活丝状真菌中脂滴的无标签三次谐波成像和定量

三次谐波(THG)显微镜作为一种无标记非线性成像技术是一个强大的工具，可视化的各种细胞和组织结构¹．THG主要应用于动物细胞结构成像^{1，2，3.，4，5，6，7}和组织^{1，4，6，8，9，10，11，12，13，14}，以及细胞过程的动力学(功能成像)^{1，6，12，15}．此外，THG显微镜已用于研究人类和脊椎动物的牙齿化石¹⁶，三维工程人体脂肪组织¹⁷、小生物(黑腹果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、早期小鼠胚胎^{8，18，19，20.}和秀丽隐杆线虫^21，22)．除了动物标本，THG显微镜也被应用于植物^{11，23，24，25，26，27}、藻类^26，27和酵母^2，28．据我们所知，丝状真菌的THG研究很少。

THG现象是由具有特定性质的结构引起的非线性相干散射过程。在THG中，三个光子的联合能量被转换为一个光子。由于THG是一个三阶过程，为了保证足够的信号，需要在光焦点处具有高峰值功率密度的超短激光脉冲。在THG显微镜中，在折射率或三阶非线性磁化率有较大变化的界面上产生对比^29，30.．由于脂类的折射率较高(在1100-480 nm时，r.i(脂类)= 1.46-1.48)³¹相对于细胞质(r.i在633 nm处= 1.360-1.390)³²时，THG信号在水相和富脂结构的界面处有效产生^33，34，35．其中包括细胞膜和脂滴(ld)。

脂滴是一种动态细胞器，在真核细胞的脂质稳态和能量调节中起着关键作用。对真菌中脂滴生理的研究仍处于起步阶段，但其定量与生物医学、农业、工业废物和能源危机等问题有关。如上所述，THG显微镜是一种特别适用于脂滴生理学研究的技术^11，35，36．THG显微镜的优点是它是非侵入性的，产生固有的共聚焦图像，不需要固定或外部标记-类似于基于拉曼的^{37，38，39，40，41，42}，差分干涉对比度(DIC)⁴³以及光学薄片显微镜³⁷，并且具有最低限度的光毒性，可用于体内研究。基于拉曼的技术和THG显微镜之间的一个不同点是更简单的激发方案和最小的像差风险。将THG与荧光显微镜相结合有助于识别THG产生的信号的分子来源(即靶向LDs的亲脂性荧光染料)。^4，7，36．一旦识别出THG相关结构，就可以使用THG显微镜原位跟踪。

定量包含ld的图像可能具有挑战性。所需参数包括LD数量、密度、尺寸和形态。可用于此目的的图像分析软件和编程语言有ImageJ, Cell Profiler, Imaris, AMIRA, Volocity, MATLAB, D编程，用于这两种荧光图像^{44，45，46，47}和脂滴图像采取无标签^{11，17，20.}技术。脂滴的自动定量使用图像的阈值(基于阈值)或分水岭方法(基于形态学)⁴⁸，并且通常针对特定的细胞系进行优化。我们希望有一个更通用的图像分析平台，不需要广泛的细胞系特定阈值。在这方面，图像相关光谱(ICS)是一种很有前途的方法，因为它是基于测量空间相关波动。ICS已应用于共聚焦图像，测量荧光强度波动的空间变化，这可能进一步与颗粒密度和聚集状态有关⁴⁹．另一方面，ICS很少用于非线性技术，仅用于双光子激发荧光(TPEF)。⁵⁰或者最近的二次谐波成像(SHG)⁵¹．

丝状真菌⁵²是普遍存在的生物，对广泛的生态系统过程有深刻的贡献，包括有机碳的分解、碳储存和养分转移。作为碳循环中一个不可见且经常被忽视的部分，丝状真菌(如腐生植物和植物共生体(菌根真菌))为植物有机碳创建了一个汇，并将其分配到地下菌丝生物量⁵³．产油丝状真菌有能力以脂质形式积累大量的碳，超过其生物量的20%^54，55在适当的条件下。这些脂质被认为是各种生物技术应用(生物柴油生产、高价值化学品、食品/饲料添加剂和废水的有效生物修复)的宝贵替代资源。^56，57在以生物为基础的经济中。此外，脂质积累与真菌对毒素的抵抗力有关⁵⁸致病真菌的毒力⁵⁹．此外，经过修饰的完全缺乏脂滴的酵母细胞对各种压力都非常脆弱⁶⁰这表明LD研究可能会导致新的抗真菌治疗方法。我们选择了众所周知的模式物种进行LDs的THG成像研究Phycomyces blaekseneanus在THG成像中，丝状真菌的LDs尺寸非常小(< 1.5 μm)，而在白色脂肪细胞中，LDs尺寸可达100 μm，这是利用THG成像对丝状真菌进行成像的挑战⁶¹．我们的目的是表明THG显微镜非常适合于成像活丝状真菌中ld的密度和大小。为此，我们将在基线控制条件下使用丝状真菌，具有零星和小的ld，对应于低脂含量条件⁶²，以及氮饥饿诱导的自噬反应引起的LDs密度更大的真菌⁶³，即分子循环的保守细胞机制⁶⁴．除了真菌中ld的无标记THG成像外，我们还提出了两种用于ld定量和分析的方法。第一种方法是基于ImageJ/Fiji开源平台的颗粒分析工具，它提供了ld的大小、形状和数量的测量。第二种方法称为图像相关光谱(ICS)⁶⁵，通过空间自相关分析提供颗粒密度和大小的测量。

我们的目的是证明ICS是一种很好的方法来量化在THG图像中的ld。

丝状真菌菌种及生长条件

合子菌一种产油合子菌的野生型菌株Phycomyces blakesleeanus本研究采用(burgff) [NRRL 1555(-)]作为模型细胞系统。为了菌丝体的最佳生长，孢子浓度为10⁷孢子/ml在21-23°C下镀于100mm的培养皿中。每升培养用最低标准液体(SLM)培养基:20克D(+)-葡萄糖(碳源)，2克l -天冬酰胺·H₂O(氮源)，KH 5克₂PO4, 500 mg MgSO₄h·7₂O，微量元素/“微量库存”(28毫克钙₂，盐酸硫胺素1 mg，柠檬酸·H 2 mg₂O, 1.8 mg Fe(NO_3.）_3.h·9₂O, ZnSO 1毫克₄h·7₂O, 300µg MnSO₄·H₂O, 50µg CuSO₄h·5₂O和50µg Na₂MoO₄h·2₂O)。葡萄糖单独蒸压，最终培养基pH为4.5。渗透压约为200 mOsm。

在氮饥饿实验中，真菌首先在SLM培养基中生长，22 h后分为两组。组1为对照组，组2为缺氮组(n -starve)。对照组1的真菌经离心10 min后重悬于SLM培养基中。第2组，真菌细胞离心(10分钟)，重悬于无氮培养基(不含l -天冬酰胺的SLM培养基)(图2)。1)．在室温下氮饥饿(3、4.5、6 h和> 6 h(至8.5 h))后的不同时间点对年龄匹配的真菌培养进行成像。用于成像的所有真菌培养都处于指数生长期(从播种开始的总时间在24-30.5小时之间)。从6 - 8.5小时的时间点收集的数据汇集在一起，并代表长时间氮饥饿组(图上标记为6小时)。

脂质染色

活真菌细胞染色时不进行化学固定。为了染色真菌细胞，将指数生长期(26 h)的菌丝与40 ng/mL尼罗红染料(Acros Organics)在20℃下孵育10分钟。

非线性激光扫描显微镜(NLSM)实验设置和菌丝成像

未染色的活真菌细胞的图像是使用定制的非线性激光扫描显微镜获得的，先前在参考文献中描述过^66，67，但修改了THG成像(图。2)．为了对细菌进行三次谐波(THG)成像，使用了以下基于显著改进的Zeiss Jenaval直立显微镜的实验装置:由SESAM锁模Yb:KGW激光器提供红外飞秒脉冲(Time-Bandwidth Products AG, Time-Bandwidth Yb GLX;瑞士苏黎世，波长1040 nm，脉冲持续时间200 fs，重复频率83 MHz)。激光波长的选择使得波长短3倍(347 nm)的THG信号仍然在常规空气紫外光学的范围内。激光首先通过1:1的准直扩束器(L1和L2)进行发散补偿，然后与用于TPEF成像的Ti: Sa激光束结合(在BC处)。在此之后，两个光束通过电动可变中性密度滤波器(VNDF)进行功率调节和机械快门。使用两个检镜对样品上的光束进行光栅扫描(Cambridge Technologies, 6215H;使用1:3.75的扩束器(L3和L4)填充物镜的后孔径，达到4f。配置。光束通过高数值孔径(NA)油浸物镜(Carl Zeiss, EC Plan-Neofluar 40X, NA 1.3)通过短通主二向色镜(MDM，在700 nm处截止)进一步定向到样品上。 The THG signal was detected in the forward direction (transmission arm), parallel to the direction of laser propagation. First, the signal was collected by high NA aspheric lens (condenser). Then, it was reflected by two dichroic mirrors (DM) that reflect 347 nm but transmit 1040 nm to prevent the laser beam from reaching the detector. Further on, the signal was filtered out from the rest of the laser photons by a bandwidth filter 275–375 nm (Thorlabs FGUV11M) and a Hoya glass UV filter (Newport FSR-U340) with a maximum transmission at 340 nm. The THG signal was detected using a photomultiplier tube (PMT) (Hamamatsu, H7422, Japan), after being focused by a 50 mm focal length lens (L6) onto the entrance window of the PMT.

用于(自动)TPEF成像可调(700-900 nm)克尔透镜模式锁定Ti:Sa激光器(Mira 900，相干公司。采用532 nm连续波频率倍Nd:YVO4激光器(VERDI V10, Coherent Inc.)进行泵浦。美国CA)。Ti:Sa激光的波长设置为730 nm用于自动TPEF成像，因为大多数内源性荧光团(NADH，黄素等)可以在此波长激发⁶⁸一方面，又因为技术上的限制(激光可调范围和二向色镜的切断)。荧光信号由物镜进行后向反射采集，经过MDM、管状透镜(TL)，通过VIS (400-700 nm)带通滤波器(佳能，摄于相机EOS50D)滤除，用于检测Ti:Sa激光激发的自荧光。此外，尼罗红荧光采用570 nm长通滤波器(彩色玻璃，未知厂商)，由Yb: KGW激光激发，同时由THG信号检测。TPEF信号通过50mm焦距透镜(L5)聚焦到TPEF PMT的入口窗口后检测。

采用国家仪器卡USB-6351采集，采集速率为1.2 M sample/s。这使得在低分辨率下的实时监控具有足够高的帧率，例如每秒3帧，256 × 256像素，平均6帧。对于高分辨率图像，1024 × 1024图像需要30秒，平均为30。40 × 1.3物镜显微镜的横向分辨率估计为300 nm，轴向分辨率估计为1000 nm。

亮场图像由佳能EOS 50D数码相机(日本东京)拍摄，其CMOS传感器放置在管镜头的像平面上。拨码开关BS/M允许使用相机进行亮场或TPEF PMT进行荧光成像。

使用了一个特殊设计的样品夹，使菌丝和生长介质被放置在两个盖片之间，以满足物镜的最佳NA标准，同时也避免了厚玻璃对UV THG信号的损失(补充图。S1而且S2显示所测试的菌丝的不同成像条件，以便找到最佳的)。采用#1.5覆盖层(170 μm厚度)。用20 μl菌丝悬液维持菌丝存活。支架放置在物镜和非球面聚光镜之间的电动工作台上，可沿光束传播方向(z轴)平移0.3 μm步长，用于样品的光学切片和三维成像。

在对照组和缺氮组成像中，时间点依次收集。使用无标签成像技术，如THG，使我们能够在从培养物中提取真菌后，以最小的延迟对样品进行成像。为了获得活菌丝的至少3张THG图像，样品在显微镜下培养的总时间在25 - 37分钟之间。有效地，控制和处理的时间点在一个实验日偏移30-40分钟，在第二天，偏移方向与另一个相反。实验组中所有菌丝生长时间的准确范围(均值和标准差)收集在补充图中。S4．

图像分析

使用ImageJ对脂滴进行二维THG图像分析(W. Rasband，美国马里兰州国家卫生研究所，http://imagej.nih.gov/ij/)．使用MATLAB(内部创建代码)和VolView软件编写的算法进行3D和4D图像处理。采用两种图像分析方法，颗粒尺寸分析(PSA)和图像相关光谱(ICS)来量化LDs的数量和大小。有关两项程序的详情载于补充资料。

统计数据

为了进行定量图像分析，分别从6个独立生长的培养物中获得对照条件下(n = 44)和氮饥饿后(n = 17)的单个菌丝图像。GraphPad Prism用于绘图和统计比较。盒状和须状图的盒子由第25和第75百分位的范围包围，线代表中位数;晶须分别向最小值和最大值延伸。每组所有LD直径以0.3µm分仓生成LD数量直方图，每个bin值除以组内菌丝面积之和。LDs个数/菌丝面积直方图误差计算公式为:相对误差(被装箱N/面积)=相对误差(LDs个数/菌丝面积)+相对误差(面积)，相对误差(被装箱N/面积)乘以该bin的LDs个数/菌丝面积。采用双因素方差分析(two -way ANOVA)和Holm-Sidac校正(Holm-Sidac correction)和非配对双尾t检验(Welch's correction)对不平等方差进行统计学意义的计算。在适当的情况下，用未配对的双面Mann-Whitney检验代替。统计学显著性置信水平为:0.05(*)，0.01(**)，0.005(***)，0.0001(****)。

未染色活体THG切片(2D)及三维重建p . blakesleeanus处于指数生长期的菌丝如图所示。3.分别为a, b。细胞周长处的THG信号来源于几丁质细胞壁和质膜，它们遵循细胞壁的形状。在细胞质中，可以看到产生THG信号的各种实体。菌丝置于两个盖层之间的液体培养基中。显微系统的高分辨率(衍射受限)，菌丝的厚度(约10微米)和介质的透明性使得整个菌丝可以被光学切片，并可以重建3D模型(图。3.b和补充视频S1参阅补充资料)。可见，在细胞质中的所有实体中，强THG信号特征最为突出。根据文献，这些很可能是脂滴，因为与细胞质的其他部分相比，它们具有较大的折射率。此外，在Supplementary Material中提供了源自ld的THG信号的功率依赖性(图2)。S3)．

细胞壁和质膜之间的距离非常小，这在通过衍射有限技术获得的原生菌丝图像中是无法分辨的(分辨率约为250 nm)。为了分别观察细胞壁和质膜，我们将菌丝溶解，使质膜在可分辨的距离上从细胞壁上缩回(图2)。3.c).收缩的细胞质在亮区清晰可见(图。3.c左)和autoTPEF图像(图。3.c中)，但只有在THG图像中才能完全分辨出质膜(图。3.C右)，因为它的折射率不同于细胞质。

菌丝中AutoTPEF和THG信号无明显重叠

虽然THG成像并不一定是特定于LDs，因为THG信号是由任何折射率变化产生的，但与细胞细胞质中的其他结构相比，LDs仍然产生明显更高的THG信号p . blakesleeanus．这一事实可以用来提取细胞中的ld，在一个广泛的但仍然比其他细胞质实体低得多的信号范围。作为确认高THG信号特征在未标记现场的第一步p . blakesleeanus为LDs，我们通过在730 nm处两次光子激发下检测自动荧光信号对同一菌丝进行成像(图。4左)。为了保证高THG信号实体(图;4a)不是可能由高激光强度损伤引起的伪影，我们合并了两幅图像，THG和autoTPEF(图2)。4(中)显示相同位置的TPEF信号没有明显增加。菌丝处于指数生长期，如图。3.．

TPEF和THG成像的脂滴信号共定位

而许多对各种生物样品的无标记成像研究表明，细胞质中强烈的THG对比主要来自于ld^11，35，36的情况下Phycomyces blaekseneanusTHG成像从未应用于这类生物。

为了坚定地证明菌丝THG图像中的细胞质点是LDs，我们进行了共定位实验(图2)。4b).菌丝用尼罗红染色，尼罗红染色被认为是脂质的标准⁶⁹．采用与THG相同的激光激发尼罗红染料的TPEF，通过400-700 nm带通和570 nm长通滤波器收集TPEF信号，有效地将荧光信号隔离在570 - 700 nm光谱区域。激光束用Zeiss Plan Neofluar 40 × 1.3物镜聚焦，同时检测TPEF和THG信号。在测量前，在两个覆盖纸之间加入非常小体积的样品(10 μl真菌悬浮液)。这使得菌丝在成像过程中保持存活，但也可以尽可能地固定在覆盖层附近，从而实现最佳分辨率。

基于Pearson相关系数和图像交叉相关光谱(ICCS)对TPEF和THG图像进行定量比较(共定位分析)。Pearson相关系数在0.74 < R范围内_总计< 0.88 (ImageJ，共域阈值插件)。根据ICCS分析，THG检测到的聚类与tpef检测到的聚类相互作用的比例为0.89，表明脂质探针产生的波动与THG信号之间存在高度的空间相关性。在我们的工作中获得的共定位程度与在活体和一些固定样品上的无标签成像所获得的一致或更高^7，70．

基于共定位实验(图;4b)，结果如图所示。4人们可能会认为THG图像中最圆的明亮特征Phycomyces blaekseneanus就是脂滴。

脂滴THG图像分析与定量

为了量化ld，我们通过粒度分析和图像相关光谱分析了一小组THG图像(均可在ImageJ中获得)。为了测试和比较这两种方法，我们使用在完全无氮培养基中培养的菌丝培养物和在标准培养基中培养的同批次菌丝培养物作为对照。已知氮限制会引起丝状真菌的自噬⁷¹，导致脂质代谢的改变和ld数量的增加^72，73．我们对指数生长期的菌丝进行THG成像，并在对照组之间交替进行(图2)。5a)和n -饥饿(图。5B)菌丝批次年龄匹配。从无花果。5即使用肉眼也可以明显看出，氮饥饿4.5 h后LD数量显著增加。一旦我们确认我们获得了预期的LD数量增加，我们就继续测试两种量化方法以及THG成像对LD检测的敏感性。

对于PSA方法(可在ImageJ中作为“分析粒子”)，原始THG图像(图。6a左)进行阈值，并转换为8位掩码，在此基础上，程序自动统计所分析图像中代表ld的“粒子”的数量(图。6一个中间)。除了粒子的数量，直径和面积也被量化。

由于图像的阈值和有限的分辨率(像素大小)，PSA可能对非常小或微弱的信号实体不敏感。因此，一些新出现的ld可能会被省略，并没有在最终结果中显示出来。为了解决这一问题，我们执行了ICS，该ICS根据图像中信号强度的空间波动提取颗粒属性信息(数量和大小)。ICS也适用于漫反射图像。

由于菌丝的形态，在应用ICS分析之前，有必要对THG图像进行预处理。菌丝的细胞壁被从图像中移除，因为它阻碍了相关分析(在G曲线上产生了座)，因为菌丝周围的强度沿整个圆周呈明显的不连续。我们对背景进行多次减法(菌丝外ROI的平均像素强度)，直到墙壁消失⁷⁴．后一个过程如图所示。6很明显，来自大多数ld的THG信号比来自墙壁的信号强得多(大约> 10x)。

去除细胞壁后，在图像j中进行图像相关处理，得到空间自相关图像，通过图像中心取强度剖面，提取G曲线。G曲线的一个例子如图所示。6b. ld数量计算公式如下:

其中N_照片像素大小是2吗ⁿ×2ⁿ图像(其中n为整数)，r为作为G曲线FWHM一半的LDs的平均半径，G(0)为G曲线的最大值。r和G(0)是从G曲线的Lorentzian拟合中提取出来的(图。6b插入)。应该注意的是，ld的形态与通常用ICS分析检查的聚类的形态有很大的不同。因此，在我们的例子中，背景的多次减法并没有像预期的那样导致曲线G与减法次数的变平⁷⁴．参考文献74中所示的G曲线的扁平化被用作应用ICS之前背景必须减去多少次的标准。我们对背景减法数量的标准是:(a)在每次后续减法后，ld数量的显著减少停止。6c，黑色方块)，(b)每个菌丝的LDs数量与PSA的近似匹配，(c)经验(从肉眼观察到的图像中消失细胞壁)。在检查了几十张对照和处理过的菌丝图像后，我们得出结论，平均而言(取决于初始图像质量)，连续20次减法足以进行可靠的ICS分析。

为了检查额外的去除细胞壁是否会产生不同数量的ld，我们只进行人工去除细胞壁。它是通过在多重背景减法之前的圈定和裁剪完成的。在连续20个背景减除后，与未手动裁剪细胞壁的图像相比，该方法在ld数量上没有显着差异(如图所示)。6c)。

用PSA和ICS分析LDs

ICS和PSA得到的LD数量和大小的比较见表1．平均每个菌丝面积上的LDs数量大致相同，但ICS得到的平均直径略低。这种差异可能是因为这两种方法中使用的对象大小定义不同。

为了估计处理过的菌丝中LD数量的变化，我们计算了处理过的菌丝中LD数量与对照菌丝中每面积LD数量的比值(图2)。6d).饥饿3 h后LDs总数无明显变化。饥饿时间越长，ld的数量增加50%以上。

通过ICS分析，计数的特征数为目测LD数(n = 12)的80±12%，与PSA得到的数据密切相关。当通过这两种方法获得的ld的数量为每个单独的图像作为一个单独的点绘制(图。6e)，回归线斜率接近于1，证实ICS在检测和计数ld方面与PSA方法同样可靠。回归R的系数²大约是0.8。

氮饥饿诱导脂滴数量和大小的变化，从THG图像定量

为了充分利用THG成像(1024 × 1024像素图像的曝光时间最长为30秒，平均为30)，并将随后的分析作为LD分析，我们对在缺氮和对照条件下生长的丝状真菌培养物进行了一组跨时间的成像和测量。真菌培养物在处理开始(氮饥饿或对照)后至少2小时后进行成像，这是预防措施，以避免在开始处理准备期间的操作(例如离心)可能产生的影响。

在贫氮培养基(缺氮)中培养的真菌菌丝中，所有成像菌丝中每单位细胞面积的LDs数量(LDs数量/菌丝面积)明显大于对照组菌丝培养的整个组(对照)(图2)。7a).为了阐明观察到的LD数量诱导增加的时间过程，将对照组和缺氮组分别分解为从治疗开始到持续时间的组，并绘制出LD数量/菌丝面积的值随时间的变化(图2)。7b).对照组的LDs数量/菌丝面积在观察时间内基本保持不变，向后期生长时间点有轻微而不显著的增加趋势(图。7b).仅在处理时间点3 h时，n饥饿组的LDs/菌丝面积与相应对照组相似。处理4.5 h后，与对照相比，LDs数量/菌丝面积增加了两倍。与对照菌丝相比，n饥饿菌丝中LDs数量/菌丝面积显著增加，且持续时间较长(图2)。7b)。

与对照组相比，在缺氮培养中，当不考虑处理时间的整个组进行比较时，LDs的平均直径显著减小(图2)。7c).从时间过程图可以看出(图。7d)，从处理时间2 h到最长处理时间，对照组的平均LD直径基本相同。在n饥饿3 h和4.5 h菌丝及相应对照中也相同。n饥饿对平均LD大小的影响只有在处理6小时或更长时间后才会显现出来。7d)。

LD直径直方图，以LD数量/菌丝面积(图;7e)在处理时间为4.5 h和6 h的组中，发现在4.5 h时间点n饥饿组中小于1.6 μ m的ld数量多于相应的对照组，而在6 h时，仅小于1 μ m的ld数量增加。LD平均直径在4.5和6小时n饥饿组之间的变化似乎是由于在n饥饿条件下长时间生长期间，大于0.6 μ m的LD种群显著损失的结果。综上所述，在无氮条件下生长过程中，LDs的总体变化是在3 - 4.5 h时间点之间LDs数量增加，随后在长时间饥饿期间，大于平均水平的LDs种群数量减少。

脂滴曾经被认为是被动的脂质储存团块，现在被认为是动态的细胞器，在真核细胞中作为无处不在的能量和脂质稳态的中心枢纽⁷⁵．真菌中脂滴生理学的研究，虽然仍然很少⁷⁶，有望为许多重要问题提供新的解决方案:减轻和调节真菌对杀菌剂和压力的耐药性，确保食品安全，更好地理解如何将真菌作为可持续有机废物再利用和转化为能源的重要组成部分，等等。Phycomyces blakesleeanus，本研究中使用的模式菌属Mucormycota,能形成丛枝菌根和其他互利共生的真菌的系统发育类群⁷⁷陆生植物⁷⁸．在真菌与植物相互作用的过程中，真菌将氮运送到植物，并接收植物合成的高达30%的有机C化合物⁷⁸作为回报。众所周知，从植物输送到真菌的有机分子是脂类^79，80并且脂滴在与植物接触区域相邻的菌丝中大量形成⁸¹．类似于Phycomyces，丛枝菌根真菌能够以脂滴的形式积累大量获得性有机碳⁸²．本文所述的LDs的THG成像是一种可以直接应用于与之相关的活菌根真菌的方法Phycomyces，无需对方案进行任何修改，也无需进行其他染色。

在我们的研究中使用的真菌培养条件导致了相当适度的脂滴积累，正如预期的那样⁶²．THG成像分析使我们能够从这种低密度/直径基线观察和量化完全去除氮所带来的脂滴数量变化。正如预期的那样，完全不含氮只会引起脂滴数量的短暂增加，随后是脂质周转⁸³．THG成像分析发现生长后期脂质储备明显下降。总而言之，这表明THG成像方法对于更广泛地探索各种生活条件下丝状真菌中的LD是有用的。

光学成像技术通常用于研究体内脂滴，但脂滴通常需要用各种染料进行标记。另一方面，使用荧光染料的长时间成像对细胞有光毒性，并可能扰乱代谢过程，包括脂质代谢。因此，无标记成像方法有利于活细胞的研究^84，85，86．

THG成像是一种无标记的方法，我们已应用于产油真菌的活菌丝Phycomices blakesleeanus，生成的图像具有脂滴高THG信号强度的特征斑点，是正常和应激细胞生理的产物。有几行证据支持这一归因。首先，根据文献，脂滴界面与细胞质其余部分之间的脂质折射率的急剧变化产生了高强度的THG信号¹¹．其次，为了排除可能产生高THG信号的激光损伤点，我们对未染色的菌丝进行了TPEF成像，结果显示，在同一菌丝的THG图像上，autoTPEF图像没有任何突出的斑点。第三，我们进行了共定位实验，用脂质特异性染料对菌丝进行染色，并用TPEF和THG法进行成像。这两幅图像上的斑点大部分是重叠的，这证实了这些斑点中含有脂质。此外，按照折射率急剧变化的相同逻辑，我们已经证明了用THG方法可以对无标记菌丝中的细胞壁和细胞膜进行成像和区分。

关于脂质斑点的成像，有许多需要讨论的注意事项。由于同时检测两种信号(TPEF和THG)，可以使用有限数量的染料进行实时成像。在本研究中，固定不是一种选择，因为它改变了ld的结构⁸⁷．这项研究中使用的染料尼罗河红可能对ld没有特异性，它可以与细胞中的其他物体和结构结合⁸⁸．来自非ld结构的信号会渗入检测波段，最终影响共域度。此外，来自细胞壁的强THG信号进一步恶化了共定位程度。与TPEF成像相比，THG成像需要更高的激光功率。正因为如此，当同时检测两个信号时，人们必须在应用激光功率方面做出权衡。这种折衷的代价是THG图像中某些结构的损失(例如，小的ld，否则在较高的激光功率下可见)，以及失焦ld产生微弱、模糊的TPEF信号(否则在较低的激光功率下不可见)。

为了从THG图像中提取定量数据，采用了颗粒尺寸分析(PSA)和图像相关光谱(ICS)两种图像分析方法。这两种方法都可以量化脂滴的数量及其平均大小(直径)。由于ICS主要用于荧光图像和聚类分析，据我们所知，到目前为止它还没有用于THG图像，我们通过将结果与PSA进行比较来测试它。试验对菌丝在正常和应激(氮饥饿)条件下的图像进行。已知氮饥饿会导致脂滴数量增加^72，73两种方法得到的数值吻合较好。

总的来说，所提出的成像方法(THG)和图像分析方法(ICS)被证明适合于产油真菌脂滴的无标记体内研究。将THG方法应用于真菌脂滴动力学的未来研究，有助于促进对真菌细胞生理学的基本认识，进而有助于对自然界碳循环过程的基本认识。