摘要gydF4y2Ba
子宫内膜癌(EC)是女性生殖系统最常见的癌症之一。EC分为两类(EC1和EC2)。mirna是单链RNA分子，在转录后调节基因表达。它们在癌症中有异常的表达谱，包括EC。本研究旨在评估16种mirna在EC和健康子宫内膜(HE)中的表达水平。研究共纳入45例患者，其中18例诊断为EC1, 12例诊断为EC2, 15例为HE对照。采用激光捕获显微解剖(LCM)技术，从档案福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)上解剖肿瘤组织或健康子宫内膜组织。从收集的材料中分离RNA，并使用实时荧光定量pcr检测所选mirna的表达。我们发现，与HE相比，miR-23b、miR-125b-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-451a在EC中下调。此外，miR-34a-5p和miR-146-5p在EC1中的表达高于EC2。 Analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) database confirmed decreased levels of miR-23b, miR-125b-5p, and miR-199a-3p in EC. Decreased miR-23b expression was associated with worse survival of EC patients.
介绍gydF4y2Ba
子宫内膜癌(EC)起源于子宫上皮(子宫内膜)，是美国女性生殖系统最常见的癌症gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。据估计，2022年将诊断出65,950例新病例，占美国所有新癌症病例的3.5%，该疾病将导致12,550名患者死亡，相当于所有癌症死亡人数的2.1%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。发病率和死亡率在人群中稳步上升，这与许多因素有关，包括肥胖的日益流行，肥胖是发展EC的主要危险因素之一gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。5年相对生存率估计为81.1%gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。电子商务可以根据两种不同的分类体系进行分类。传统的分类是1981年由博克曼提出的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，将EC分为两种类型，其中1型EC (EC1)定义为与子宫内膜增生相关的雌激素依赖型肿瘤，2型EC (EC2)定义为与子宫内膜萎缩相关的雌激素依赖型肿瘤。EC的另一种分类是根据组织病理学特征来划分肿瘤，其中EC可分为子宫内膜样癌、浆液性癌、透明细胞腺癌、癌肉瘤等类型gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。癌症基因组图谱研究网络(TCGA)分析显示，EC可以根据其分子特征进行分类，从而可以更好地对EC患者进行分层gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
MiRNAs (microRNAs)是内源性的单链非编码RNA小分子，在转录后水平调节基因表达gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。它们在细胞增殖、分化和凋亡等广泛的生物过程中发挥着重要作用gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。mirna的生物发生涉及多个步骤，这些步骤发生在功能分子合成的每个步骤中gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。mirna的表达受多种转录因子控制，其中p53和c-Myc似乎在这一过程中起关键作用gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。mirna的失调可能导致癌变的启动，这可以影响Hanahan和Weinberg定义的所有癌症特征gydF4y2Ba13gydF4y2Ba包括复制永生、增殖信号、免疫逃避、生长抑制因子失活或诱导血管生成gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。值得注意的是，mirna可以同时作为致癌基因或肿瘤抑制基因，这取决于它们的靶基因gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。在过去的十年中，已经描述了多种癌症类型中miRNA表达失调的证据。包括我们在内的许多研究小组对这一主题的关注导致了mirna作为癌症生物标志物以及癌症侵袭和转移标志物的作用的报道gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本研究旨在通过确定典型参与癌症发展的mirna水平来进一步表征EC的发病机制。该研究是在EC1和EC2两种类型的EC1和EC2以及健康子宫内膜组织的显微解剖组织样本上进行的。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
在这项研究中，我们招募了30例未接受治疗的原发性EC患者，以及15例因其他妇科病理(平滑肌瘤)而手术的健康子宫内膜(HE)患者作为对照。这些患者的子宫内膜经组织病理学证实是正常的。为了确保获得的用于miRNAs表达分析的材料仅包含EC或HE组织，我们使用激光捕获显微解剖(LCM)来精确解剖组织的特定片段。在每个EC的FFPE样本中，仅用LCM解剖肿瘤组织。在HE样本中，仅解剖腺样子宫内膜组织(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。从收集的资料中，我们确定了miR-21-3p、miR-23b、miR-34a-5p、miR-96-5p、miR-125b-5p、miR-134-5p、miR-146-5p、miR-150-5p、miR-181b-5p、miR-199a-3p、miR-200b-3p、miR-211-3p、miR-221-3p、miR-410-3p和miR-451a的水平。gydF4y2Ba
研究设计示意图。(1)从子宫内膜癌1型(EC1)和2型(EC2)肿瘤和健康子宫内膜制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。(2)对FFPE标本进行苏木精和伊红染色进行病理检查。(3)对FFPE标本进行苏木精和伊红染色，(4)进行激光捕获显微解剖(LCM)。LCM前(左)和LCM后(右)切片的显微扫描。(5)从子宫内膜癌组织和健康子宫内膜中分离RNA。(6)逆转录后，采用real-time qPCR方法评估所选miRNAs的表达情况。使用Biorender.com创建。gydF4y2Ba
