船舶交通和海洋噪声对灰鲸应激激素的影响

海洋生态系统经历了商业和娱乐航运和船舶交通的急剧增长^1，2，3.．这些运输形式可能对海洋野生动物种群产生负面影响^4，5，鲸目动物因船只撞击而死亡的风险增加^6，7，以及增加海洋环境中的噪音水平^8，9，10．须鲸特别容易受到航运和船只交通造成的声音干扰，因为它与主要用于通信、导航和觅食的频率重叠^11，12．这种频率重叠会导致“声学掩蔽”，由于环境噪声的升高，声波信号的传输或接收减弱，这可能会潜在地阻碍鲸类动物进行重要生活史活动的能力¹¹．因此，船只交通与鲸目动物之间致命和非致命相互作用的频繁发生可能会影响个体健康和种群生存能力。

人与野生动物的相互作用可能在短期和长期尺度上造成负面后果，然而，纵向监测人类活动对长寿野生动物种群的影响可能是困难的，通常需要大量资源和背景个人层面的信息(即人口统计数据)。¹³．因此，研究主要集中在将原因(即干扰源)与结果(即行为反应)直接联系起来的短期行为反应。^13，14．船舶碰撞对海洋哺乳动物的多种短期影响已被记录在案，包括行为状态的改变^{15，16，17，18}，增强团队凝聚力^{13，19，20.}，和位移^15，21．此外，个体可能会认为船只是一种风险，因此通过采用其他反掠夺策略来避开它们^{17，18，19，21}．然而，许多因素会影响反应的强度，包括血管运动^19，21，到容器的距离²²，以及船只数量²³以及一个人的社会背景、猎物斑块的质量、健康状况和之前遇到船只的历史²⁴．这些因素甚至可能鼓励个体容忍干扰，而不是逃避²⁵．在这种情况下，需要强调的是，短期行为变化的缺失并不意味着血管相互作用或其他压力源造成的影响的缺失^13，26，并强调有必要研究人类干扰对鲸目动物的生理影响，特别是在较长时间内，以帮助解决对种群动态的潜在后果^27，28．

通过观察个体对干扰的生理反应，可以发现体内平衡状态中重要的潜在变化。例如，遇到船只与宽吻海豚的代谢率有关(语truncatus）²¹座头鲸(最远）²⁹这是通过呼吸频率和浮出间隔来确定的。与压力相关的激素(如糖皮质激素[GCs]:皮质醇，皮质酮)浓度的变化与血管丰度和环境噪声的相关变化也有报道，虎鲸(Orcinus虎鲸）^30.北大西洋露脊鲸(NARWs;Eubalaena glacialis）³¹．虽然对海洋哺乳动物对船舶交通的生理反应进行了很少的研究，但评估仍然很少。尤其是长须鲸，由于样品采集的固有困难，它是所有哺乳动物中最不被了解的一种^32，33．然而，新的技术使非侵入性或微创性的方法可以收集样本，包括粪便、呼吸蒸汽和脂肪^{31，32，33，34，35}，这已被证明是监测须鲸生理的可靠技术。

事实上，人们已经成功地从各种长须鲸身上收集到了粪便样本，包括小须鲸^33，36座头鲸^37，38、蓝鲸(一道）^39，40，以及灰鲸(Eschrichtius南方）^41，42评估类固醇激素(如GCs、雄激素、孕激素、矿物皮质激素)的浓度^33，41它们最终被肝脏从血液循环中清除，通过尿液和粪便排出体外^43，44．在压力暴露后，粪便中的GC代谢物的浓度在数小时或数天内会增加，这一时间延迟由物种特有的肠道通过时间决定^43，44．因此，粪便GCs (fGC)可用于监测对急性干扰的生理反应，只要可以确定排泄的适当滞后时间(大型哺乳动物通常为1至2天)⁴⁴)．

多种因素会影响对粪便中激素浓度的评估^42，45，46，例如性别、年龄、营养状况、生殖状况和环境因素(如温度)⁴⁷)，所有这些都应该在个体水平上考虑，以可靠地将鲸鱼gc与特定的人为干扰联系起来。因此，本研究旨在更好地了解单个须鲸对船舶交通的生理反应，同时控制多种混杂因素。此外，我们还研究了船只交通和海洋噪声水平之间的相关性，为船只交通升高对灰鲸体内fGC浓度影响的根本原因增加了解释力。我们的研究集中在北太平洋东部(ENP)灰鲸种群的一个子群上，称为太平洋海岸喂养群(PCFG)，它们在6月至11月间沿着美国俄勒冈海岸觅食⁴⁸．在本研究区域，PCFG灰鲸暴露在不同程度和来源的船只交通¹⁵还有海洋噪音^49，50．

