水通道蛋白基因治疗lamp3相关性唾液腺功能减退

NKCC1和AQP5表达降低与SjD患者唾液腺功能减退有关

我们之前的研究表明，在过表达lamp3的小鼠中，NKCC1和AQP5表达的降低与唾液腺功能减退有关⁶．为了检验同样的结果是否适用于SjD患者，我们从11个有sicca症状的个体中获得了唇小唾液腺活检(图2)。1A及补充表1)．免疫荧光染色显示SjD患者SFR降低的腺体中NKCC1和AQP5表达水平显著降低(n= 5)，与SFR正常的对照组相比(n= 6)(图1B).这些结果表明，NKCC1和AQP5表达降低与SjD患者的唾液腺功能减退有关。

LAMP3通过体外溶酶体途径促进NKCC1和AQP5的降解

细胞膜蛋白如NKCC1和AQP5一般通过内溶酶体途径降解¹³．我们之前对过表达lamp3的小鼠唾液腺转录组的分析显示，在Slc12a2(编码NKCC1)和Aqp5mRNA表达，尽管NKCC1和AQP5蛋白水平较低，以及核内体和溶酶体相关基因表达增加⁶．这一转录组分析产生了一个假设，即LAMP3可以通过激活内溶酶体途径在转录后水平促进NKCC1和AQP5的降解。在目前的研究中，我们进一步在体外测试了这一假设。

通过Western blotting分析，LAMP3在人唾液腺(HSG)细胞中的过表达降低了NKCC1和AQP5蛋白水平。2A)尽管增加了SLC12A2而且AQP5mRNA水平(图;2此外，我们发现过表达lamp3的HSG细胞经环六甲酰胺(一种蛋白质合成抑制剂)处理后，与空质粒转染细胞相比，NKCC1和AQP5的表达显著降低(图2)。2C).体外过表达LAMP3增加了NKCC1和AQP5的降解，这与我们之前在过表达LAMP3小鼠中的发现一致⁶．

为了研究LAMP3过表达是否会刺激内溶酶体通路，将过表达LAMP3的HSG细胞与Alexa Fluor 647偶联的BSA和DQ-BSA(蛋白酶的荧光底物)孵育，并通过流式细胞术定量信号，并使用荧光显微镜观察。LAMP3过表达显著增加了通过胞吞作用进入细胞的Alexa Fluor 647信号摄取强度，以及DQ-BSA信号在内溶酶体降解时的脱淬强度(图。3.)．这些结果表明，LAMP3过表达促进细胞内吞作用和内溶酶体降解。

为了进一步研究LAMP3诱导的膜蛋白内溶酶体降解的增加，我们对过表达LAMP3的HSG细胞进行了早期内溶体抗原1 (EEA1)、NKCC1和LAMP3的联合染色。免疫细胞化学分析显示，LAMP3过表达刺激EEA1蛋白的积累(图。4A,B)， EEA1和NKCC1共定位(图。4A,C)，提示LAMP3促进NKCC1蛋白的内吞作用。用氯喹(CQ)治疗-一种内溶酶体途径的抑制剂-减少了EEA1的积累(图。4A,B)和EEA1/NKCC1共定位(图。4A,C)，导致NKCC1表达增加(图。4A, D)。Western blotting分析显示，LAMP3过表达降低了这些细胞中NKCC1和AQP5蛋白的表达，而CQ处理则逆转了这一情况(图2)。4E).这些结果表明LAMP3过表达通过激活内溶酶体途径促进NKCC1和AQP5的降解。

LAMP3在体内促进NKCC1和AQP5的内溶酶体降解

为了研究LAMP3在体内和体外是否通过内溶酶体途径降低NKCC1和AQP5的表达，我们每周腹腔注射羟氯喹(HCQ的衍生物)治疗过表达LAMP3的小鼠。唾液腺组织免疫荧光分析显示，HCQ处理显著提高了过表达lamp3小鼠唾液腺中NKCC1和AQP5的表达(图2)。5a - c)。在过表达lamp3的小鼠中，HCQ处理还诱导毛罗果素刺激的SFR显著增加(图2)。5D)，与恢复的NKCC1和AQP5表达一致。综上所述，体内实验结果提示LAMP3过表达通过促进NKCC1和AQP5的内溶酶体降解导致唾液腺功能减退。