MiR-23b、miR-125b-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-451a在EC中下调gydF4y2Ba
对16种mirna的分析显示，与HE相比，EC中某些mirna的表达水平显著下调。miR-23b下调4.54倍，(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， miR-125b-5p下调7.15倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0005)， miR-199a-3p下调11.11倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， miR-221-3p下调4.54倍，gydF4y2Ba2gydF4y2Bad,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0029)， miR-451a下调17.24倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。相比之下，与HE相比，EC中miR-21-3p、miR-34a-5p、miR-96-5p、miR-134-5p、miR-146-5p、miR-150-5p、miR-181b-5p、miR-182-5p、miR-200b-3p、miR-211-3p和miR-410-3p的表达无统计学差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa - k,gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)。gydF4y2Ba
miR-23b、miR-125b-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-451a在EC中下调。miR-23b (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和miR-125b-5p (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， miR-199a-3p (gydF4y2BacgydF4y2Ba)， miR-221-3p (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， miR-451a (gydF4y2BaegydF4y2Ba)在EC1和EC2的解剖肿瘤组织(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0005,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0029,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值采用Mann-Whitney检验计算。gydF4y2Ba
选定的mirna在EC和HE组织中的均匀表达。miR-21-3p (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)， miR-34a-5p (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， miR-96-5p (gydF4y2BacgydF4y2Ba)， miR-134-5p (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， miR-146-5p (gydF4y2BaegydF4y2Ba)， miR-150-5p (gydF4y2BafgydF4y2Ba)， miR-181b-5p (gydF4y2BaggydF4y2Ba)， miR-182-5p (gydF4y2BahgydF4y2Ba)， miR-200b-3p (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)， miR-211-3p (gydF4y2BajgydF4y2Ba)， miR-410-3p (gydF4y2BakgydF4y2Ba)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值采用Mann-Whitney检验计算;gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05。gydF4y2Ba
与EC2相比，MiR-34a-5p和miR-146-5p在EC1中上调gydF4y2Ba
接下来，我们分析了EC1和EC2之间mirna表达谱的差异。在本研究中使用的30个EC样本中，18个样本为EC1型，12个样本为EC2型。与EC2相比，EC1中两种mirna的表达上调。这些是miR-34a-5p(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA，上调5.43倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.031)和miR-146-5p(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB，上调3.50倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0479)。在EC1和EC2标本中，miR-21-3p、miR-23b、miR-96-5p、miR-125b-5p、miR-134-5p、miR-150-5p、miR-181b-5p、miR-182-5p、miR-199a-3p、miR-200b-3p、miR-211-3p、miR-221-3p、miR-410-3p和miR-451a的表达无差异(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个n,gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)。gydF4y2Ba
