质稀释缓冲液(25 mM Tris)中平衡gydF4y2Ba⋅gydF4y2BaOAc, pH 7.5, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1 mg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2BaBSA, 5% (w/v)甘油)，室温孵育5分钟。然后将核小体阵列样品添加到1体积的染色质稀释缓冲液中，其中存在盐(KOAc和/或Mg(OAc))。gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})，并转移到聚乙二醇化和bsa钝化的384孔板上，室温孵育30分钟。加入染色质稀释缓冲液后，用YOYO-1碘化物(491/509)(Invitrogen)对核小体阵列内的双链DNA进行染色。gydF4y2Ba

体外FRAP和液滴融合gydF4y2Ba

使用配备×100油浸物镜的NIKON A1共聚焦显微镜，在上述条件下形成染色质凝聚物后，进行体外FRAP和液滴融合实验。用561 nm激光脉冲(重复2次，强度20%，停留时间1 s)对液滴进行漂白。漂白后的强度归一化到漂白前的水平，以获得恢复的措施。使用NIS-Elements AR Analysis软件进行图像分析。gydF4y2Ba

烟草中的瞬时表达gydF4y2Ba

向量(gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba，gydF4y2Bap35区域:H2B.8-scrambledIDR-eGFPgydF4y2Ba，gydF4y2Bap35区域:H2B.8-EWSR1-IDR-eGFPgydF4y2Ba和gydF4y2Bap35区域:H2B.8-TAF15-IDR-eGFPgydF4y2Ba)变成了gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba通过gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba感染短暂表达。注射后2 d，分离叶表皮，用含有0.2% (v/v) Triton X-100的DAPI溶液进行染色。使用徕卡SP8X共聚焦显微镜获得图像。gydF4y2Ba

干旱胁迫处理gydF4y2Ba

10天大的WT和gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba收集幼苗(每个处理两个重复)，在50% (w/v) PEG6000 1x PBS(干旱处理)或1x PBS(对照)中孵育3 h。gydF4y2Ba

组蛋白提取用于免疫印迹gydF4y2Ba

叶组织(0.5 g)在液氮中研磨，悬浮在4ml组蛋白提取缓冲液中(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.25 M HCl, 5 mM DTT和1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))。悬浮液通过一层奇迹棉(默克密理博)过滤，并在4000转/分离心。在4°C下放置10分钟。将上清转移到新鲜试管中，与1.75 ml三氯乙酸溶液(T0699, Sigma)混合。沉淀物在4000转/分的转速下离心收集。在4°C下放置20分钟，然后用1ml丙酮洗涤两次。将颗粒风干后，用1倍LDS样品缓冲液(NP0007, Invitrogen)孵育过夜。样品在95°C下变性10分钟。对于精子，FACS对500万个精子核进行了分类(补充图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.精子核在1200度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置5分钟。用1 ml组蛋白提取缓冲液重悬核球，加入0.25 ml三氯乙酸溶液混合。组蛋白的沉淀和洗脱方法与叶片相同。抗h3k9me2抗体(Abcam, ab1220)稀释1:50 000，进行免疫印迹。gydF4y2Ba

花粉和幼苗原生ChIP-seq文库制备、测序和分析gydF4y2Ba

约0.5 g 10日龄幼苗(每种基因型2个重复)用杵臼在液氮中研磨，并在核分离缓冲液(0.25 M蔗糖，15 mM PIPES pH 6.8, 5 mM MgCl)中均质gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 60mm KCl, 15mm NaCl, 1mm CaClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 0.9% Triton X-100, 1 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))，15分钟。通过两层miracle loth(默克密理博)过滤，将细胞核从碎片中分离出来。对于花粉核，我们收集了大约20毫升的开放花和在Galbraith缓冲液中分离的花粉(每个基因型分离两个重复)。在200µl的隔核缓冲液中，用玻璃珠将花粉顶点化，于2000 r.p.m.释放细胞核。3分钟。匀浆依次通过40µm和10µm细胞滤网过滤得到细胞核。为了最大限度地恢复细胞核，在再次进行过滤步骤之前，留在过滤器上的未破碎的花粉粒被回收到玻璃珠中并与核隔离缓冲液涡流。gydF4y2Ba