我们的目标是(1)描述每天离开港口的船只数量与港口入口外水听器记录的声压级(SPL)之间的关系，(2)确定船只交通和潜在混杂变量(即身体状况、年龄、性别、时间)对灰鲸fGC浓度的影响，(3)确定船只交通和灰鲸fGC浓度响应之间的时间差，这可能代表肠道通过时间。我们假设船舶交通和海洋噪声水平之间存在相关性，并预测船舶交通和海洋噪声水平将与灰鲸fGC浓度呈正相关。鉴于有关船舶交通和由此产生的海洋噪声对须鲸的生理影响的数据不足，本研究解决了一个关键的知识缺口，这可能为船舶交通和声学干扰政策(例如，船舶数量、速度、距离)提供信息，以减少对须鲸个体生理和种群动态的影响。

数据是在三个灰鲸觅食季节(2016-2018年5月至10月)沿美国俄勒冈州中部海岸收集的。我们分析了2016-2018年现场季节的411天船舶计数数据，以及2017-2018年季节共235天的1128小时声学记录。此外，共收集了67份灰鲸粪便样本，分别来自15只不同的成熟雄性灰鲸(n = 27)和14只成熟雌性灰鲸(n = 40)。1；附录S1:表S1;图S1)。14份粪便样本fGC浓度低于检测限(< LOD)， 4份黄体酮代谢物(fP)浓度低于检测限，10份雄激素代谢物(fA)浓度低于检测限，19份粪便样本无相应的身体面积指数(BAI;从无人机摄影测量中提取的身体状况的量度。因此，这些样本在各自变量的线性混合模型(LMM)分析中存在缺失值(NA)。总的来说，我们的样本量根据年份和性别有所不同(男性:2016年4人，2017年7人，2018年16人;女性:2016年9名，2017年9名，2018年22名)。如果只考虑可检测到fGC浓度的样本，样本量在2016年减少为0个，2017年减少为5个，2018年减少为13个，2016年减少为6个，2017年减少为9个，2018年减少为20个(N = 53)。

对67份粪便样本中29头灰鲸的照片识别和目击历史分析表明，在采样前，这些灰鲸在研究区域的平均居住天数为32.96天(SD = 39.57, min = 0, max = 120)。尽管存在较大的SD值，并且在样本收集日(min = 0天)之前，在我们的研究系统中没有观察到其中20只鲸鱼，但对整个采样年在我们的研究区域观察到这些样本鲸鱼的总天数的评估也表明驻留时间较高(平均值= 59.07,SD = 42.51, min = 1, max = 125)。需要强调的是:(1)鲸鱼可能在我们团队首次记录之前就已经在研究区域了，(2)鲸鱼可能在我们一年内第一次观察到它之后离开了研究区域，然后又回来了。总的来说，这些观测结果表明，在研究区域内采样的鲸鱼驻留时间较长，因此可能暴露在本研究评估的噪音、风和船只数据中。

研究区内两个港口(新港及大屿湾)的每日船只计数变化很大，由0至521艘不等，其中七月(平均为135艘)及八月(平均为133艘)的平均船只计数较高。水下噪声水平与船舶数量呈正相关(2017年:变化率= 0.020,F_1114年= 43.72, r²= 0.271,p< 0.001;2018年:变化率= 0.016,F_1112年= 54.92, r²= 0.323,p< 0.001;无花果。2A).大多数鲸鱼在水听器10公里内采样(44.62% < 5公里;5 - 10公里之间15.38%;40% > 10公里)，表明可能接触到记录在案的船舶交通噪音。

日平均风速也波动，从0.7米/秒到13.5米/秒不等，较高的平均风速出现在7月(5.95米/秒)和8月(5.90米/秒)。2017年没有观察到风速和噪声水平之间的相关性(变化率= 0.146,F_1114年= 1.201, r²= 0.002,p= 0.275)或2018年(变化率=−0.012,F₈₁= 0.006, r²=−0.012，p= 0.937;无花果。2B).对研究期间环境声级变化的时间模式的视觉评估(图1)。3.)显示在大多数日子的早上六时至八时之间出现强烈而尖锐的水下噪音峰值，这与驶离港口前往渔场的康乐及体育捕鱼租船的交通高峰期相吻合。中午的噪音峰值较低，这可能代表相当数量的半天捕鱼租船在同一时间返回港口。白天没有其他类似的噪音峰值可能与渔船返航时间的变化有关，这是根据捕鱼成功(例如，捕获量限制)或不断上升的天气条件以及从渔场返航的距离和船只速度的不同而定的。该研究系统中的风速通常在上午10点以后开始上升，下午3点到4点之间达到峰值，这与记录的环境噪声水平不一致，进一步证据表明噪声水平主要由船舶活动决定。在午夜至凌晨5时之间，声压级也会稳步下降至最低值，因为船只交通量和风速也会达到每日最低值。

LMM分析认为模型2是基于最低AIC的最佳模型。模型2包括前一天的血管计数、性别、月、年、BAI、fP和fA浓度(表2)1，模型2;AIC = 58.55, df = 14, R²m = 0.64, R²c = 0.64)，与前一天的船舶计数(F_1、17= 14.88, p = 0.001;无花果。4A)和月(F)_1、17= 4.12, p = 0.016)均显著2)．一旦确定了对fGC影响最大的血管计数时间尺度(例如，在样本收集的前一天)，使用固定效应的不同组合运行17个额外的LMMs(表1， A-Q)，但模型2仍表现出最低的AIC。在模型中，8月和9月与6月有显著差异(表2)．尽管fGC浓度与前一天的血管计数(按月划分)之间存在线性回归，但没有发现显著相关性(p > 0.05)。4B)表明fGC在8月和9月比6月更低。我们的术后分析显示血管计数无显著差异(方差分析:F₍₅₆₎= 1.701, p = 0.163;无花果。5A)和环境噪声水平的显著差异(方差分析:F₍₄₃₎= 14.32, p < 0.001;无花果。5B)收集粪便样本的前一天，按月划分。然而，粪便样本采集前一天的船只数量和环境噪音水平均呈现相同趋势，在8月和9月上升，在10月下降。

这项研究表明，血管活动的增加是灰鲸应激生理的一个贡献因素。这一发现意义重大，因为人类在全球海洋中的活动越来越多，在考虑减轻对须鲸数量的影响时，环境管理者应将其纳入决策。尽管这种对船舶交通的生理反应的驱动因素尚不确定，但我们假设船舶交通增加所引起的海洋噪声升高可能是fGC浓度升高的一个原因。这一假设是基于附近港口的船只数量与可变的环境噪声水平之间的强正相关(图1)。2A)，以及fGC浓度与血管计数增加之间的关系(LMM;表格2)。我们对鲸鱼压力、船只数量和环境噪声之间的关系进行了不同时间尺度的评估，并考虑了潜在影响环境声音水平(即风)和鲸鱼fGC浓度的混杂因素(即作为营养状态、年份、性别、年龄和生殖激素浓度指标的身体状况)。在我们的近岸研究区域，与水下声音水平(50 - 1000hz)相关的是船舶交通量，而不是风速，这与之前的研究一致，表明船舶交通是有大量渔业、娱乐和旅游活动的浅海沿海地区海洋噪音的主要贡献者^{51，52，53，54}．我们发现鲸类动物对船只交通增加的生理反应与天气海洋噪音水平相关，这是纳入干扰的种群后果(PCoD)的重要信息。²⁷多重压力源(PCoMS)的人口后果²⁸估计干扰事件对种群动态影响的框架。

我们的工作强调了将哺乳动物“应激反应”的内部驱动因素(即BAI、生殖激素)与外部驱动因素(即血管计数、年)信息结合起来的效用，因为所有这些变量都影响对急性应激源的生理反应。鉴于灰鲸体内fGC与BAI之间存在显著相关性⁴²在美国，将这一营养指数纳入我们的压力反应评估尤为重要。通过将多个可能影响动物生理的因素合并到一个单一的分析中，粪便激素数据无法解释的变化可以更好地解决，从而对影响野外环境应激反应的主要因素提供更清晰的理解。尽管仍有许多关于驱动因素、时间和变化的须鲸激素浓度的影响的问题，但我们已经证明了这些方法的可行性，以及船只交通和灰鲸应激反应之间的相关性。

我们的分析发现按月fGC应答有统计学意义的差异(模型2;表格2)．灰鲸体内的fGC反应在8月和9月明显低于6月(图1)。4B)，这可能与鲸鱼营养状况的改善和/或在觅食季节的后几个月的猎物可用性有关。这一假设得到了先前研究的支持，这些研究确定了灰鲸在觅食季节的最后几个月身体状况的改善⁵⁵身体状况与fGC之间存在相关性⁴²．10月观察到的fGC反应增加(图4B)可能与营养以外的因素有关，如生殖周期，但需要更多的数据收集来检验这些理论。

我们评估了8个不同时间尺度(干扰和粪便收集之间)的血管计数对灰鲸fGC浓度的影响，并确定样本收集前一天的血管计数最好地解释了fGC数据。因此，我们假设灰鲸体内应激激素的肠道传递时间可能发生在干扰事件发生后的~ 24小时内。我们认识到鲸鱼可能在收集粪便样本前的24小时内移动了位置，但这些鲸鱼没有被标记，所以我们无法量化在收集样本前的几天内遇到的船只的确切数量或单个鲸鱼的相关声音暴露水平。然而，我们的非侵入性照片识别分析表明，大多数鲸鱼在研究区域驻留时间很长，因此可能暴露在船舶交通和测量噪声或研究区域遇到的非常相似的水平。我们在总结和评估整个研究区域内每天的船只交通和可能的相关噪音水平时，假设研究区域内的所有鲸鱼每天都要忍受同一艘船只和同一种噪音水平，而不管其位置如何。然而，在研究区域内未被解释的鲸鱼运动可能会掩盖当地船只数量和交通变化之间的更精细的关系，以及后来鲸鱼排泄的gc，潜在地减少了较长时间滞后的相关性。然而，我们的研究结果与之前的研究一致，表明大型哺乳动物的肠道运输时间一般在12小时到4天之间，在大型食肉动物中有大约24小时的延迟^31，41，44．

目前还不清楚船只交通及其相关噪音对鲸鱼生理的影响，该研究中未考虑的其他因素可能会影响灰鲸的GC浓度，如污染物⁵⁶，捕食事件⁵⁷，以及感染⁵⁸．船只交通可以通过多种途径影响鲸鱼的生理机能，包括行为障碍和与船只碰撞风险增加导致的代谢率改变^21，29例如，提高能量消耗以发出更大的叫声，或者由于遮蔽效应而错过了来自同类和捕食者的声音信号，或者这些和其他可能性的组合。这群灰鲸确实有螺旋桨撞击的迹象⁴¹在我们的研究区域内，由于有记录的船只交通行为障碍，它也受到了鲸鱼观察活动的影响¹⁵．因此，将船舶交通的影响从其他影响中分离出来需要进一步的评估和更大的样本量，并同时分析其他混杂变量。

除了一个大型和活跃的体育钓鱼社区，纽波特和德普湾港口也支持许多大型商业渔船和大约5个鲸鱼观察作业。在夏季的几个月里，美国陆军工程兵团的一艘大型船只也会在纽波特海峡进行疏浚，该港口是美国国家海洋和大气管理局太平洋舰队的大型研究船的所在地。不幸的是，俄勒冈州鱼类和野生动物部门的船只计数数据中没有这些船只活动，该部门关注的是这些港口的体育捕鱼活动。这种未统计的船只交通可能部分解释了船只数量和每日环境声音水平之间趋势线周围数据点的变化(图1)。2)，以及线性模型中不可解释的方差。

人为干扰，包括船舶交通，会给海洋哺乳动物带来压力^30.，31，通常与整体健康状况的恶化有关^55，59，60免疫系统受到抑制，死亡率增加⁶¹．尽管我们的样本量很小，但我们在个体水平和短时间内(约24小时)证明了血管计数和鲸鱼应激相关激素浓度之间的相关性。此外，我们还提供了初步证据，证明来自船只交通的海洋噪声与灰鲸体内fGC之间的潜在联系。我们的灰鲸案例研究结果可以告诉其他不易接近的须鲸种群对干扰的生理反应。然而，需要注意的是，我们的结果是初步的，并不是完全结论性的。需要更大的样本量来确认和进一步揭示模式。未来的工作应该建立在这些记录的船只交通和长须鲸压力反应之间的联系之上，以评估对个体生命率和随后的种群动态的影响。此外，未来的研究应直接探讨长须鲸的压力反应与海洋噪声之间的潜在相关性。通过持续评估船只干扰和由此产生的海洋噪音对须鲸的生理影响，环境管理人员可以制定有效的监管措施，如确定船只数量、速度和距离的阈值，以降低鲸鱼栖息地附近的声音水平，减轻对脆弱和受保护鲸鱼种群的影响。

灰鲸数据

所有的方法都是按照相关的指导方针和规定进行的。该项目获得了俄勒冈州立大学动物保护和使用委员会(IACUC-2019-0008)的批准，并符合reach指南。所有的灰鲸数据收集都是在NOAA/NMFS(#16011和#21678，发给John Calambokidis)的研究许可下进行的。

我们使用一艘小型研究船(5.4米硬壳充气船)在三个觅食季节(2016年至2018年5月至10月)沿美国俄勒冈州中部海岸收集灰鲸数据，包括纽波特港和德波湾港口附近(图1)。1)．灰鲸视觉调查没有遵循一个标准化的横断面线，而是优先最大化鲸鱼遭遇来收集基于个体的数据。当天气条件和鲸鱼行为适宜时，拍摄鲸鱼照片用于个体照片识别，并记录基于无人机的视频用于摄影测量分析(方法在⁶²)．我们还利用两个300 μ m尼龙网兜在鲸鱼目击处收集粪便样本(方法在⁴¹)．将样品转移到无菌塑料瓶中，放置在冰上，直到在冰箱(−20°C)中存储，以备后续分析。每个粪便样本都记录了日期、时间和地点，以及特定个体的匹配照片。

我们使用Adobe Bridge软件(版本8.0.1.282)进行照片识别分析。将照片与俄勒冈州立大学海洋哺乳动物研究所和卡斯卡迪亚研究集体(奥林匹亚，WA, USA)保存的长期灰鲸目录进行比较，以获得个体性别和基于第一次目击日期的最小年龄信息。如果性别未知，则通过粪便基因分析来确定性别(方法在⁵⁵)．鉴于我们的研究鲸在收集粪便样本之前的未知运动，我们评估了这些鲸鱼在研究区域内的驻留时间(以天为单位)，以证明我们的假设是正确的，即鲸鱼暴露在测量的声景观水平和血管数量中。通过照片识别对比，我们总结出该年样本采集前鲸鱼在研究区域的天数(1)和该年的总天数(2)。

使用VLC软件(2.2.8版本)从无人机视频记录中提取鲸鱼平面和直线的图像，并根据预定义的属性对质量进行好或差的评分⁵⁵．只有得分良好的图像在定制的MATLAB(版本9.3.0.7，版本2017b)软件中测量，产生了一系列十个描述鲸鱼身体状况的形态属性。这些指标是在R(版本3.5.0)中评估的⁶³)来计算一个最终的度量标准，称为身体面积指数(Body Area Index, BAI)，这是一个无单位的、长度标准化的身体状况度量标准，允许在不同长度和人口统计单位(例如，犊牛和成年人，或男性和女性)的个体之间进行比较⁵⁵)．我们对鲸鱼长度和BAI测量都应用了5%的方差系数阈值，以提高精度。鲸鱼被分配到一个人口统计单位基于性别和成熟状态，每年⁵⁵根据实地观察、照片鉴定和摄影测量结果。BAI指标已成功地用于记录这一特定灰鲸种群在觅食季节的身体状况变化⁵⁵．

粪便样本经过过滤、脱盐和冷冻干燥⁴¹．将干燥、加工过的样品混合，称重至接近0.2 g;0.02 g以下的样品被排除在分析之外，以避免过高的值[“小样本效应”;看到^33，43］．提取粪便激素代谢物⁴¹使用Enzo生命科学公司的商用酶联免疫吸附检测试剂盒对皮质醇(#ADI-900-071)、孕酮(#ADI-900-011)和睾酮(#ADI-900-065)进行量化，遵循制造商的协议(https://www.enzolifesciences.com)．因为粪便样本反映的是母体激素的代谢产物，皮质醇试剂盒定量fGC，孕酮试剂盒定量孕酮代谢物(fP)，睾酮试剂盒定量雄激素代谢物(fA)。