与EC1相比，EC2中miR-34a和miR-146-5p水平降低。miR-34a-5p (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和miR-146-5p (gydF4y2BabgydF4y2Ba)在EC1和EC2的解剖肿瘤组织(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.031,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0479)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-数值用Mann-Whitney计算。gydF4y2Ba
选定的mirna在EC1和EC2肿瘤组织中的均匀表达。miR-21-3p (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)， miR-23b (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， miR-96-5p (gydF4y2BacgydF4y2Ba)， miR-125b-5p (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， miR-134-5p (gydF4y2BaegydF4y2Ba)， miR-150-5p (gydF4y2BafgydF4y2Ba)， miR-181b-5p (gydF4y2BaggydF4y2Ba)， miR-182-5p (gydF4y2BahgydF4y2Ba)， miR-199a-3p (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)， miR-200b-3p (gydF4y2BajgydF4y2Ba)， miR-211-3p (gydF4y2BakgydF4y2Ba)， miR-221-3p (gydF4y2BalgydF4y2Ba)， miR-410-3p (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)， miR-451a (gydF4y2BangydF4y2Ba)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值采用Mann-Whitney检验计算;gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05。gydF4y2Ba
MiR-23b、miR-125b-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p在TCGA队列中下调gydF4y2Ba
为了证实我们的发现，我们使用OncomiR数据库分析了癌症基因组图谱(TCGA)中所研究的mirna在418例EC组织和32例HE对照中的表达gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。miR-23b表达水平(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA，下调1.87倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， miR-125b-5p (gydF4y2Ba6gydF4y2BaB，下调2.34倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001) miR-199a-3p(图gydF4y2Ba6gydF4y2BaC，下调1.26倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0067)， miR-221-3p(图3)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD，下调1.45倍;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0110)在EC中与HE相比显著下调。与HE相比，EC中miR-451a的表达水平没有差异(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae,gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)。gydF4y2Ba
TCGA队列中miR-23b、miR-199a和miR-221的下调使用OncomiR数据库分析TCGA子宫体子宫内膜癌(EC)队列gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。miR-23b (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)， miR-125b-3p (gydF4y2BabgydF4y2Ba)、miR-199a (gydF4y2BacgydF4y2Ba)、miR-221 (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， miR-451a (gydF4y2BaegydF4y2Ba)表示为每百万读取(RPM) miRNAs映射。健康子宫内膜组织(HE, n = 32)， EC组织(n = 418)。中位数用虚线表示;四分位数用实线表示。（gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0067,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0110)gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值采用Mann-Whitney检验计算。gydF4y2Ba
miR-23b表达降低与生存率降低相关gydF4y2Ba
进一步，我们检查了EC组织中下调mirna的表达是否与患者的生存相关。我们使用OncoLnc分析TCGA EC队列患者的生存率和miRNAs水平gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。我们发现较差的生存率仅与miR-23b表达降低相关(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0203)。miR-125-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p或miR-451a的表达降低与EC患者的生存无关(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba中,gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)。gydF4y2Ba