从幼苗或花粉中分离出悬浮核，在4000℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在TM2 (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl)中重悬10分钟gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}0.25 M蔗糖，1 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合物)。在4000℃冷离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba细胞核在MNase消化缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM CaCl)中重悬5mingydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}， 0.25 M蔗糖，1 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合物)与适量的MNase (New England Biolabs)，在37℃下孵育10分钟。加入EDTA至终浓度为25 mM，停止消化。加入十分之一体积的1% Triton X-100和1%脱氧胆酸钠，将样品放在冰上15分钟。然后，加入低盐缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合物)稀释反应，并在4℃下旋转1小时。离心后，上清液与预洗GFP-Trap珠(Chromotek)在4°C下过夜进行免疫沉淀。用低盐缓冲液和高盐缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0.1% Triton X-100和1 mM PMSF)分别洗涤2次，并用0.1 M NaHCO洗脱gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}和1% SDS)，在65°C下摇15分钟。洗脱液经蛋白酶K和rna酶A消化后提取苯酚-氯仿DNA。文库采用Ovation Ultralow System V2制备，并在NextSeq 500 (Illumina)上测序，测序结果为2× 38 bp。gydF4y2Ba

测序reads用Bowtie 2映射到TAIR10 (v.2.3.4.1)gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba保留单核体碎片。使用Samtools-1.7 rmdup删除重复读取。Bigwig文件通过使用deepTools (v.3.1.1)将IP bam文件规范化到各自的输入来生成。gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba．每个实验的2个重复被证实是高度相关的;单个重复用于下游分析。配置文件使用IGV (v.2.6.2)可视化。gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

元图和热图背后的数据是用deepTools生成的，并用R中的自定义脚本绘制。gydF4y2Ba

通过幼苗H3K9me2富集(log)来定义TE类gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(免疫沉淀反应/输入))。考虑到H3K9me2在TEs富集的双峰分布，选择0.7作为异色(>0.7)和常色(<0.7)类的截止值。gydF4y2Ba

为了产生峰值，H2B。8或H2B。8ΔIDR enrichment was calculated over 50-bp windows and those with >1.2 log_{2 gydF4y2Ba}(IP/input)保留。使用BEDtools (v.2.28.0)合并150 bp内的WindowsgydF4y2Ba^72gydF4y2Ba．区域按大小进行过滤，将<200 bp的区域从分析中删除。H2B.8enrichment was then calculated over the new regions, and those with <1.2 log_{2 gydF4y2Ba}(IP/input)被丢弃。其余区域定义为H2B。8的山峰。gydF4y2Ba

对于基因组覆盖，峰值被划分为50 bp的窗口，并根据重叠划分为基因、TE或基因间组。利用BEDtools确定火山地块与基因和TEs的重叠;25%的特征被一个被定义为重叠的峰值所覆盖。gydF4y2Ba

下载数据gydF4y2Ba^{73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba}以同样的方式进行映射和处理。使用deepTools计算分类基因组区域的PCA、Spearman和Pearson相关性，并使用ggplot2绘制R。gydF4y2Ba

Bisulfite-seq分析gydF4y2Ba

下载的测序读数gydF4y2Ba^81gydF4y2Ba使用TrimGalore (v.0.4.1) (gydF4y2Bahttps://github.com/FelixKrueger/TrimGaloregydF4y2Ba)，使用默认参数。使用Bismark (v.0.22.2)将读取映射到TAIR10。gydF4y2Ba^82gydF4y2Ba，甲基化使用MethylDackel (v.0.5.2) (gydF4y2Bahttps://github.com/dpryan79/MethylDackelgydF4y2Ba)，选择——CHG和——CHH选项。在PCA中使用CG甲基化数据。gydF4y2Ba