样本在2016-2017年运行了两份，在2018年运行了三份。所有样本在收集后11个月内进行分析。我们的质量保证和质量控制协议包括在每个分析中完整的标准曲线，重复之间重复运行变异系数为15% (CV)的任何样品，并重新运行15-85%百分比范围之外的任何样品。不符合这些标准的样品被再次分析，直到得到合适的值。< LOD的值被排除在分析之外⁶⁴．当在同一天从同一个人身上收集多个粪便样本时，我们应用质量较高的样本的值^30.．灰鲸粪便激素测定已被验证为本研究中描述的所有激素，结果显示出良好的并行性和准确性，以及与已知生理状态(年龄、性别、生殖状态)的良好匹配。⁴¹．

船舶交通数据

通过对俄勒冈州鱼类和野生动物部(ODFW)在港口的视频分析，我们获得了三个野外季节中纽波特和德波湾港口的每日独特船只计数。每日船只统计只包括娱乐船只，包括钓鱼和捕蟹旅行的商业租船，以及私人船只(例如，私人钓鱼旅行、皮划艇、划艇和水上摩托艇)。因此，用于其他目的的船只活动(例如，观察鲸鱼、研究、葬礼、维修旅行、商业捕鱼、海岸警卫队和疏浚)没有被这些统计跟踪，因此，不在本分析中考虑。然而，在本研究期间，我们的研究区域没有发生重大的地震、声纳或海洋工程，沿海地区的休闲船舶交通已被发现与环境噪声水平有很强的相关性^9，54．

声数据

在收集灰鲸数据的同时，2017年6月15日至10月8日和2018年6月5日至10月1日，在俄勒冈州新港海岸记录了声学数据(2016年没有声学数据)。被动声学监测(PAM)水听器系统部署在北纬44.5932°、西经124.1029°、水深20米、距海岸线1.25公里的纽波特港口入口外(图。1)．定制的PAM系统由一个全向水听器(国际传感器公司型号ITC1032)组成，灵敏度为−192 dB re μPa V⁻¹@ 1米结合低功率16位数据采集系统和前置放大器安置在玻璃纤维复合压力外壳⁶⁵．PAM系统安装在一个重量的、半拖网保护的铝框架上，距离海底0.5米，没有海面表达。数据在20%占空比下以32 kHz采样率记录(每小时12分钟)。为了避免Nyquist频率附近的混叠，采用了一个低频截止，从而得到了包括高达13 kHz的能量在内的声学测量结果。数据分析遵循前面描述的方法⁶⁵．声压级均方根(SPL)_rms)从50到1000 Hz频段计算。这个频率范围捕捉到使用新港和底坡湾港口的商业和娱乐船只发出的低于1000赫兹的低频船舶噪音⁶⁶，与风有关的声能降低到400赫兹⁶⁷同时避免地面风产生的随风速和频率达到10000赫兹的噪音⁶⁸．这一范围也与灰鲸的声灵敏度有关，并与在东北太平洋观察到的两种最频繁的呼叫类型(称为“M1和M3呼叫”)重叠。^69，70，71．虽然没有灰鲸的音频图，但由于它们在这个范围内发出叫声，它们很可能能够听到，或对它们发出的叫声的频率有听觉敏感性。

日SPL中位数_rms(50 - 1000hz)由早上6时至晚上7时计算。太平洋夏令时提供了50的测量方法^th在每天最繁忙的白天，海港入口的船只活动与百分率或典型的声音水平有关。

风速数据

风产生的表面噪声也有助于海洋声景⁶⁸．因此，我们在研究期间汇编了当地风速数据，以评估和比较风和船舶交通对记录的水下环境噪声水平的贡献。位于纽波特港南滩码头入口水听器附近的风速计站的每小时风速数据(站NWPO3，纽波特，OR，−44.613 N, 124.067 W;无花果。1)的数据从NOAA国家数据浮标中心(NDBC)获得。时间转换为当地太平洋夏令时。计算从早上6点到晚上7点的小时中值风速(m/s)和每日中值风速值(m/s)，以匹配部署的水听器测量的噪声水平。