LAMP3通过激活内吞作用增加aav2诱导的基因转导

考虑到LAMP3过表达导致唾液腺功能减退的发病机制，替代NKCC1和AQP5表达下降是恢复SjD患者唾液腺功能的一种有前景的方法。基因治疗是一种将遗传物质转移到细胞中以取代功能蛋白质缺失的技术¹⁴．AAV是一种具有线性单链DNA基因组的小型非包膜病毒，由于其可用性和将基因转移到各种细胞类型的能力，是研究最活跃的基因治疗载体之一¹⁵．AAV转导依赖于适当的细胞内运输，通过内溶酶体途径到达细胞核并表达编码的基因¹⁶．由于我们观察到LAMP3激活了内溶酶体蛋白降解，我们研究了LAMP3在AAV转导中的作用。

比较过表达lamp3与对照HSG细胞AAV转导效率。与AAV2-GFP颗粒孵育后，过表达lamp3的细胞培养物中gfp阳性细胞的数量显著高于对照细胞培养物(图2)。6A)，提示LAMP3增强AAV转导。

为了更好地理解AAV转导与LAMP3相关的机制，我们对AAV转导过程中的初始步骤进行了研究。虽然LAMP3过表达不影响AAV2-GFP颗粒与细胞膜的结合(图。6B)，它确实显著增加病毒载体的内化(图。6C).这些结果表明LAMP3可以通过增强内化来辅助AAV转导。

为了阐明lamp3增强AAV内化的分子细节，我们评估了过表达lamp3的细胞内吞相关蛋白的表达。Western blotting分析显示，LAMP3过表达显著增加了caveolin-1的表达，但没有增加网格蛋白的表达(图2)。6D)。与结合试验的结果一致，LAMP3过表达不会改变诵读困难相关蛋白kiaa0319样蛋白(KIAA0319L，也称为AAV受体)的表达，该蛋白与AAV2结合相关(图。6D)。

AAV2-AQP1基因治疗可恢复过表达lamp3小鼠的唾液流量

上述数据表明，通过AAV载体进行基因治疗可能是一种恢复腺体功能的方法。鉴于LAMP3可能通过下调与唾液分泌有关的多种蛋白质来诱导唾液腺功能减退，这似乎是创建一种新的途径来启动唾液腺中的液体运动的最佳方法。最近的临床和临床前研究表明AQP1基因治疗可以为放射引起的唾液腺功能减退患者创造新的液体运动途径¹⁷．

为了测试aav介导的基因治疗是否对治疗lamp3相关的唾液腺功能减退有效，我们在过表达lamp3的小鼠中研究了AAV2-AQP1基因治疗的效果，这些小鼠出现sjd样表型，进行性唾液腺功能减退，抗ro /SSA抗体产生，淋巴细胞浸润⁶．AAV2-LAMP3逆行导管灌注7个月后，AAV2-AQP1或对照AAV2-GFP也通过逆行插管传递到C57BL/6小鼠的颌下腺(图。7一个)。

与对照治疗(AAV2-GFP)相比，AAV2-AQP1治疗显著恢复毛罗果素刺激的SFR，这在1个月后可见，并持续至少3个月(图2- aqp1)。7B)。与对照组相比，AAV2-AQP1处理诱导AAV2-AQP1处理小鼠腺状AQP1蛋白表达，但不影响NKCC1和AQP5的表达(图2-AQP1)。7C, D)。AQP1的表达主要集中在唾液腺上皮细胞(图。7C)，与AAV2向性一致^18，19．与对照治疗(AAV2-GFP)和基线相比，AAV2-AQP1治疗没有显著改变血清抗ro /SSA抗体水平，也没有改变腺体中淋巴细胞浸润区域的大小(图。7E、F)。这些结果如图所示。8．

在本研究中，我们发现LAMP3过表达激活唾液腺上皮细胞的内溶酶体通路是一种新的作用机制。此外，我们证实LAMP3通过促进NKCC1和AQP5的内溶酶体降解，在SjD相关的唾液腺功能减退的发展中发挥重要的病理生理作用。这些发现导致了一种假设，即我们需要引入一种新的机制来启动腺体腔内的液体运动，以恢复lamp3相关的唾液腺功能减退。在本研究中，我们通过将水通道AQP1引入唾液腺上皮细胞来验证这一假设。有趣的是，LAMP3过表达通过促进的内溶酶体途径增加了AAV感染及其基因转导效率。我们的研究结果表明，在aav介导后，有可能增加该模型中的流体运动AQP1基因转移。