精子细胞和幼苗RNA-seq文库制备、测序和分析gydF4y2Ba

如前所述，用流式细胞仪分离精细胞gydF4y2Ba^83gydF4y2Ba，每个基因型分离两个重复(补充图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.使用Direct-zol RNA Microprep试剂盒从每个重复的100万个精子细胞(从大约100毫升开放的花中分离)中提取RNA。使用Plant RNeasy Mini试剂盒从10日龄的幼苗中提取RNA(在正常或干旱/模拟处理条件下，每种基因型分别使用3或2个重复的幼苗)。使用通用RNA-Seq文库制备试剂盒制备文库，并在NextSeq 500 (Illumina)上测序，测序结果为单端(76 bp)或成对端(2× 38 bp)。gydF4y2Ba

测序reads用TopHat (v.2.0.10)映射到TAIR10gydF4y2Ba^84gydF4y2Ba．Kallisto (v.0.43.0)gydF4y2Ba^85gydF4y2Ba和侦探——(v.0.30.0)gydF4y2Ba^86gydF4y2Ba用于获得每百万份成绩单(TPM)值和gydF4y2Ba问gydF4y2Ba值,分别。用| log鉴定差异表达基因和TEsgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(TPM fold-change) |≥2(≥1表示调用干旱响应基因)gydF4y2Ba问gydF4y2Ba< 0.05。火山图是用自定义的ggplot2 R脚本生成的。使用R中的ggplot2生成热图，使用som包将转录变化归一化。gydF4y2Ba

下载数据gydF4y2Ba^{87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba}映射，并以相同的方式获得TPM值。gydF4y2Ba

多元线性回归模型gydF4y2Ba

基因组被划分为200 bp的窗口，用于计算每个变量的丰度。对于ChIP-seq数据，请记录日志gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}使用deeptools中的multiBigwigSummary计算每个窗口的IP/input。对于亚硫酸酯-序列数据，计算CG甲基化的方法是使用窗口内CG环境中测序的Cs的数量除以CG环境中(C+T)的数量(没有CG位点或对齐的测序读数的窗口被删除)。对于RNA-seq数据，记录日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(每千碱基的转录本每百万映射读取(RPKM))计算每个窗口。gydF4y2Ba

在R中使用lm函数生成多元线性回归模型。对于每个变量，拟合线性模型来预测H2B。8 .浓缩和调整gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}值见补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba．逐步向模型中加入变量，通过计算调整值来检验调整后模型的预测能力gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}和赤池信息标准分数在R(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba）.使用基因组区域的分类变量建立了一个单独的模型来评估H2B之间的关联。8和基因组特征(调整)gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}模型的值见补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Hi-C文库制备，测序和分析gydF4y2Ba

收集2个10日龄幼苗(1-3 g)，用20 ml 2%甲醛溶液在室温下真空固定15 min，然后加入2.162 ml 2.5 M甘氨酸淬灭。固定苗组织用水冲洗三次，用纸巾擦干。gydF4y2Ba

在液氮中研磨释放细胞核，然后用25 ml萃取缓冲液I (0.4 M蔗糖，10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl)重悬gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}5 mM β-巯基乙醇，0.1 mM PMSF和13 μl蛋白酶抑制剂)。细胞核通过奇迹般滤布(Calbiochem)过滤，然后以每分钟4000转的速度离心。在4°C下放置20分钟。丢弃上清，用1 ml萃取缓冲液II (0.25 M蔗糖，10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl)重悬颗粒gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}1% Triton X-100, 5 mM β-巯基乙醇，0.1 mM PMSF和13 μl蛋白酶抑制剂)。然后将混合物在14000转/分的转速下离心。在4℃下，用300 μl萃取缓冲液III (1.7 M蔗糖，10 mM Tris-HCl pH 8, 0.15% Triton X-100, 2 mM MgCl)重悬10 mingydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}5 mM β-巯基乙醇，0.1 mM PMSF和1 μl蛋白酶抑制剂)。将混合物装入等量的清洁萃取缓冲液III上，在14000转/分的转速下离心。10分钟。用1倍冷的CutSmart缓冲液洗涤细胞核2次，最后以0.5 ml的体积重悬。SDS在65℃下渗透10 min，加入Triton X-100淬火SDS。随后，用400单位的MboI在37°C下轻轻摇晃过夜消化染色质。然后MboI变性停止活动。gydF4y2Ba