数据分析

我们的目标是评估灰鲸fGC浓度是否以及如何随血管数量而变化，同时考虑月、年、人口单位、其他激素代谢物和身体状况(BAI)的影响。因此，每个粪便样本都与该个体在收集粪便样本的同一天或±14天内的BAI测量值相匹配(在此窗口内没有检测到身体状况的变化;使用2016年、2017年和2018年14天内评估的所有个体的BAI值的配对t检验:n = 61，p= 0.86, df = 60, t =−0.174)。

本分析只包括成熟男性和未怀孕、未哺乳期的成熟女性，以最大限度地减少由于生活史阶段而导致的fGC浓度正常变化的已知影响^33，41，72．根据13个月的妊娠期，我们假设与幼崽密切接触的成年雌鲸是哺乳期雌鲸，并在前一年怀孕⁷³．

所有统计分析均在R软件中进行⁶³显著性水平为0.05。在进一步分析之前，使用Shapiro-Wilk正态检验检验所有变量的正态性，并对非正态变量进行对数变换(对数正态[value + 1])。

线性回归使用lm函数检验(1)两个港口的船舶日计数数据与海洋噪声(日声压级中值)之间的相关性_rms)和(2)2017年和2018年的海洋噪声和日平均风速。为了进一步探索水下声级的时间模式以及与当地风型的潜在相关性，在MATLAB(版本9.7.0.1190202-R2019b)中绘制了2017年和2018年纽波特水听器记录的每天每小时的中值噪声水平(50-1000 Hz)和同一时间段的小时中值风速(图1)。3.)．

线性混合模型(LMM)采用lme4R装⁷⁴，以评估血管计数、月、年、性别、BAI和其他激素代谢物对fGC浓度的影响。新港和底波湾两港相距22公里，是灰鲸每日的活动范围(莱莫斯，伙计们。奥林匹克广播服务公司。；根据现场观察和光识别分析)。由于纽波特和德普湾的每日船只数量呈正相关(变化率= 3.176,F_1233年= 520.6, r²= 0.689,p< 0.001)时，我们假设来自两个端口的血管活动影响研究区域内的声学条件。因此，我们将这两个港口的船只计数与fGC浓度进行了比较分析。

由于肠道运输时间的不确定性(在密菌中无法通过实验确定)⁴⁴)，在LMMs中评估血管计数和粪便收集之间的不同时间差，包括粪便样本收集当天的血管计数之和，以及之前1-7天的血管计数之和(基于大型哺乳动物的已知肠道运输时间~ 12小时至4天)^43，75，76)．一个附加的空模型(模型0;表格1)，其中不包括船只计数，以验证船只交通对灰鲸fGC浓度的影响。所有模型都将鲸鱼识别作为随机效应来解释伪复制。模型的选择基于最低赤池信息准则(AIC)⁷⁷)．需要强调的是，大多数模型(即1-4、7-8、b-j、l-m、o和q)显示出单一的拟合消息，这可能表明模型过拟合。尽管将模型局限于一个随机效应(即鲸鱼ID)，并减少了模型中包含的随机效应的数量，但奇异拟合仍然存在。因为这个警告消息也可能与一个或多个效应组合的方差接近于零有关⁷⁸，我们认为奇异拟合是由于样本量较低，同时将许多相关的固定和随机效应的数据进行了分割。因此，排除相关变量不一定能解决问题;因此，我们基于AIC、简约性和包含与解释fGC变化相关的变量来选择模型(表1)．在确定对血管计数最具影响的时间尺度后，使用固定效应的不同组合运行附加的LMMs。通过评估边际R来评价模型拟合²(右²m:由固定效应解释的方差)和条件R²(右²C:由固定效应和随机效应解释的方差)使用MuMInR装^79，80．统计量和p的值lmerTest包⁸¹．为了评估粪便样本采集前一天的血管数量和环境噪声水平之间的关系，我们在这些变量和月份之间进行了额外的anova分析。对于这些事后分析，他的样本量较小，仅基于2017年和2018年的数据，因为2016年没有水听器数据。

运行LMMs、线性回归和anova的代码和相关数据存储在FigShare数字库中:https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21171886⁸²．