诱导质粒拷贝数控制常用的合成生物学大肠杆菌菌株

基因表达调控方面在各种情况下,从减轻控制,实现细胞的细胞毒性检查站和生物分子设计反馈控制器^1,2,3。在转录水平、合成调控主要是通过化学诱导转录因子(TFs)重新改造的自然系统的代谢工程^4,5、蛋白质的生产^6,7,若^8,9,从而为系统提供强大的工具和合成生物学¹⁰。通过基因组挖掘这个曲目是不断扩大的方法^11,12,13、定向进化管道^10,14,合理的设计策略^15,16。补充转录控制,一个强大的工具集合在平移使基因表达调控水平,包括ligand-inducible riboswitches^17,18和RNA-triggered监管机构^19,20.。这些技术都使精确和动态控制基因表达的转录和翻译活动的维度。

增加这些工具,DNA质粒代表的生物工程提供了一个简单的平台引入遗传结构细胞,呈现他们的即插即用设计基因电路的基本工具。但是,与灵活的控制在转录和翻译水平,操纵基因表达在DNA水平通过质粒拷贝数(PCN)是相当多的限制。通常,基因电路是插入一组质粒,每一个都有不同的固定PCN,然后分别介绍给宿主生物体,依靠耗时且容易出错的克隆和转换步骤。使灵活PCN控制,当前解决方案要么局限于特定的菌株^21,22,23或者需要多个质粒^24,25,26,因此没有人提供(i)灵活和动态PCN的监管;(2)可移植性跨多个菌株;为简单的即插即用部署和(iii)不合群的基因电路。

为了克服这些限制,我们现在DNA质粒郁金香(可调配体诱导质粒),配备上述三个关键属性。郁金香的设计是基于自动调压pSC101复制起源的机制,这是重新配置和补充额外的监管组件都拥有郁金香,确保不合群和可移植性。荧光技术后细胞排序优化关键参数参与合成的复制的规定,郁金香可以诱导的PCN的枯茗酸(弟弟)在一个广泛的动态范围,跨越两个数量级。在常用的郁金香显示强劲的行为大肠杆菌菌株(NEBStable DH10B、NEBExpress BW25113,和MG1655)和增长媒体(M9-Glucose M9-Glycerol,溶原性汤,和超级最佳汤)。我们通过多个应用实例说明,郁金香使动态PCN控制不仅加速基因回路的设计和优化,而且还促进模块的原型和回收在不同的遗传背景。

本文组织如下。我们首先提出监管架构和设计和筛选步骤支撑郁金香在一个质粒的实现。第二,我们展示郁金香的关键属性:可移植性,PCN的控制,以及基督教民主党动态质粒的稳定性。接下来,我们说明其实用性和影响考虑的设计、优化、重用,和共同合成生物学的原型模块。最后,我们将演示如何利用郁金香的模块化架构结合CRISPRi-module扩展PCN的输入控制的弟弟之外,增加它的多功能性。

重新配置为控制诱导PCN pSC101起源

验证利用PCN的潜力来控制基因的表达,我们首先本构特征sfGFP生产使用图书馆的质粒(fPCN集合)和一系列固定PCNs²⁴。为此,我们认为是野生型(WT) pSC101起源的复制,配备了一个严格的控制机制确保质粒是每细胞维持在大约三份^27,28依靠RepA的紧密的自动调整机制,质粒复制起始因子Ori地区(无花果。1)。在这个方案中,PCN是由两个相反的力量的平衡。首先,RepA以单体的形式结合Ori网站,促进质粒复制初始化,因此移植PCN。第二,在较高的表达水平,化学活性RepA作为转录抑制因子抑制自己的表情,除了隔绝其单体的形式,从而表达下调PCN稀释。

而其他因素也会影响pSC101副本的监管^29日,30.,(PCN在很大程度上取决于单体的比率以及基督教民主党二聚的形式的RepA平衡^31日。引入突变在RepA二聚接口(例如,通过氨基酸替换)改变RepA单体的结合动力学和调节离解常数,从而导致突变体变异配备不同的固定PCNs^24,32,33。例如,在NEBStable大肠杆菌细胞fPCN集合提供了一个大约20倍PCN范围和比例基因表达水平的记者蛋白质sfGFP(无花果。1 b)没有明显的扰动增长率(补充图。1)。