虽然SjD被认为是一种全身性疾病，但患者的主要抱怨是严重的sicca症状(表明分泌功能丧失)以及这些症状对日常生活的许多方面的影响²．为了满足患者的需求，针对特定局部特征的治疗已经被研究。可溶性CTLA4IgG融合蛋白和白介素-17通路调节剂等分子基因传递到SjD小鼠模型的唾液腺已显示出前景^{20.，21，22}．基因治疗到唾液腺的一个优点是，通过基因转移的局部免疫调节剂的传递导致更高的局部浓度和可比的治疗效果，同时最大限度地减少与系统传递相同药物分子相关的副作用。

在过去的10年里，基因治疗领域从概念发展到临床阶段和药物批准。例如，在一期临床试验中，腺病毒介导AQP1基因转移成功地恢复了接受电离放疗治疗头颈部癌症的慢性口干症患者的唾液腺功能¹⁷．在这项试验中，将腺病毒载体注射到腮腺中，但尚不清楚这是否是基因转移到唾液腺的最佳载体。另一项使用aav2介导的临床试验AQP1目前正在对同一患者群体的唾液腺进行转移(NCT02446249)。其结果有望提供更多关于AAV2载体剂量的信息，并可能支持该治疗在SjD中的应用。

AQPs是一种新的药物靶点，因为除SjD外，其功能障碍还涉及许多病理，如肿瘤、缺血性疾病和创伤性损伤²³．例如，AQP4在血脑屏障和血脊髓屏障中的表达与中风或脊髓损伤后的脑或脊髓水肿有关^24，25．然而，目前还没有aqp靶向药物被批准用于临床²⁶．目前的研究表明aav2介导的基因转移是一种靶向AQP功能的替代方法。先前的研究表明，影响转导途径关键步骤的疾病过程可以阻断AAV转导¹⁵．但是，SjD患者唾液腺中的LAMP3错表达可能有利于AAV2介导的基因转移，因为我们发现LAMP3通过激活内溶酶体途径增强AAV2的转导。

骨形态发生蛋白6 (Bone morphogenetic protein 6, BMP6)是SjD患者唾液腺中另一种上调的蛋白，与病理生理有关²⁷．此前，我们报道了涎腺上皮LAMP3表达通过细胞外释放HSP70和激活toll样受体4刺激单核细胞产生BMP6²⁸．BMP6减少AQP5转录水平的表达^27，28，29．当将这些数据与我们发现的LAMP3介导的AQP5转录后降解结合起来时，我们可以认为LAMP3和BMP6在转录和转录后水平共同下调AQP5的表达，导致唾液腺功能减退。在bmp6过表达小鼠中，aav2介导的AQP1表达也能恢复SFR^30.．

病毒感染及随后的免疫反应，特别是干扰素的诱导，与SjD自身免疫的发展密切相关^31，32．因此，使用病毒载体的基因治疗可能会造成SjD自身免疫恶化的潜在风险。AAV是一种非致病性病毒，在人体中引起非常轻微的免疫反应³³．与基线相比，我们观察到AAV2-AQP1治疗后SjD小鼠模型中抗Ro/SSA的血清自身抗体或腺淋巴细胞浸润没有显著增加。

总之，我们发现SjD患者唾液腺功能低下与唾液腺上皮细胞中NKCC1和AQP5表达减少有关，其中LAMP3的表达激活了内溶酶体途径并促进了这些蛋白质的降解。此外，我们发现LAMP3激活的内溶酶体途径增加了AAV转导，并证明AAV2-AQP1基因治疗改善了SjD小鼠模型中LAMP3相关的唾液腺功能减退。我们的研究结果表明，AAV2-AQP1基因治疗可能有助于SjD患者唾液腺功能减退的管理。