miR-23b表达降低与EC患者生存率降低相关。基于miR-23b (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)， miR-125b-5p (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， miR-199a-3p (gydF4y2BacgydF4y2Ba)， miR-221-3p (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， miR-451a (gydF4y2BaegydF4y2Ba)在TCGA队列(n = 533)数据中的表达gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。根据miRNA水平低:高75:25进行分组。LogrankgydF4y2BaPgydF4y2Ba-值在图中表示。gydF4y2Ba
miR-23b抑制EC细胞的增殖gydF4y2Ba
在EC组织中miR-23b的表达降低提示其作为肿瘤抑制miRNA的作用。为了确定miR-23b是否可能作为肿瘤抑制因子，我们用合成的模拟miR-23b、抗miR-23b (miR-23b抑制剂)和相应的scramble对照转染Ishikawa EC细胞，并进行增殖实验。我们观察到，用模拟miR-23b上调miR-23b可以有效抑制Ishikawa细胞的增殖(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0065)。相反，用抗miR-23b抑制miR-23b可上调Ishikawa细胞的增殖(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0226)。提示miR-23b在EC中是一种抑瘤miRNA。进一步，我们分析了RNA相互作用组百科全书(ENCORI)。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba鉴定miR-23b靶点富集的KEGG通路(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。结果表明，miR-23b调控肿瘤中的关键通路，包括P53信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路、细胞周期以及调节肌动蛋白细胞骨架的通路。gydF4y2Ba
miR-23b抑制EC细胞的增殖。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)与相应的对照miR-scramble (miR-scr)转染细胞相比，模拟miR-23b-和抗miR-23b转染的Ishikawa细胞的相对增殖(n = 3)。（gydF4y2BabgydF4y2Ba)增殖试验代表性照片。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值采用配对T检验计算(**)gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.006， *gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0226)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
mirna的异常表达已在许多类型的癌症中观察到，包括ECgydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。我们最近的系统综述显示，mirna是EC进展的关键调节因子gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。通过分析115篇文章，我们确定了106个参与EC侵袭性和转移调节的失调mirna。它们不仅调控EC细胞的侵袭和迁移，还影响肿瘤的转移和生长。此外，几种mirna的表达与EC患者的临床参数相关gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。在本研究中，我们分析了在肿瘤组织EC1和EC2以及健康子宫内膜中具有明确作用的16种mirna的表达gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。我们鉴定出五种mirna, miR-23b, miR-125b-5p, miR-199a-3p, miR-221-3p和miR-451a，在EC中与HE相比下调。gydF4y2Ba
MiR-23b在不同类型的癌症中发挥相反的作用，但在EC中是肿瘤抑制miRNAgydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。MiR-23b靶向结肠癌转移相关的1 (MACC1)，抑制EC细胞的增殖、侵袭和迁移。此外，在小鼠模型中，miR-23b在体内抑制EC转移gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。与正常输卵管上皮细胞相比，miR-23b在EC衍生细胞系中的表达下调，在mirna谱研究中，FFPE EC组织中miR-23b的表达也下调gydF4y2Ba31gydF4y2Ba。此外，miR-23b在3级EC1肿瘤中的表达低于1级肿瘤gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。我们发现，无论EC类型如何，与HE相比，miR-23b在EC组织中下调。此外，TCGA队列分析显示，miR-23b表达降低与EC患者的不良生存率相关。在Ishikawa EC细胞中，miR-23b的上调抑制了其增殖，而其抑制作用则有力地上调了其增殖。对miR-23b靶点富集通路的分析显示，它调节EC中的关键信号通路。需要进一步的研究来剖析miR-23b作为肿瘤抑制因子miR在EC中的作用。gydF4y2Ba
在我们的研究中，MiR-125b-5p在EC组织中表达下调，这在TCGA队列中得到了证实。在EC中，miR-125b-5p作为肿瘤抑制miRNA，通过直接靶向原癌基因ERBB2抑制EC细胞的侵袭gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。然而，miR-125b-5p的表达与患者的生存无关，尽管miR-125b-5p水平的降低与较高的组织学分级和子宫内膜侵袭有关gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
MiR-199a-3p是EC中与HE相比下调的另一个miRNAgydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。此外，miR-199a-3p水平的升高与EC患者更好的无进展生存期和总生存期相关gydF4y2Ba37gydF4y2Ba然而，TCGA队列患者的情况并非如此。gydF4y2Ba
此外，我们发现无论EC类型如何，在EC组织中miR-221-3p和miR-451a都比HE下调。值得注意的是，在EC患者的TCGA队列中，miR-221-3p被证实下调。值得注意的是，在包括乳腺癌和肝癌在内的其他类型的癌症中，miR-221被鉴定为一种肿瘤rnagydF4y2Ba38gydF4y2Ba。它的过表达促进肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖gydF4y2Ba38gydF4y2Ba。我们的研究结果表明，miR-221在EC中对肿瘤生长的作用并不重要，因为它在这种病理中表达减少。这与其他癌症的已发表数据相反，其中miR-221和miR-451a都作为肿瘤抑制mirna，包括卵巢癌和宫颈癌gydF4y2Ba39gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
此外，我们发现分析的大多数mirna在两种类型的EC中的表达非常相似。只有miR-34a-5p和miR-146-5p水平在两种类型之间存在差异，即与EC2相比，miR-34a-5p和miR-146-5p在EC1中的表达上调。关于miR-34a-5p在EC中的表达水平与HE的数据不一致gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba。尽管如此，miR-34a-5p在EC中被鉴定为肿瘤抑制miRNA。靶向Notch1、L1CAM、MMSET，抑制体外EC细胞迁移、侵袭、EMT及肿瘤生长gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。miR-146-5p在EC中的作用及表达水平尚无相关研究。然而，在前列腺癌大鼠血浆中，雌激素可使miR-146-5p的表达升高gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，这可能表明miR-146-5p的上调可能与EC1中的雌激素有关。值得注意的是，目前大多数关于EC中miRNA表达的研究都是基于两种经典的分类。然而，有一个努力，包括分子分类的EC患者在临床实践gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。因此，需要研究确定不同类型EC中miRNAs的表达谱。gydF4y2Ba
由于mirna在健康和癌组织中表现出不同的表达模式，因此它们具有很大的潜力，可以作为诊断和预后有价值的生物标志物以及潜在的治疗靶点gydF4y2Ba45gydF4y2Ba。到目前为止，在正常和恶性子宫内膜组织中已经发现了多种不同表达模式的mirnagydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba。在FFPE组织中可以测定MiRNAs的表达，这种评估可以在标准的组织病理学检查之外进行gydF4y2Ba48gydF4y2Ba。此外，使用激光捕获显微解剖(LCM)可以精确地解剖肿瘤组织，而不会污染肿瘤周围的非恶性细胞gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba。在本研究中，我们只解剖肿瘤组织或腺体健康子宫内膜，因此分析不受邻近组织的干扰。本研究的主要限制是EC组织标本数量少，缺乏纳入患者的完整临床资料。因此，我们无法将所分析的mirna的表达与患者的生存等联系起来。因此，需要进一步的研究来评估所研究的mirna在EC中的临床相关性，特别是miR-23b作为预后生物标志物的作用。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
在本研究中，我们发现miR-23b、miR-125b-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-451a在子宫内膜癌中与健康子宫内膜相比下调。此外，miR-34a-5p和miR-146-5p在EC1中的表达高于EC2。miR-23b表达降低与EC患者生存率降低相关。需要进一步的研究来评估所描述的mirna作为生物标志物的潜在临床应用。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
患者组织gydF4y2Ba
研究共纳入45例患者，其中18例诊断为EC1, 12例诊断为EC2, 15例为HE对照。采用激光捕获显微解剖(LCM)技术，从档案福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)上解剖肿瘤组织或健康子宫内膜组织。FFPE样本取自波兰华沙研究生教育医学中心病理学部。患者资料见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。该研究是在《赫尔辛基宣言》之后进行的，并得到了华沙医科大学生物伦理委员会(AKBE/78/2021, 2021年5月17日)的批准。由于该研究的匿名性和回顾性特征，患者的同意被放弃。gydF4y2Ba
苏木精和伊红染色gydF4y2Ba
切除的肿瘤按标准方案在组织处理机中进行福尔马林固定和石蜡包埋。切片机切片，苏木精和伊红染色，病理检查。gydF4y2Ba
所有样品用切片机切成10µm的薄片，用一滴超纯DNAse/RNAse-free水装在玻璃载玻片上。然后，样品在56°C的通风柜中孵育1小时，以增加切片的粘附性。根据标准方案，在一组染色剂、酒精溶液和二甲苯中对安装的切片进行苏木精和伊红染色。立即对载玻片进行LCM。gydF4y2Ba
激光捕获显微解剖gydF4y2Ba
染色和脱水的EC或HE切片在lcm辅助下切除仅含肿瘤组织或腺健康子宫内膜的区域。每个区域约10 mm2被标记以使用LCM系统(PALM Robo，蔡司，德国)进行解剖。这些区域是由委员会认证的病理学家选择的。每个LCM之前都对LCP能量和斑点距离进行优化，以提供对标记区域的完整解剖。LCM在以下条件下进行:LCP能量80 - 90,LCP光斑距离- 25 μm，放大倍率- 5倍，在500 μl无菌pcr管帽中加入20 μl消解缓冲液(Norgen Biotek)收集的组织。用管密封瓶盖，短暂离心，置于湿冰上等待下一步操作gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
RNA分离和RT-qPCRgydF4y2Ba
按照制造商指南，使用Norgen Biotek FFPE RNA/DNA纯化试剂盒进行RNA分离。RNA用30µl超纯分子级水洗脱，保存在- 80°C，等待下一步。使用NanoDrop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)在260/280 nm波长处测定吸光度，以评估分离RNA的纯度和数量。选用260/280比值为1.8 ~ 2.1的样品进行进一步分析。然后使用Mir-X miRNA FirstStrand Synthesis (Takara, Clontech)对RNA进行逆转录，然后使用SYBR qRT-PCR (Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。本研究使用的引物序列如表所示gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。用U6 (Takara, Clontech)作为内源性对照分析microRNA的表达。2gydF4y2Ba−ΔCtgydF4y2Ba方法用靶基因与对照的平均Ct值计算相对表达量。gydF4y2Ba
Bioinformatical分析gydF4y2Ba
使用OncomiR数据库对子宫肌体子宫内膜癌(EC)队列的TCGA数据库进行分析gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。使用OncoLnc分析来自TCGA队列(n = 533)的miRNAs表达与EC患者生存的关系gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。根据miRNA水平低:高75:25进行分组。利用starBase对富集的信号通路进行分析gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩散分析gydF4y2Ba
EC Ishikawa细胞在dubecco 's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养，培养基中添加10% (v/v)热灭活胎牛血清(FBS, Gibco)， 100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich)， 37℃，空气中CO2含量为5%。用PCR技术检测细胞支原体污染，证实为阴性。gydF4y2Ba
所有转染均按照制造商的方案使用DharmaFECT (ThermoFisher)进行。从Invitrogen mirVan (Thermo Fisher Scientific)获得miR-23b mimic(测定号:MC12931)、anti- miR-23b(测定号:MH12931)、mimic miR-scramble (miR-scr, miRNA mimic阴性对照，目录号:4464058)和anti- miR-scramble (anti- mir scr, miRNA Inhibitor，阴性对照，目录号:4464078)。使用终浓度为50 nM的mir。RT-qPCR法检测转染效率。增殖试验用1 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba转染24 h后将细胞/孔接种于12孔板中，孵育48 h，然后用4% PFA固定细胞，0.1%结晶紫染色。使用尼康Ti-U对细胞进行拍照。使用ImageJ(美国国立卫生研究院，Bethesda MD)和ColonyArea插件对照片进行分析gydF4y2Ba53gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
数据处理与分析gydF4y2Ba
使用Excel 2016 (Microsoft, USA)收集和处理数据。采用GraphPad Prism 8.4.3 (GraphPad Software Inc.)软件进行统计分析，采用Mann-Whitney检验和log-rank检验。数据分布采用Shapiro-Wilk检验。图中所有值。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba用中位数和95% CI表示。数据见图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。表示为小提琴图，中位数表示为虚线，四分位数表示为实线。数据见图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba用Kaplan-Meier图表示。一个gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为差异有统计学意义。gydF4y2Ba
数据可用性gydF4y2Ba
支持本研究结果的数据可根据合理要求从T.M.G.或K.K.获得。数据来自TCGAgydF4y2Bahttps://www.cancer.gov/tcgagydF4y2Ba都是公开的。gydF4y2Ba
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致谢gydF4y2Ba
本研究由国家科学中心资助，批准号为2021/41/N/NZ5/02772 (K.K.)。tm.g.由波兰科学基金会(FNP)资助。APC由华沙医科大学资助。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及单位gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
K.K.获得资金，计划并进行实验，分析结果，并撰写手稿。T.M.G.构思实验，进行实验，分析结果，准备数据，监督研究，并撰写手稿。A.K.收集并分析了患者的临床资料。A.M.写了手稿。J.W.和J.O.收集并提供HE和EC样本，并对样本进行组织病理学分析。A.G.参加了实验。P.K.W.获得资金并监督研究。所有作者都已阅读并同意稿件的出版版本。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba
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kicka, K, Grzywa, t.m.， Klinke, A。gydF4y2Baet al。gydF4y2BamiR-23b表达降低与子宫内膜癌患者生存不良相关。gydF4y2BaSci代表gydF4y2Ba12gydF4y2Ba， 18824(2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-22306-wgydF4y2Ba
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