证明PCN可以灵活调节,我们接下来构建two-plasmid系统(无花果。1 c)。第一个质粒港口RepA编码序列图。1 b从枯茗acid-inducible子PCymRC表示。关于repA变体在第一个质粒,我们选择弱的二聚作用强度的变异(RepAv7)有效地移除负面反馈在无花果。1。这个质粒与WT pSC101 co-transformed质粒携带本构sfGFP基因,加上WT repA基因,产生微不足道的基底repA表达由于紧张的负面反馈^27,28。的架构图。1 cpSC101利用模块化结构的起源:在与枯茗酸感应,RepAv7表示从第一个质粒,然后作为一个单体相互作用让网站的第二个质粒,因此其PCN上调。这是在图确认。1 c,产生一个表达式所观察到的范围可比当使用fPCN收集在无花果。1 b(枯茗酸的细微差别没有最有可能是由于漏RepAv7 PCymRC)的表达。因此,中间构造图。1 c表明,诱导RepAv7表达式可以控制PCN依靠two-plasmid架构。为了确保独立的诱导PCN控制,我们下一个集成控制方案在单一质粒。

实现诱导PCN控制在一个质粒

灵感来自于WT pSC101复制(图的起源。1),我们设计了一个装有可调auto-regulatory控制(图合成变体。2),窝藏所有必需的管理组件。特别是RepAv7和诱导CymRAM抑制TF是放置在一个多顺反子配置PCymRC启动子。这样,调节了PCN RepAv7的单体的形式,而通过化学活性形式是有效地消除负面的反馈(由于RepAv7)的严重削弱二聚作用能力。的差别,对这些基因通过CymRAM PCN现在意识到。此外,这种影响可以通过枯茗酸调节:在其之外,RepAv7的镇压CymRAM松了一口气,产生更大的前者,最终导致增加质粒复制。达到平衡的积极影响RepAv7平衡的负面影响CymRAM RepAv7表达式,确定PCN的架构图。2。

作为紧急PCN控制取决于上述两种力量的微妙的平衡,我们下一个优化RepAv7和CymRAM翻译利率。为此,我们构建了四个质粒库通过引入随机突变的苏格兰皇家银行RepAv7 (N7或N3)和CymRAM (cym1、B0034 B0032或N3),连同本构sfGFP磁带作为代表PCN量化使用荧光技术筛选(图。2 b)。库程序集变成了NEBStable细胞和特征荧光激活细胞分选仪(流式细胞仪)。随着N7-B0034图书馆最大的多样性(补充图显示。2),它被选中作进一步处理。首先,我们执行四个额外的流式细胞仪筛选来确定较低的细胞sfGFP表达式没有枯茗酸(补充图。3),那么40殖民地随后被手动选择。依靠标实验来描述这些殖民地的增长速度和响应能力,枯茗酸(表明诱导PCN行为),十变体选择(补充图。3)作进一步鉴定使用一系列枯茗酸浓度。

荧光强度表现出相当大的人口分布变化对所有选定的殖民地,特别是在低枯茗酸浓度(补充图。4),这意味着潜在的过剩RepAv7积累。增加RepAv7的去除率,我们下一个退化的影响特征标签融合RepAv7人口分布的荧光强度。两个moderate-weak退化标记选择和测试使用一个殖民地的宽动态范围:ASV和AAV³⁴。变体与这些标签显示类似的性能显著降低群体的分布差异荧光强度在低浓度的枯茗酸(补充图。5)。最终设计的郁金香,AAV标签被选中的变体。

single-plasmid设计优化和筛选后的郁金香,我们在PCN枯茗酸诱导的影响特征,sfGFP表达式,和增长率(无花果。2摄氏度)。依靠qPCR测量,郁金香的PCN之间可以调制2.9(±0.7)和50.9 (±6.8)NEBStable细胞。此外,sfGFP生产相关线性PCN回应我们的观察固定复制变异在无花果。1 b。最后,增长速度峰值没有明显的依赖PCN归纳法,强调,虽然郁金香提供诱导PCN控制,这并不是减少细胞的健康。

郁金香在各种便携大肠杆菌菌株

郁金香是设计和实现一个自包含的时尚(图。2),使基因回路的即插即用表达式和测试各种各样的大肠杆菌菌株。这种方式灵活PCN控制是实现不依赖特定的菌株,或额外的DNA质粒表达质粒复制因子或其他控制蛋白质^21,22,23,25。进一步验证一系列的可移植性的郁金香,我们它的行为特征考虑四个常用的大肠杆菌(图。3)跨越多个应用程序域包括质粒克隆(DH10B)蛋白表达(NEBExpress),代谢工程(BW25113)和微生物模型菌株(MG1655),除了NEBStable(无花果。2)。

转换后,感应与枯茗酸在所有这些菌株通过qPCR实验证实,郁金香使灵活PCN控制独立于主机(无花果。3 b)、流式细胞术显示,前面观察到大约线性PCN和本构关系sfGFP表达式也保留(图。3 c)。此外,依靠标实验,我们得出结论,归纳的郁金香强加微不足道的宿主的代谢负担增长率仍然几乎不受影响(图。3 d)。这些结果证实郁金香可以成功部署灵活PCN跨广泛的控制大肠杆菌菌株(也在不同的媒体中常用实验微生物,如M9-Glucose M9-Glycerol,溶原性汤,和超级最佳汤,见补充图。7),虽然定量性能显示相当大的strain-to-strain差异³⁵与系统发育,增加距离(见补充部分1.3更多的细节)。例如,郁金香显示高度敏感的反应在NEBExpress枯茗酸,乙紧张大肠杆菌,尤其是相比,进步和定期空隙PCN控制在k - 12株。这可能源于缺乏一些蛋白质降解机械NEBExpress(呈现乙紧张大肠杆菌蛋白表达的首选主机),可能导致RepAv7的过度积累。这反过来导致高架PCN枯茗酸浓度较低以及基督教民主党高度敏感的反应增加诱导物的水平,尽管这个问题可以很容易地减轻通过考虑一个细的枯茗酸浓度梯度(补充图。8)。

(PCN可以动态地调节以及基督教民主党可靠维护使用郁金香

郁金香承诺的设计和实现灵活可靠PCN监管随着时间的推移,通过简单地改变枯茗酸浓度增长的媒体。为了验证这一点,结合太极拳。生物恒浊器平台³⁶下(i)与流式细胞术分析,我们证明了PCN可以动态监管;和(2)质粒的稳定性。

证明多选点修改可以实现相同的细胞群,连续使用太极文化进行了实验。生物恒浊器平台³⁶保持恒定的细胞密度和监测为超过50代sfGFP表达式。图中的荧光数据4显示,PCN可以调整以及基督教民主党通过枯茗酸考虑由低和维护到低浓度转换范围广泛,对增长率没有显著的影响。单细胞水平的分析样本每个转换前进一步证实了群体一致性。全民图中的数据。4结合单细胞流式细胞术分析补充无花果。9和10进一步揭示PCN可以调整在大约3 - 4 h(对应于3 - 5代)在所有测试枯茗酸诱导的水平。

关于质粒稳定性、群体和单细胞流式细胞仪数据补充图。9 b, c确认郁金香可以可靠地保持长时间(超过50代)在低和高PCN定位点与时间变化可以忽略不计。这些结果证实在时间尺度典型合成生物学实验中,郁金香可以部署相关质粒维护(即没有遇到挑战。,complete loss from the population, or toxic build-up due to runaway replication) in the presence of antibiotic selection, despite the random nature of plasmid segregation during cell division. In the absence of antibiotic selection pressure, however, TULIP is gradually lost, a phenomenon that is particularly pronounced at low Cuminic acid concentration (Fig.4 b)。

郁金香减少依赖克隆和转换

通过减轻我们依赖耗时且容易出错的克隆和转换步骤,郁金香加速基因模块的设计和优化。我们说明这一点,考虑两个生化传感器响应3 oc6-hsl (AHL)或香草酸(Van)。在这两种模块(图。5),一个特遣部队由质粒的表达,观察化学诱导激活转录启动子在绑定到目标其同源配体表达记者mScarlet-I (mScarI)。在无花果。5,不同枯茗酸诱导改变了PCN的郁金香窝藏传感器模块,因此我们可以实现多种转移曲线没有创建一个组合变异图书馆依赖笨重的克隆和转换任务,同时与耗时的筛查。

通过开放第三维度的基因表达控制,补充转录和转译监管,郁金香也可以用于描述代谢负担的影响,例如,当稀缺资源需要被重定向诱导后从一个基因的表达^37,38,39。产生的耦合是通过“等成本线”捕获之前发现当两种蛋白质表达质粒与固定的数字拷贝³⁹。而暴露的影响(PCN这些等成本线原来需要多个克隆以及基督教民主党转换步骤,郁金香,我们只需要一个。单层的传感器模块图。5我们生产输出(mScarI)如何影响特征的表达表达的既定的记者(sfGFP)。在这两种情况下,后者的产量大幅减少的激活前增加,恢复等成本线及其依赖PCN:增加枯茗酸结果呈现上行趋势。因此,模块存在在郁金香不仅概括预期的输入输出转移曲线,而且资源竞争的微妙的特征。尽管sfGFP表达,显著减少(PCN的郁金香以及基督教民主党的质粒与固定复制数字显示类似的和次要的变化由于资源竞争增加(补充图。13)。

郁金香促进重用模块在不同的上下文中

除了加速基因模块的设计和优化,郁金香也促进重用在上下文不同,他们最初是发展和特点。利用郁金香,在这里我们不仅揭示PCN控制促进设计以及基督教民主党如何优化主应变(DH10B),但也有一个成功的变体可以快速重用在一个中等应变(BW25113)配备不同的遗传背景。

我们说明这个通过专注于传感器模块从无花果。5。实现国家输出被认为是成功的,如果超过一个预定义的阈值(冲灰线在无花果。6)。来确定合适的候选人在主应变,可以合成一个库包含大量的候选人电路(例如,通过不同的启动子和苏格兰皇家银行的地区),然后克隆每个候选人与固定一组质粒拷贝数,和屏幕这个组合库找到合适的变体(使用正确的启动子、苏格兰皇家银行和固定拷贝数)。相反,与郁金香克隆只有一次,每个候选人都需要和PCN范围可以被有效地通过改变枯茗酸浓度。

这是显示在无花果。6透露,当LuxR表示从DH10B moderate-weak苏格兰皇家银行(B0032), PCN需要超过大约28来实现我们的目标状态,而强大的苏格兰皇家银行(B0034)大约6册每个细胞就足够了。不幸的是,成功构造主应变(例如,窝藏B0032变体的质粒PCN的30日和B0034变体PCN的质粒10)不一定在中等应变(图工作。6)。依靠质粒拷贝数固定,这就需要我们重新启动图书馆准备、克隆、转换和筛选在二级压力。相反,正如我们的基于模型的分析表明,传感器输出单调增加PCN(补充部分3.1),郁金香它足以调整枯茗酸感应确保PCN大约翻了一倍,而重新设计的传感器模块,证实在无花果。6两个变体。虽然没有保证改变仅仅PCN总是足够,大大减少克隆和转换步骤,郁金香加速基因模块的设计和优化,促进他们在不同的上下文中重用。

调整PCN通过郁金香尤其有益时,电路可能正常工作只有一个狭窄的范围内。根据我们的基于模型的分析(补充部分3.1),正是这样的传感器模块图。6 b。特别是,我们预计,虽然表达VanRAM使用moderate-weak苏格兰皇家银行(B0032)会导致单调枯茗acid-mScarI关系,增加PCN通过枯茗酸可以有负面影响在mScarI依靠强大的苏格兰皇家银行(B0034)。这是在图确认。6 b:尽管前满足灵敏度条件变体当PCN超过5份/细胞,后者产生令人满意的性能只有在狭窄的范围内的大约20-27副本每个细胞。这突显出,找到合适的PCN范围可能是至关重要的。虽然这任务需要相当大的克隆和转换步骤依赖于质粒拷贝数固定,与郁金香只有一个构造需要合成和测试在不同枯茗酸感应水平。此外,尽管BW25113 B0032变体可以很容易被重用通过进一步增加枯茗酸增加PCN大约5倍,迅速席卷可能PCN变体使用郁金香揭示了B0034变体可能不被重用在这个新的主机各部分无需修改。

重要的是,可以用类似的方法更复杂的电路优化strain-dependent性能在不同的主机和重用他们,正如我们在补充说明图。14。然而,尽管我们预计郁金香提供一个有价值的维度来优化基因电路的行为无论大小、灵活的有益影响PCN控制可能会需要补充与其他监管和克隆策略迅速增加电路的复杂性,由于越来越多的strain-dependent生物物理参数。

最后,图中的数据。6也显示出主要特征的基因部分自己。为了说明这一点,注意输出断开状态随PCN的无花果。6,但它仍然在无花果几乎未受影响。6 b。这表明PLuxB发起人拥有相当大的泄漏,而PVanCC启动子是严格监管而不是与基底表达式可以忽略不计。因此,当传感器在无花果。6 b建议选择一个变种与moderate-weak苏格兰皇家银行(如B0032)以确保一系列的可移植性,PLuxB启动子的泄漏表明传感器的无花果。6更强的苏格兰皇家银行(如B0034)与动态范围增加可以提供更高的性能。

郁金香可以促进基因电路原型

模块开发的郁金香也可以移动与固定的质粒拷贝数是后来在下游应用程序中使用。我们通过关注说明这裁判的拨动开关。40比传感器模块,支撑相当丰富的动力学在无花果。5和6潜在的双稳态。

我们考虑的标准实现切换开关⁴¹与mKate2 LacI(中的)和TetR(中的eGFP)抑制对方(图。7一个)。因此,添加IPTG / eGFP的aTc导致upregulation mKate2 mKate2 / eGFP的差别,对这些基因,分别。确保稳态浓度LacI / TetR下游的输入动态范围匹配模块、蛋白质表达水平可以通过修改基因部分本身(例如,通过调整启动子和苏格兰皇家银行的优势);然而,这种组合图书馆的方法需要大量的克隆和转换。另外,使用郁金香,我们可以通过控制调整PCN通过添加枯茗酸无需修改基因布局,一旦确定了正确的PCN,克隆的构建与匹配到相应的质粒拷贝数固定。

为了说明这一点,遗传拨动开关在无花果。7一个克隆到郁金香和与固定的质粒拷贝数生成相同的PCN范围DH10B(无花果。7 b)。经过一夜之间增长12 h,用IPTG或aTc细胞诱导,然后第一轮样品收集8 h后流式细胞术分析(预洗、圆图。7 c)。正如所料,用IPTG诱导细胞/ aTc mKate2 / eGFP的表达水平升高,并与PCN这种转变增加了。测试这些诱导稳定状态的稳定性(因此拨动开关在不同的双稳态PCN), 4个小时后生长细胞稀释和种植12 h在新媒体缺乏IPTG和aTc,然后再稀释成新媒体之前收集后流式细胞仪分析样品的第二轮8 h (post-wash,三角形在无花果。7 c)。

从定性的角度来看,拨动开关的行为时,存在与固定的质粒拷贝数匹配观察当使用郁金香,eGFP和mKate2表达式(预洗和post-wash)遵循相同的趋势的独立支柱(无花果。7 c)。此外,预洗和post-wash样本在中、高PCN水平几乎相同,有明显降低的eGFP当PCN变得足够低,收益率几乎相同的post-wash浓度后续IPTG aTc归纳两种类型的骨干。除了这些定性相似,数据使用郁金香准确预测时所观察到的行为依赖于质粒与匹配固定拷贝数(无花果。7 d)从定量的角度(使用sfGFP表达式从空骨干作为PCN的代理)。最后,随着eGFP post-wash减少样品在低PCN值随后IPTG诱导可能是由于低基底的表达LacI染色体的原始DH10B应变,我们重复了这个实验,这个基因敲了出来。正如所料,这一修改相同的影响,低PCN水平下降(减少post-wash eGFP表达之后IPTG诱导),更重要的是,保持了密切的量化一致性行为观察在使用这两种类型的骨干(补充图。20.)。

这些发现证明(PCN控制提供了一个简单以及基督教民主党不仅如此方便的方法来优化电路动态(例如,观察到稳定状态的切换开关跨度近20倍范围),而且骨干的类型(郁金香或与固定的质粒拷贝数)对观察到的行为的影响最小。因此,郁金香可以促进基因电路原型通过灵活和动态调整(PCN不依赖耗时且容易出错的克隆以及基督教民主党的转换步骤指导零件的选择和条件(例如,诱导物浓度,PCN范围),以确保正确的功能(例如,需要稳定,动态范围),即使最终模块部署在质粒与匹配固定的拷贝数。重要的是,然而,虽然郁金香为我们提供了一个强大的调谐电路行为的维度,通过组合文库的补充而不是取代调优⁴²。例如,一个拨动开关在单体的阻遏蛋白或依赖不平衡的生产速率常数可能不是呈现双稳态只修改PCN的质粒窝藏(补充图。106年)。

郁金香使通用PCN控制使用各种输入的刺激

而郁金香最初开发实现Cuma-responsive PCN控制依赖一个质粒,在无花果。8我们说明,它可以很容易地与一个额外的控制层界面的进一步增加它的多功能性。在这个方案中,PCN通过CRISPR干扰调制(CRISPRi):一个小导游RNA (gRNA)针对CymRAM编码序列新兵dCas9实现sequence-specific镇压CymRAM表达式。增加gRNA浓度因此发挥作用类似通过枯茗酸诱导他们都减轻PCymRC启动子的镇压:前者通过抑制CymRAM的表达,后者通过防止启动子。因此,通过耦合gRNA表达感兴趣的信号(例如,化学诱导物、蛋白质浓度、环境因素),各种各样的输入刺激可以调节PCN接口这一层的控制与郁金香。这种方式,感兴趣的特定于应用程序的模块连接输入gRNA表达式可以很容易地交换没有进一步的筛选和优化,相反,我们利用仔细平衡的反馈循环,郁金香已经装备了。

说明这种方法,我们设计了八个gRNAs针对CymRAM编码序列(gRNAs # 1 - # 8)和消极的控制(gRNA # 9),每一个表示从Van-inducible PVanCC发起人或AHL-inducible PLuxB启动子。在媒体补充0.4μM枯茗酸,而gRNA # 9表达对PCN没有影响,upregulation其他gRNAs导致增加PCN、验证的正确功能提出了控制方案。选择gRNA设计产生最突出PCN响应(gRNA # 5),图中的数据。8 b, c验证PCN单调增加的诱导物浓度在两种实现,尽管低枯茗酸浓度(使用# 6 gRNA产量性能相似,见补充图。26)。此外,PCN范围横跨在这个扩展设计针对AHL /货车匹配一个获得由于枯茗酸感应(灰色阴影区域在无花果。8 b, c)没有任何调整郁金香或CRISPRi-based控制模块。实现在无花果。8 b, c依靠同样的gRNA和不需要gRNA或模块的特定于应用程序的优化调节其表达。这强调了增加的监管方案图的多功能性。8不降低性能的代价,进一步说明,郁金香可以部署和利用多样的合成生物学的应用程序。而在这个概念实现我们依靠dCas9 FR-E01应变的表达式⁴³,这个基因也可以集成到质粒带有额外的控制,以确保一系列的可移植性层甚至扩大控制方案。

基因表达控制生物研究的发展中扮演着重要的角色,尤其是在合成生物学领域。允许容易和高效的基因表达设计的探索空间,过多的工具使灵活和动态控制在转录和翻译水平。这些技术的多功能性突出我们的工具箱的一个关键差距控制在DNA质粒拷贝数级严重限制:当前方法要么依赖于质粒与固定的数字拷贝⁴⁴,或者要求multi-plasmid结构^24,25,26,还是局限于选择压力^21,22,23。应对这一挑战,郁金香,我们灵活的基因表达控制扩展到三维空间通过PCN的规定,补充转录和转译工具。

郁金香是一个自包含的DNA质粒,提供诱导PCN控制生成一个宽动态范围以及基督教民主党执行跨多个常用的强劲大肠杆菌压力和增长的媒体。我们演示了通过多个实例说明,通过减轻我们依赖支撑当前方法耗时且容易出错的克隆和转换步骤,郁金香加速性能优化的基因电路,重复使用模块在不同的上下文中,和促进基因电路原型。此外,它可用于探测竞争共享细胞资源如何影响的行为看似无关的电路组件,并揭示基因的关键属性部分很难描述使用固定的质粒拷贝数。基因的表达存在在郁金香可以动态地调整不仅通过枯茗酸,还通过各种输入刺激CRISPRi-based控制的附加层,我们开发了,我们的平台提供了一个方便的方式来调节电路活动并确保强劲的性能,尽管细胞环境的巨大变化⁴⁵。

最新进展强调动态路径通过PCN监管控制可以提高微生物细胞工厂的性能²⁶,也可以用于描述PCN在细胞增长率的影响,基因表达,生物合成,基因电路的性能²³。补充这些方法大大扩展我们的合成生物学工具箱,郁金香设计采用模块化和正交性,使其轻松和现有系统的影响最小。用枯茗酸作为主要模式(PCN控制以及基督教民主党pSC101起源从C组不兼容我们的支架(从而避免主要化学诱导物如IPTG和aTc,和质粒pColE1等不相容组A和B, pBR322, pUC19,和p15A),郁金香是cross-compatible各种常用的向量和遗传分量。此外,考虑一系列十分健壮的功能大肠杆菌主机,媒体成分,合成基因电路,郁金香提供了一个灵活的平台,可以轻松地部署在截然不同的环境中减轻已知问题的合成基因电路动态范围窄等激活和抑制控制^46,47,漏水的表达式^48,49,和代谢负担^23,50。正如我们在图说明6PCN控制可以利用增加合成基因回路的动态范围^16,51,52从漏水的促进剂,以减少基底表达式,以确保表达水平可以增加没有痛苦的副作用往往不可避免的增加了泄漏。此外,维护和复制的质粒和重组蛋白的过度表达是相当大的代谢负担^53,54通过PCN、动态路径管理控制可以提高微生物细胞工厂的性能²⁶,特别是low-copy质粒可以在代谢工程通常比高仿同行⁵⁵。

除了应用实例我们考虑在这篇文章中,我们设想动态PCN控制在范围广泛的部署设置。潜在的上下文可能包括动态空间组织的代谢途径与质粒作为本地化融合蛋白支架组成的DNA结合域和代谢酶^56,57和替代基因表达调控机制,例如,利用质粒携带诱饵算子序列作为改变基因电路动力学和减轻毒性的方法^58,59,或与主机交互的本地TFs“软”监管改变新陈代谢⁶⁰。此外,动态PCN控制不仅为我们提供了一个直接的方法同时调节多个基因的表达目标,它还可以提供一个经济替代补充转录、翻译和翻译后控制³⁷。最后,作为维护稳定的枯茗酸必须存在郁金香(补充图。6合成DNA质粒),我们提供了一个有前途的大道biocontainment减轻风险的合成质粒废物流中传播和污染^61年,并提供一种简单的机制来治疗细胞的质粒与瞬态函数(如lambda-RED基因组整合^62年或在mutagenesis-inducing质粒体内定向进化^63年)。

生物学发展强大的和创造性的解决方案来优化基因表达控制通过利用多个维度的调节机制。郁金香我们呈现PCN控制一样可以调节转录以及基督教民主党转化水平来启用和鼓励灵活高效勘探设计空间的生物工程从另类观点。

菌株

一个全面的列表大肠杆菌菌株用于我们的工作,以及他们的基因型和来源,补充表中列出1。NEBStable和NEB10Beta(称为DH10B)是用于所有质粒克隆的目的。NEBStable用于固定的初始特征质粒拷贝数变异(补充表2)和two-plasmid诱导拷贝数系统(无花果。1)。此外,NEBStable用于准备筛选郁金香,苏格兰皇家银行(RBS)图书馆和作为东道主为后续描述导致郁金香(补充图的最终设计。2)。DH10B、NEBExpress BW25113, MG1655被用于验证一系列的可移植性的郁金香(无花果。3)。DH10B被广泛用于描述郁金香(图的稳定性。4和补充无花果。7 - 13),与BW25113用于描述单层传感器模块(无花果。5和6)和遗传非门(补充图。14)。

遗传的拨动开关实验(图。7),DH10B用作宿主菌株。此外,我们创建了一个lacI DH10B应变不足被用来进一步验证基因拨动开关的行为。我们生成一个ΔlacI:: kanR突变基因使用修改后的协议使用pREDCas9 lambda-RED复合系统的构造^62年,64年;从陈道pREDCas9是一份礼物(Addgene质粒# 71541)^65年。引物用于生成KanR基因组整合盒式补充表中可以找到9。

在无花果CRISPRi实验。8、应变FR-E01 (k - 12 MG1655菌株基因整合aTc-inducible dCas9盒式)使用⁴³;从大卫Bikard FR-E01是一份礼物(Addgene质粒# 118727)。红色荧光蛋白控制菌株由集成一个既定的表达mScarI磁带(J100mScarI: PJ23100_RiboJ_B0034_mScarlet-I_ECK120029600)到基因组使用pOSIP-CH系统^66年。这个mScarI磁带是集成到HK022 attB网站DH10B和BW25113菌株导致DHScarI和BWScarI(补充表1)。

转换协议

同时转换,使用了标准的氯化钙感受态细胞制备协议^67年。电穿孔进行了使用ref中概述的协议。68年,使用Bio-Rad矩形脉冲发生器Electroporator和0.1厘米的差距比色皿(棕色帽子)。岗位转换、NEBStable和DH10B细胞内布拉斯加州1毫升NEBStable或恢复DH10Beta增长媒体,分别所有其他转换中恢复1毫升呜咽(超级最佳汤);转换通常是孵化1 h在37°C,紧随其后的是磅琼脂板电镀与适当的抗生素选择。转换的郁金香质粒,复苏媒体补充1μM枯茗酸。特定的质粒温度敏感元件,即。,pOSIP-CH or pREDCas9, where appropriate these were always cultured at 30 °C.

媒体和生长条件

超优的肉汤(呜咽;酵母提取物5毫克/毫升,L-tryptone 20毫克/毫升,氯化钠10毫米,MgCl氯化钾2.5毫米₂10毫米,MgSO₄10毫米)是用于所有克隆和感受态细胞制备的目的。米勒的Luria肉汤(磅;也称为溶原性汤)和琼脂(σ)是用于所有固体介质板的文化。补充M9-Glucose媒体(称为M9-Gluc媒体:M9盐1 x、盐酸硫胺素0.25毫克/毫升,casamino酸2毫克/毫升,MgSO₄2毫米,CaCl₂100μM,葡萄糖4毫克/毫升)被用于所有的实验包括流式细胞术,qPCR、微型板块读者,和太极拳。生物恒浊器实验。补充图中给出的实验。7米勒,磅肉汤媒体准备使用的磅肉汤(σ),和补充M9-Glycerol媒体(M9-Gly)准备M9-Gluc完全一样,除了最后一个4毫克/毫升的浓度甘油是补充葡萄糖。

除非另有说明,所有媒体和盘子都配以适当的抗生素,下面的最终浓度:氨苄西林在100μg /毫升,卡那霉素在50μg /毫升,氯霉素在25μg /毫升。在实验中双使用抗生素的选择,最后每个抗生素浓度减半盘子和液体两种文化。培养细胞携带郁金香结构,所有克隆盘子和液体的文化补充1μM枯茗酸稳定维护的郁金香,除了适当的抗生素浓度。化学诱导物枯茗酸(4-Isopropylbenzoic酸)、3 oc6-hsl (N - (3-Oxohexanoyl) -L-homoserine内酯;也称为AHL)、香草酸(4-Hydroxy-3-methoxybenzoic酸;也称为Van)、IPTG(异丙基β-D-1-thiogalactopyranoside), aTc(盐酸Anhydrotetracycline)购买的σ。所有的细菌进行了孵化37°C。液体培养基,晃动的速度300转用于震动孵化器(新布伦瑞克英诺华42 r,轨道直径19毫米)和800 rpm板瓶(排开孵化微型板块瓶,轨道直径3毫米)。