病人

研究参与者是在日本札幌的北海道大学医院招募的。根据《赫尔辛基宣言》原则采集唇小唾液腺、唾液和血清等临床样本。所有方案均由北海道大学医院伦理委员会批准(批准号:014-0466)。获得所有参与者的知情同意。参与者的临床情况汇总在补充表中1．

动物

用编码lamp3基因的AAV2载体生成过表达小鼠LAMP3(AAV2-LAMP3)使用逆行插管6 - 8周龄雌性C57BL/6小鼠的双颌下腺(Charles River Laboratories, USA)，如前所述⁶．对照组改用含有绿色荧光蛋白基因(AAV2- gfp)的AAV2载体。如前所述，lamp3过表达小鼠每周腹腔注射60 mg/kg体重的羟氯喹(HCQ, Plaquenil®片剂，PBS, Sanofi, USA)，持续4个月³⁴．另一组过表达lamp3的小鼠接受AAV2载体编码的基因AQP1(AAV2-AQP1)或AAV2-GFP (10¹¹颗粒/小鼠在100 μl)通过逆行插管双下颌下腺，如前所述^30.．治疗组被盲目分配到每一笼小鼠，但没有进行随机分配。对所有小鼠进行分析，没有任何纳入和排除标准。结果由盲法研究人员进行评估。本研究未对混杂因素进行控制。

如前所述，在插管后的几个时间点测定了20分钟内匹罗笛酚刺激的SFR⁶．在研究结束时，收集血清和整个颌下腺。根据制造商说明书，使用固相ELISA (#5710, Alpha Diagnostic International)检测血清抗ro /SSA抗体的存在。

所有涉及活体动物的程序都是按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的机构准则和标准操作程序进行的。所有的方案都得到了国家牙科和颅面研究所兽医资源核心伦理委员会的批准(批准号:18-863)。所有方法均按照reach指南进行报告(https://arriveguidelines.org)，以汇报动物实验。

Immunofluorescent染色

福尔马林固定，石蜡包埋的唾液腺切片安装在玻片上，脱蜡，再水化，并进行柠檬酸微波抗原提取。用2% BSA (Sigma-Aldrich)在PBS中室温封闭玻片30分钟，4℃下用以下一种一抗孵育过夜:10 μg/mL兔抗nkcc1(人4828号，小鼠85,403号，Cell Signaling Technology，美国)、兔抗aqp5 (#AQP-005, Alomone labs，以色列)或兔抗aqp1 (#ab168387, Abcam，美国)。

取10 μg/mL Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594 AffiniPure驴抗兔IgG (H + L)(均来自Jackson Immuno Research)室温孵育1 H，然后用DAPI安装介质(Abcam)复染。

为了数据采集和分析，每个样品用荧光显微镜采集3至5张图像(尼康，日本)。蛋白表达水平通过对照兔IgG染色信号的减法测定(Jackson ImmunoResearch)，并使用ImageJ软件(公共领域来源:美国国立卫生研究院)通过DAPI强度归一化。

细胞

HSG细胞由Indu Ambudkar博士(国家牙科和颅面研究所)提供，在DMEM(美国赛默飞世尔科学公司)中培养，添加10% FBS，并在37°C和5% CO中培养₂．如前所述，瞬时转染编码lamp3的质粒，建立稳定过表达lamp3的HSG细胞⁵．

所有实验均使用30传代内的HSG细胞在70-80%汇合(加倍时间:24 h)。在实验前使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza, Switzerland)检查支原体污染。

免疫细胞化学

将HSG细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，用0.1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich)渗透10分钟，然后用2% BSA封闭30分钟，均在室温下进行。细胞在4℃下用10 μg/ml一抗培养过夜:Alexa Fluor 488直接标记的抗lamp3抗体(#12,632-1-AP, Proteintech)， Alexa Fluor 594直接标记的抗eea1抗体(#PA1-063A, Thermo Fisher Scientific)和Alexa Fluor 647直接标记的抗nkcc1抗体(#4828,Cell Signaling Technology)。抗体使用Lightning-Link快速标记试剂盒(Novus biicals, USA)进行标记。切片用DAPI安装介质(Abcam)反染色。所有图像均使用共聚焦荧光显微镜(Nikon, Japan)采集，并使用ImageJ软件进行分析。

定量实时逆转录PCR

使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN，美国)提取HSG细胞的总RNA，用RNase-Free DNase Set (QIAGEN)处理，并使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific)逆转录成cDNA。实时定量PCR反应采用TaqMan基因表达测定(赛默飞世尔科学公司)和以下TaqMan探针:SLC12A2(Hs00169032_m1),AQP5(Hs00387048_m1),ACTB(Hs01060665_g1)。基因表达相对ACTB采用ΔΔCt方法计算。在Quantstudio3 Real-Time PCR系统(Life Technologies, USA)上进行PCR循环，条件如下:50℃2 min, 95℃10 min, 95℃15 s, 60℃1 min，循环50次。

西方墨点法

将HSG细胞在RIPA裂解和提取缓冲液中裂解，并加入额外的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(均来自赛默飞世尔科学公司)，并在4°C下17,000 g离心25分钟清除。上清液在97°C下NuPAGE LDS样品缓冲液中加热10分钟，通过SDS-PAGE分离，然后电泳转移到聚偏二氟乙烯膜(赛默飞世尔科学公司)。用2%的脱脂奶粉在25℃下阻断细胞膜1小时，然后在4℃下用以下一种主要抗体之一培养过夜:抗nkcc1(#4828，细胞信号技术)，抗aqp5 (#AQP-005, Alomone实验室)，抗穴蛋白-1(#3267，细胞信号技术)，抗格网蛋白重链(#4796，细胞信号技术)，抗kiaa0319l /AAVR (#21,016-1-AP, Proteintech)，或抗α-微管蛋白(#T6199, Sigma-Aldrich)。清洗三次后，将膜与兔或小鼠IgG山根过氧化物酶链接全抗体(Sigma-Aldrich)在25℃下孵育1小时。使用Super Signal West Pico PLUS化学发光衬底(Thermo Fisher Scientific)观察信号。

流式细胞术

为了进行内吞和溶酶体降解实验，将HSG细胞与10 μg/mL Alexa Fluor 647偶联BSA (Thermo Fisher Scientific)和DQ-BSA (Thermo Fisher Scientific)在添加10%胎牛血清的DMEM中孵育，在37℃和5% CO下孵育₂4小时。

对于AAV2-GFP感染试验，将HSG细胞在含有AAV2-GFP颗粒的1ml培养基中以5万个感染倍数(MOI)培养1小时，48小时后用7-AAD (Biololegend, USA)染色。

使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences, USA)和FlowJo软件(BD Biosciences)检测信号。

AAV2-GFP结合和内化检测

对于AAV2-GFP结合实验，HSG细胞在4℃预孵育1 h，与AAV2-GFP颗粒(MOI: 50,000)在4℃孵育1 h，在冰冷的DMEM中洗涤一次，在冰冷的PBS中洗涤两次，然后用刮刀收集。

为了进行AAV2-GFP内化试验，将HSG细胞与AAV2-GFP颗粒(MOI: 50,000)一起在预热的DMEM中37°C孵育1小时，在冰上胰酶化收集15分钟³⁵37℃胰蛋白酶化5 min，清除膜表面病毒，然后用DMEM冰水清洗1次，PBS冰水清洗2次。

根据制造商的说明，使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)从收集的细胞中分离DNA。使用以下引物和探针来检测每1 μg DNA的拷贝数，这些引物用于扩增CMV启动子区域的一部分:正向引物，5 ' - CAT CTA CGT ATT AGT CAT CGC TAT TAC CAT -3 ';反向引物，5 ' - TGG AAA TCC CCG TGA GTC A -3 ';探针，5 ' -/56-FAM/ACA TCA ATG GGC GTG GAT AGC GGT /36-TAMSp/ -3 '(均来自美国Integrated DNA Technologies, Inc.)。条件如下:50℃2 min, 95℃10 min, 95℃循环50次，每次15 s, 60℃1 min。

统计分析

数据以均数±标准差(SD)或均数的标准误差(SEM)表示。定量变量比较使用双尾学生t-test和Pearson相关系数。在适当的时候，Bonferroni校正被用来校正多个假设检验。分类变量比较采用卡方检验。P值< 0.05为有统计学意义。所有分析均使用GraphPad Prism 8.0软件进行。

伦理批准

国家牙科和颅面研究所伦理委员会。