被消化的染色质通过生物素-14- dctp插入进行DNA末端修复，然后进行钝端结扎。与蛋白酶K在65℃下解交联后，用苯酚-氯仿萃取法纯化DNA。使用T4 DNA聚合酶从非结扎DNA片段末端去除生物素-14- dctp。通过超声波将DNA剪切到200-600 bp的范围内。接下来，片段进行末端修复，并被链霉亲和素C1磁珠拉下，以丰富含有接触信息的片段。然后将片段末端a尾化，连接测序适配器，通过PCR扩增文库12-14个循环。纯化后，使用Illumina HiSeq X Ten平台对文库进行测序，读取长度为2× 150bp。采用Annoroad基因技术进行Hi-C文库构建和测序。gydF4y2Ba

使用HiC-Pro (v.2.11.1)管道将测序reads映射到TAIR10参考基因组gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba．由HiC-Pro生成的包含映射读取的bam文件(bwt2merged.bam)被用作fanc (v.0.9.8)的输入文件。gydF4y2Ba^91gydF4y2Ba．使用' fanc auto '模块生成500,100,50,10和1kb的接触矩阵(hic文件)。将得到的分辨率为100 kb的hic文件导入“预期”模块，根据染色体内相互作用的基因组距离计算预期相互作用概率。对于矩阵和分数的比较，默认的比较方法是fold-change，并使用' fanc compare '命令。输出(对象)通过“fanc dump”传输到文本文件中，并在R中使用ggplot2将其可视化为热图。探讨是否观察到更高的接触gydF4y2Bap35区域:H2B.8-eGFPgydF4y2Ba依赖H2B。8incorporation, the genome was binned into 1-kb windows. H2B.8 signals (log_{2 gydF4y2Ba}(IP/input))，并按强度分为20个分位数。将每个分位数对的短程相互作用或中心点周围区域与染色体臂之间的相互作用的相互作用频率差异(由1kb分辨率的FAN-C生成的值)平均并绘制为热图。我们的Hi-C数据的分辨率估计如先前报道gydF4y2Ba^92gydF4y2Ba．我们的Hi-C数据被认为达到了1kb的分辨率，因为80%的基因组箱(1kb)有1000个接触点。我们的WT数据与公布的接触矩阵进行了比较gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

雄性传播试验gydF4y2Ba

杂合的gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2Ba突变体和野生型植物在两个不同的实验中由两个不同的研究人员杂交。突变型与WT等位基因的遗传通过dCAPS基因分型确定。其中一个试验以WT植株为雌性，与杂合子杂交gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2Ba作为雄性的突变植株;共743度gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba后代进行基因分型，结果列于补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba．在第二个实验中，杂合子之间的互反杂交gydF4y2Bah2b.8-1gydF4y2Ba突变株和WT株;总共574和575华氏度gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba后代基因分型(补充表)gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba）.在R中使用Fisher精确检验检验统计显著性。gydF4y2Ba

离体花粉萌发gydF4y2Ba

野生型和野生型的离体花粉萌发gydF4y2Bah2b.8gydF4y2Ba是否如前所述gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

统计和可重复性gydF4y2Ba

对实验数据和样本量进行的统计检验在图例中注明。所有数据点均来自生物复制。箱形图显示中位数(粗黑条)和第一、第三四分位数，下、上须分别延伸至第一、第三四分位数的四分位数间距或最高值和最低值的1.5倍。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba所有图中两两比较的值在补充表中列出gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．整个显微照片至少代表了三个独立的实验。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba