突变斑马鱼模型屈光不正候选基因的gwas后筛选

屈光不正(RE)是最常见的眼部疾病，当眼睛的光学与眼睛的生物特征不匹配时就会出现。尤其是近视眼，在过去的几十年里发病率迅速上升。这种RE与眼部疾病有关，如近视性黄斑变性、青光眼、白内障和视网膜脱离，因此正成为日益常见的致盲原因^1，2，3.．

在过去十年中，全基因组关联研究(GWASs)一直专注于剖析RE背后的遗传因素。2018年，Tedja等人在一项大型(160,420名参与者)GWASs元分析中确定了161个与RE相关的位点⁴．通过Hysi等人的GWASs元分析，该列表在2020年扩展到449个位点，包括来自英国生物银行、GERA、23andMe和CREAM财团等各种研究的542,934名混合祖先参与者⁵．研究人员将可能参与视网膜-巩膜信号级联通路的候选基因标记到已识别的位点，并提出了(cat)离子转运、神经传递、神经元发育、细胞-细胞粘附和细胞外基质重塑等疾病机制^4，5，6．然而，探索这些候选基因的功能作用并因此验证GWAS发现的研究仍然很少。这项功能研究的目的是评估候选RE基因在控制屈光不正方面的潜力，以斑马鱼为模型。我们之前已经证明斑马鱼是研究RE的有效模型^7，8，与传统上使用的鸟类或哺乳动物模型相比，这种方法在时间和成本上都有显著改善。用斑马鱼，我们之前已经证明了消耗GJD2(位于全基因组顶部相关信号之一)导致RE的发展⁸．

在这项研究中，我们研究了另外9个GWAS候选基因(TJP2，PDE11A，SHISA6，LAMA2，LRRC4C，KCNQ5，GNB3，RBFOX1,GRIA4)，根据统计学(例如，GWAS研究中相关单核苷酸多态性(SNPs)的效应量)和生物学(例如，眼功能和表达)证据对其在RE发育中的功能作用进行了优先排序。在这里，我们展示了这些候选基因中的三个在决定眼睛大小方面具有潜在的作用。

基因的优先级

我们从最近的GWAS荟萃分析中对相关位点中的候选基因进行了优先排序^4，5．优先级是基于统计和生物学证据，即(1)效应量(大)和P-value (low)对应的snp;(2)眼组织表达;(3)参与文献中描述的途径;(4)存在一种斑马鱼同类;此外，(5)通过评估locuszoom图(即关联信号相对于候选基因的基因组位置以及基因在该区域的位置)对位点进行区域可视化⁹)．最终的选择包括9个顶级候选基因;TJP2，PDE11A，SHISA6，LAMA2，LRRC4C，KCNQ5，GNB3，RBFOX1,GRIA4(详见补充数据)S1)．9个候选基因的细胞特异性表达是从已发表的数据集中检索的^{10，11，12，13}，请参见方法部分。基因的眼部分布的总结可以在图中找到。1及补充资料S1．根据检索到的数据，所有9个基因都在神经视网膜中表达^{10，11，12，13}While表达式TJP2，PDE11A，SHISA6，LAMA2，KCNQ5,GNB3也存在于RPE细胞中^11，14．此外，所有候选基因都在脉络膜的细胞中表达，包括:内皮细胞(TJP2，PDE11A，LAMA2，LRRC4C，GNB3）;周(TJP2，LAMA2，GNB3，GRIA4）;黑色素细胞(TJP2，KCNQ5，RBFOX1）;成纤维细胞(TJP2，PDE11A，SHISA6，LAMA2，LRRC4C，GNB3，RBFOX1，GRIA4）;免疫细胞(TJP2，PDE11A，LAMA2，RBFOX1）^11，14．TJP2，LAMA2，LRRC4C，KCNQ5，GNB3，RBFOX1,GRIA4在角膜中也有表达¹⁵．

斑马鱼眼睛中候选基因的表达及突变斑马鱼的产生

因为硬骨鱼的部分基因组复制¹⁶， 9个候选基因中有7个由两个斑马鱼同源基因代表;只有SHISA6而且LAMA2在斑马鱼中有一个同源基因。为了确认基因在斑马鱼眼组织中的表达，在以下发育阶段对斑马鱼整个眼睛进行逆转录酶PCR (RT-PCR):受精后4天(dpf);受精后1、2、3、6个月(mpf);1年。所有研究的基因都被发现在斑马鱼的眼睛中表达(图2)。2、补充数据S2)．使用CRISPR-cas9系统为9种(人类)候选基因的每种鱼产生突变斑马鱼株系(补充数据)S3)．根据斑马鱼信息网络(ZFIN)命名法来命名所生成的鱼系。对于每一行，诱导的移码突变都会导致一个过早的停止密码子，预计会导致一个被截断的蛋白质。用一种斑马鱼同源基因(即shisa6而且lama2)：shisa6^re15而且lama2^re16．一代的gria4a而且gria4b由于无法引入突变并对目标区域进行基因分型，导致系失败。对斑马鱼中剩下的6个基因产生了双突变体，其中有两个同源体:tjp2a^b1367tjp2b^b1368, pde11a^re13pde11a-like^re14, lrrc4ca^re17lrrc4cb^re18, kcnq5a^re19kcnq5b^re20, gnb3a^re21gnb3b^re22， rbfox1^re23rbfox1-like^re24(详见补充数据)S3有关诱导突变的详细资料)。的gnb3a^re21gnb3b^re22而且rbfox1^re23rbfox1-like^re24突变体在14 dpf后无法存活。因此，六个候选基因(Shisa6, lama2, tjp2, pde11a, lrrc4c, kcnq15)进行进一步表征。数字3.显示成功生成的突变体、突变和预测的截断蛋白的图形概述。

SD-OCT检测显示3个突变株系轴长增加

我们使用光谱域光学相干层析成像(SD-OCT)测量了所有6个突变系的轴向长度。为了将生物特征的眼内变化与产生的突变引起的潜在眼外变化隔离，我们研究了与WT鱼相同体长(最大变异< 1%)的突变鱼(n = 20只眼)(补充图)。S1)．

2 mpf时，2个突变株系轴长显著增加:lrrc4ca^re17lrrc4cb^re18(效应量= 140.0µm，p< 0.0001)和kcnq5a^re19kcnq5b^re20(效应量= 151.0µm，p< 0,0001)，相对于WT对照(图。4、补充数据S4)．在4强积金时，收入亦有相对增加lama2^re16(效应尺寸= 69.00µm，p= 0.0083)突变体;较大的轴长持续了lrrc4ca^re17lrrc4cb^re18(效应量= 114.0µm，p< 0.0001)和kcnq5a^re19kcnq5b^re20(效应尺寸= 92.00µm，p= 0.0044)突变体(图;4、补充数据S4)．轴长无明显变化shisa6^re15，tjp2a^b1367tjp2b^b1368,pde11a^re13pde11a-like^re14任一时期的突变体。

突变斑马鱼线的屈光状态

为了探索轴向长度的变化是否会导致屈光状态的改变，我们使用了一个自定义的偏心光折射率装置，如前所述^7，8．WT对照组的鱼(n = 20只眼睛)显示出正的基线屈光状态(图2)。5、补充数据S5)．在以前的研究中也发现了这一点，主要归因于小眼视网膜镜的伪影^{7，8，17，18，19}．与我们的生物特征数据一致，屈光状态在2强时发生近视转移lrrc4ca^re17lrrc4cb^re18(效应大小=−3.4D，p< 0.0001)和forkcnq5a^re19kcnq5b^re20(效应大小=−2.4D，p= 0.003)。5、补充数据S5)．的lama2^re16突变体在2mpf时也表现出明显的近视折射(效应量=−1.4D，p= 0.018)。同样，在4强时也检测到近视转移lrrc4ca^re17lrrc4cb^{re18 - / -}(效应大小=−1.2D，p= 0.003),kcnq5a^re19kcnq5b^re20(效应大小=−2.6D，p< 0.0001)和lama2^re16(效应大小=−2.0D，p< 0.0001)(图5、补充数据S5)．

在2和4强时，未发现屈光状态的变化pde11a^re13pde11a-like^re14而且shisa6^re15突变体。然而,tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体表现出屈光状态的远视偏移(效应值= + 2.1D，p= 0.001)。5、补充数据S5)．与三个近视突变体相比，tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体轴长无明显变化。然而，在OCT数据中，我们观察到晶状体直径的增加tjp2a^b1367tjp2b^b1368相对WT透镜的4mpf (Δ增加= 26.70µm，p= 0.035)(补充数据S4)．我们假设突变体的远视屈光变化是由于晶状体形状的改变，从而导致晶状体曲率减小。为了验证这一假设，我们比较了4个离体晶状体(每组n = 10条鱼，n = 20个晶状体)，发现突变体和WT晶状体的圆度均为1，这表明突变体和WT晶状体的晶状体直径和体积均有增加tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体(见补充图)S2a, b和方法)。接下来，我们使用4强SD-OCT数据测量前透镜半球曲率的变化。在这里，我们发现晶状体的弧度明显下降tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体(补充图。S2c).曲率的减小可能导致焦距的增加和屈光不正中检测到的远视移位。

所选基因导致屈光不正表型的地形概况

视网膜作用的特征lama2，lrrc4ca，lrrc4cb，kcnq5a,kcnq5b,我们用原位杂交技术研究了1岁WT鱼的表达和地形分布。的表达lama2主要出现在内核层(INL)，而在外核层(ONL)则较少(图2)。6a).两者的表达lrrc4ca而且lrrc4cb在ONL和INL中观察到。6b, c)。lrrc4ca在光感受器层(PL)中也被适度检测到，而lrrc4cb神经节细胞层(GCL)中也有。kcnq5a在GCL、INL、ONL和PL中表达(图2)。6d)和kcnq5b局限于INL和ONL(图;6e). ISH显示这些近视候选基因均在斑马鱼视网膜中表达。

尽管GWASs已经成功地提供了对诸如屈光不正等复杂性状的遗传结构的洞察，但GWASs并没有提供关于因果变异或其功能作用的信息。在本研究中，我们提出了一种候选基因方法研究，目的是使用突变斑马鱼模型验证和探索re候选基因在眼睛中的功能作用。我们优先选择了在之前的RE GWASs中发现的9个候选基因，并使用CRISPR/cas9技术生成突变斑马鱼。在6个突变系中可以进行眼部屈光不正筛查，在其中3个突变系中，我们观察到近视表型:lama2^re16，lrrc4ca^re17lrrc4cb^re18，而且kcnq5a^re19kcnq5b^re20．在我们的ISH研究中我们证明了这一点lama2，Lrrc4ca, lrrc4cb, kcnq5a和kcnq5b根据我们在已发表的scRNA-seq数据库中的搜索结果，斑马鱼视网膜中都有表达，并支持了先前的观点，即视网膜(及其复杂的信号级联)作为一个整体参与了正视和屈光不正的发展。我们的研究提供了新的体内模型，将有助于解剖导致RE发展的途径。

该突变体rs12193446，位于人类的内含子58LAMA2基因(NM_000426.4)与RE的相关性最强P-value of = 9.87 × 10⁻³²⁸在最大的GWAS元分析中^4，5．目前尚不清楚这种深内含子变异是否真正具有因果关系，因为其潜在的功能影响尚未阐明。然而，在我们的候选基因方法中，我们发现在4mpf处轴长增加lama2^re16突变，而屈光不正在2和4强时均被检测到近视转移。SD-OCT和光折光在可检测变化的发生上的差异可能是由于这两种方法之间的敏感性和方法上的差异。在我们的原位杂交研究中，我们观察到斑马鱼lama2主要在INL中表达。先前对鸟类和啮齿动物组织的研究也报道了视网膜神经节细胞(RGC)的表达。^20.和脉管系统^21，22．

在之前的斑马鱼研究中，突变lama2导致严重肌营养不良表型和8 - 15 DPF之间的生长异常^23，24，25．与这些先前产生的突变系相比，我们的lama2^re16突变体没有表现出游泳异常，宏观上可见的生长缺陷或早期死亡，然而，需要对肌肉纤维组成进行更全面的研究，以排除肌肉组织的退化。的lama2^re16本研究中使用的突变体包含移码突变，并预测早期外显子的停止增益(#3)，预计将导致无意义介导的衰变或至少是早期终止和Lama2蛋白的严重截断。而之前报道的lama2模型携带高度保守的氨基酸残基突变，映射到lama2的球状结构域，已知会导致人类肌肉萎缩。值得注意的是，没有严重的早发性肌营养不良的表型lama2^re16，创造了关注突变的眼内后果的可能性，即RE发育。在人类中，基因突变LAMA2以及两个相关基因的突变:DAG1而且ITGA7这两种基因都编码LAMA2受体，已知会导致肌肉萎缩^{22，26，27，28，29}．在之前的GWAS荟萃分析中，这三个基因都与RE显著相关⁵．常见变体之间的关系LAMA2，DAG1而且ITGA7与近视有关的基因突变导致肌肉营养不良的基因突变尚不清楚。研究表明了层蛋白的作用，包括层蛋白α -2和视网膜血管基底膜的完整性。此外，已知双等位基因致病性变异的患者LAMA1(引起Poretti-Boltshauser综合征，OMIM #615960)发展为高度近视的症状之一。耗竭后的近视表型lama2在斑马鱼中，以及来自GWAS研究的有力证据支持了人类LAMA2导致近视。

Rs11602008，一个内含子变体LRRC4C基因(NM_001258419.2)，在多个GWAS荟萃分析中一直与RE相关^4，5，30.．该变体已被注释为LRRC4C编码netrin-G1配体(NGL-1)的基因。NGL-1是一种跨膜蛋白，已知与其突触前配体Netrin-G1一起促进发育中的丘脑神经元的神经突生长^31，32．此外,Lrrc4c/NGL-1缺失抑制雄性小鼠海马兴奋性突触的发育和功能³³．虽然视网膜的功能LRRC4C/NGL-1尚未被描述，我们在检索到的scRNA-seq数据库和我们的ISH研究中观察到人类LRRC4C和斑马鱼lrrc4c基因都在神经视网膜中表达。因此，的潜在作用LRRC4C在视网膜中，类似于丘脑，也可以在发育过程中寻找轴突引导的方向，在控制视网膜布线中发挥作用。在斑马鱼中，我们发现了潜在的损失lrrc4c导致眼轴伸长和屈光状态的近视转移。斑马鱼缺失引起的视网膜信号缺陷lrrc4c/Ngl-1和发育中的突变斑马鱼的视网膜线路可能会干扰emomtropization过程。视网膜-巩膜信号级联的确切机制，由于潜在的缺乏lrrc4c,可能导致轴向伸长仍有待阐明。探索下游转录组变化的研究lrrc4c将为这个过程提供更多的见解。

的内含子1中的rs7744813 SNPKCNQ5(NM_019842.4)与近视相关的多项独立GWAS荟萃分析^4，5，30.．此外，rs7744813和其他四个KCNQ5基因多态性也与高度近视有关³⁴．在这项研究中，我们描述了人类KCNQ5和斑马鱼kcnq5a / kcnq5b广泛地表达在整个视网膜和潜在的损失kcnq5导致斑马鱼近视。KCNQ5编码名为Kv7.5的电压门控钾通道。已经证明KCNQ5/kv7.5在大脑中调节m型电流^35，36视网膜色素上皮(RPE)和神经视网膜^37，38．Yang et al. 2021显示了两者之间的潜在关系KCNQ5以及缺乏形态的豚鼠近视的发展。作者报告说，视网膜KCNQ5明显下调，并提出这是由于增加钾浓度或减少m型钾电流密度的RPE细胞形态剥夺豚鼠眼睛³⁹．然而，在我们的研究中，眼轴伸长和相应的屈光不正(近视)偏移被观察到是由于潜在的缺乏kcnq5在斑马鱼。因此，在豚鼠模型中，事件发生的顺序可能是:形体剥夺型近视;其次是m型钾电流的下调和损伤;导致眼轴性生长。另一项研究提出，表达模式或功能的改变KCNQ5影响视网膜双极细胞信号产生的时间响应光感受器的光诱发反应⁴⁰．这些改变的双极细胞反应可能会增加近视的易感性。我们在斑马鱼中的发现支持了在其他动物模型中报道的发现，这些模型显示了两者之间关系的证据kcnq5和近视。未来研究KCNQ5(Kv7.5)选择性钾通道开启器或抑制剂可能会导致新的近视治疗方法的发现。

除了观察到的近视表型lama2^re16，lrrc4ca^re17lrrc4cb^re18，而且kcnq5a^re19kcnq5b^re20变种人，我们发现tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体在4mpf时表现出屈光状态的远视转移，然而，轴向伸长没有相应的减少。这可能是晶状体组织中紧密连接的潜在损失的直接影响tjp2a而且tjp2b似乎在斑马鱼幼虫的晶状体中有适度表达^41，42．斑马鱼不能适应由于前庭牵开迟缓^43，44，45此外，斑马鱼的角膜对水中的光功率没有贡献^46，47，48．因此，屈光不正很可能是由焦距的增加引起的，即透镜直径的增加和曲率/球度的减小。为了评估我们的假设，我们研究了WT和tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变镜头;这带来了局限性，因为我们没有执行光功率的绝对计算。理想情况下，镜头的正面和背面都应该被测量，然而在SD-OCT扫描中，镜头的背面由于镜头效应而变形，导致图像变形。尽管如此，由于我们在体外测量的完美球形，我们假设透镜的前面和后面是相同形状的。我们的晶状体评估的最后一个局限性是，我们只考虑了外层皮层区域和上皮细胞的变化，而没有考虑深层皮层和核层光学特性的潜在变化。在本研究中，我们发现了一种潜在的透镜功能tjp2a而且tjp2b然而，未来的研究需要对分子和光学的变化进行深入的描述tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变镜头。

在我们的筛选中，我们没有观察到眼显型pde11a^re13pde11a-like^re14而且shisa6^re15突变体。然而，本研究的一个局限性是缺乏所研究的斑马鱼蛋白质的特异性抗体，这限制了我们在蛋白质水平上通过western blot或免疫组化来确认所产生的突变等位基因的作用。因此，基于这些结果，我们不能排除这些基因可能参与调节眼睛大小。

解释GWAS的发现是具有挑战性的，不仅需要识别因果变异，还需要识别变异的分子效应，相关基因的作用，以及相关的细胞类型和途径。在本研究中，我们提出了一种候选基因方法，以应对缺乏探索候选基因在屈光不正发展中的潜在作用的功能性研究。我们对9个候选基因进行了优先排序，筛选了6个突变斑马鱼模型，并在3个突变系中发现了近视表型(lama2^re16，lrrc4ca^re17lrrc4cb^{/ re18−−},kcnq5a^re19kcnq5b^re20)．近视的表型特征是眼轴长度的增加和屈光状态的负移。这些发现表明，从GWAS中选择的个体强相关候选基因的缺失可以诱导近视屈光不正。考虑到复杂近视是由SNPs和基因的互加引起的共识，这些单一候选基因在耗尽时导致屈光状态的显著变化是有趣的。我们的研究结果表明，当这三个候选基因被耗尽时，它们独立地决定了轴长。近视的lama2^re16，lrrc4ca^re17lrrc4cb^{re18 - / -},kcnq5a^re19kcnq5b^re20突变体可用于进一步研究近视眼轴长和近视干预措施发展背后的信号级联。

在已发表的转录组数据集中查找候选基因

候选基因的视网膜表达通过三个独立发表的成人视网膜单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集进行评估^10，11，12以及人类蛋白质图谱¹³．在神经视网膜外，我们从视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜中检索了scRNA-seq数据¹⁴、角膜¹⁵．人类巩膜和晶状体组织的单细胞表达研究尚未发表;因此，这些组织在本次评估中未被考虑。

鱼线和鱼壳

利用WT-AB斑马鱼的CRIPSR-cas9生成突变系。设计单导rna (sgRNA)(补充数据S3)并根据CRISPRscan协议合成(http://www.crisprscan.org）⁴⁹．sgRNA合成的寡核苷酸分别包括:5’T7启动子序列(aattaatacgactcactata)、靶位点序列和环序列(gttttagagctagaaatagc)。该寡核苷酸与一个互补环寡核苷酸(aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagcctttttttttaacttgctattttctagctctaaaac)结合，其中包括用于Cas9识别的RNA环。进行PCR生成DNA引导寡核苷酸，然后用T7 megascript试剂盒(ThermoFisher)转录sgrna。结合sgRNAs和Cas9蛋白，在WT AB卵单细胞期注射1 nl(终浓度1500 pg/nl)^49，50，51．该协议的更多细节可以在Vejnar等人2017中找到。通过Sanger测序验证诱导突变，并将建立子杂交产生纯合子敲除鱼。对斑马鱼中具有多个同源基因的基因进行双敲除(补充数据)S3)．的tjp2a^b1367而且tjp2b^b1368线条之前在俄勒冈大学生成⁵⁰．这些行被交叉以生成tjp2a^b1367tjp2b^b1368本研究中使用的线条。鱼线在鱼缸中饲养，数量大小相匹配。对于光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)和光折射，使用0.016%三卡因甲烷磺酸溶液(MS222, Sigma Aldrich)麻醉斑马鱼，缓冲至pH = 7。所有动物的治疗均符合荷兰动物福利立法和荷兰鹿特丹Erasmus医疗中心实验动物卫生保健中心(EDC: Experimenteel Dier Centrum)的指导方针，并符合欧盟委员会理事会指令2010/63/EU (CCD批准，许可证AVD 1010020186907)。在这项研究中，我们遵循了在arrival指南中描述的报告建议。所有斑马鱼都暴露在28.5°C的14小时光照:10小时黑暗循环中。

斑马鱼眼睛RNA的分离及表达分析

从4条dpf (n = 20头)、1条mpf (n = 8眼)、2条mpf (n = 6眼)、3条mpf (n = 5眼)和12条mpf (n = 4眼)中采集去核眼。在立体显微镜(徕卡m80)下取出镜片，收集组织并在液氮中冷冻。使用500 μ l Trizol试剂(Ambion)提取RNA，然后使用手持均质器(Pro 200, Pro scientific Inc.)均质2 × 5秒。匀浆在室温(RT)下放置5分钟，加入200µl氯仿(Sigma Aldrich，≥99%)。样品在RT下孵育15分钟，在4°C下以最大转速离心15分钟。接下来，收集上部部分，并使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取RNA。使用Nanodrop (DS-11系列分光光度计/荧光计，DeNovix)对提取的RNA进行定量，并使用iScript cDNA Synthesis kit (BioRad)合成cDNA。cDNA转录物通过PCR和琼脂糖凝胶电泳确认，使用的引物集见补充数据S2．

光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)

按照Quint等人先前的描述进行SD-OCT测量和分析。⁸．在2和4强时分别测定各基因型鱼10条(20眼)。研究中包括的突变鱼相对于WT鱼的体长变化均小于1%(补充图)。S1)，排除了由于身体大小的显著变化而引起的眼部指标的变化。采用900 nm SD-OCT Ganymede系统(Thorlabs)。视场设置为1.7 × 1.7 × 2.2 mm, z方向像素深度为2µm。如前所述，使用定制的MATLAB软件分析眼部指标⁸，并利用各眼成分的特定折射率校正眼成分的尺寸;角膜1.33^46，47，48，透镜(梯度折射率)1.4^{46，47，48，52，53，54}前腔和玻璃体腔1.34，视网膜1.38^48，55，56．

古怪的光反射照相

斑马鱼眼睛的屈光状态是由偏心红外光折射率确定的。该协议的更多细节可以在其他地方找到⁸．分析是用自定义的c++软件完成的。在2和4 mpf下测定突变株和对照株。亮度梯度的斜率由100个独立的测量结果确定并平均。这一数值通过眼科镜片校正转换为屈光度的屈光误差⁸．

透镜球度和曲率测量

对体外分离的4强WT和晶状体进行晶状体生物测定tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变鱼(n = 10条鱼，n = 20个透镜)。我们假设测量的远视屈光变化tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变是由于晶状体形状的改变，其结果是晶状体曲率减小。这一假设是基于以下事实:(1)由于退化的牵开透镜，刚性晶状体不能适应^43，44，45(2)由于角膜在水中的贡献可以忽略不计(折射率:1.33)，所有的光功率都来自球面透镜。^46，47，48(3)我们观察到晶状体直径增加tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体。但由于虹膜色素对红外光的阻挡，不能直接从SD-OCT数据判断球度的变化。为了克服这一限制，我们通过比较4个离体晶状体间接评估了晶状体的球度。镜头放置在光学显微镜(Olympus DP72)下，并从3个不同角度拍摄(Olympus U-TV0.63XC)。我们使用大圆(中平面)的圆度，从三个不同的角度测量，作为每个透镜的圆度的代理(圆度是在斐济测量的(ImageJ))。我们观察到，突变体和WT透镜的所有三个位置的圆度都等于1(补充图。S2b).这种圆度/球度守恒意味着透镜直径的增加tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体在各轴向分布均匀。这种透镜直径和体积的均匀增加，即当球度保持与WT透镜相同时，导致透镜曲率的减小。为了证实这一发现，我们还在4强WT和4强SD-OCT数据中直接测量了前透镜半球曲率的变化tjp2a^b1367tjp2b^b1368突变体(n = 10条鱼，n = 20个透镜)。分析是在斐济(ImageJ)使用Kappa插件进行曲率测量。

原位杂交

一岁大的WT斑马鱼解剖眼睛在4%多聚甲醛(PFA)中保存两天，使用EFTP组织处理器(Intelsint)固定，切片前用石蜡包埋。使用切片机(Microm HM 335 E)按照标准协议对嵌入的眼睛进行切片。将石蜡切片(6µm)转移到Superfrost载玻片(VWR)中，并在37°C下干燥。部分在二甲苯deparaffinized 5分钟和10分钟,100%乙醇为5分钟,10分钟的70%乙醇,PBST(1×磷酸缓冲盐0.1% Tween-20) 5分钟。部分固定在4% PFA的20分钟,洗PBST pre-hybridization前5分钟的预热HYB +缓冲(50%的甲酰胺,5×SSC(柠檬酸Saline-sodium), 50µg / ml肝素,500µg / ml tRNA, Tween-20 0.1%,和aqua dest)在68°C的1 h。感觉和反义调查(见补充数据S2)在HYB +中稀释，在95°C下加热2分钟，并在冰上冷却至所需。切片与探针在68°C的潮湿室中杂交过夜。切片在68℃的预热洗涤缓冲液(50/50 HYB-(50%甲酰胺，5 × SSC, 0.1% Tween-20, aqua dest)/0.2 × SSC)中洗涤15分钟，在68℃的预热0.2 × SSC中洗涤2次30分钟。50%;25%;将切片用阻断液(2%羊血清，2 mg/ml牛血清白蛋白(Sigma Aldrich)在PBST中)在RT下阻断1小时，然后用抗digg - ap抗体(Anti-Digoxigenin-AP, Fab片段，1:2000,Roche)稀释在阻断液中孵育(过夜，4°C)。切片在PBST中洗涤3次15分钟，在染色缓冲液NTMT (1 M Tris (pH 9.5)， 1 M MgCl2, 5 M NaCl, 10% ten -20)中洗涤2次5分钟。染色溶液(12 μ l NBT/BCIP (Roche) / 1 ml染色缓冲液)涂在切片上，并在暗处rt孵育。孵育时间因探针组而异，从1小时到2天不等。切片分别在PBST中洗涤3次，15分钟，蒸馏水中漂洗，分别在95%和100%乙醇中水化1分钟，最后暴露于二甲苯中2次，2分钟。载玻片用Entellan (Sigma Aldrich)安装，37°C干燥一夜。在Olympus DX40显微镜和Olympus DP73相机上进行成像。图像处理采用Olympus cellSens软件。

统计分析和样本量估计

我们通过拟合GraphPad Prism 8.0中实现的混合模型来分析SD-OCT和光折射率。该混合模型采用复合对称协方差矩阵，并采用限制极大似然(REML)进行拟合。在这个模型中，同一条鱼的两只眼睛都被视为重复测量。Grubbs检验检测异常值(p< 0.01)，排除在分析之外。体长测量用Welch 's ANOVA分析，也在GraphPad Prism 8.0中。

为了估计SD-OCT和光折变评估的样本量，我们使用了GLIMMPSE软件⁵⁷重复测量。估计的效应大小(即轴长约4%的变化和光折射率约6%的变化)是基于先前的研究⁸， alpha-error设置为0.05,power设置为0.95。根据这些参数，每组最少需要20只眼(10条鱼)(幂= 0.953)。