克隆和质粒装配策略

克隆相关酶和各自的试剂都是来自新英格兰生物学实验室(内)。引物被命令通过集成DNA技术(IDT);Q5热态启动2 x大师混合是用于所有聚合酶链式反应(PCR;Bio-Rad C1000热周期计),按照推荐方案内的体积25μL反应。PCR反应的凝胶电泳验证了5μL反应体积的1%琼脂糖凝胶(σ)。剩下的20μL PCR反应体积混合1μL DpnI和消化1 h 37°C,其次是热失活了20分钟在80°C。帖子DpnI消化,通过QIAquick PCR产品纯化PCR净化设备(试剂盒)。

使用金门克隆质粒进行建设^69年。具体来说,CIDAR MoClo“粘性末端”标准是用于所有组件^70年;大会“部件”要么是直接使用从MoClo质粒,或PCR扩增与BsaI网站设计和适当的粘性末端切成悬臂底漆。的CIDAR MoClo整套维修零件(Addgene工具包# 1000000059)从道格拉斯Densmore是一份礼物,和CIDAR MoClo扩展卷我工具包(Addgene工具包# 1000000161)从理查德·默里是一份礼物。金门装配反应,80 fM调频骨干的DNA和每个插入DNA的混合在一起,其次是0.5μL BsaI-HFv2(20单位/μL), 0.5μL T4 DNA连接酶(400单位/μL), 2μL T4 DNA连接酶10 x缓冲,无菌MilliQ水20μL最后一卷。装配组合将孵化与以下协议:热循环(5分钟在37°C, 5分钟16°C)×30周期,30分钟16°C, 20分钟在80°C,无穷10°C。组装的混合5μL就转化为化学主管NEBStable或DH10B细胞通过热休克转换,其次是恢复在适当的媒体产物1 h,然后为每个反应两个适当的抗生素板块分裂电镀在1:9的比例,然后孵化一夜之间在37°C。minipreps,单菌落接种到5毫升的呜咽媒体补充适当的抗生素和培养过夜,然后使用QIAprep miniprepped旋转Miniprep工具包(试剂盒)。所有质粒的列表和DNA部分可以找到用于补充表2- - - - - -8地图,质粒可以在补充无花果。102年和103年。

苏格兰皇家银行(RBS)图书馆准备、流式细胞仪和手动筛选

苏格兰皇家银行图书馆组装依靠酒泉市金门组装使用PCR片段,如补充图。2。引物用于构建图书馆补充表中可以找到9。装配组合变成了化学镀主管NEBStable细胞和100%磅琼脂板补充与氨苄青霉素和孵化隔夜37°C。第二天早上细胞刮掉的板和resuspended大约2毫升filter-sterilized PBS。这些细胞被彻底混合,然后稀释1:20成5毫升PBS的体积。样本处理BD FACSAria三世分选机,运行在BD FACSDiva v7.0软件。在第一个屏幕大约100000个细胞选择低荧光范围从图书馆的选择,这些被镀在一夜之间两磅琼脂板和孵化37°C。第二天早上细胞刮又resuspended PBS的2毫升,然后1:20稀释到5毫升PBS和加工的BD FACSAria三世分选机;这个屏幕重复了4轮,并在屏幕# 2,# 4共有约50000个细胞被封闭的每轮。从屏幕后的最终板# 4,40殖民地与荧光强度较低的手动选择板放置在透照器(生物系统iBright CL1500成像系统)。一夜之间,这些殖民地被随后培养M9-Gluc媒体与0或1μM枯茗酸,然后稀释1:200到新鲜M9-Gluc媒体诱导物相同的条件和加载到微型板块读者。 Further details for the screening process can be found in Supplementary Section1.2。

一般协议对所有实验

除非另有指示,M9-Gluc媒体被用于实验的所有实验隔夜pre-cultures和文化本身。对所有实验涉及细胞携带郁金香,隔夜pre-cultures也诱导与适当的枯茗酸的浓度。除非另有指示,实验文化进行了200年卷μL M9-Gluc。“NonFP”控制细胞没有任何质粒或荧光被用作荧光消极的控制,以及积极控制增长。细胞菌株基因整合mScarI表达式(DHScarI BWScarI,补充图。103年和补充表1)被用作积极控制在所有实验测量mScarI表达红色荧光,所有计算mScarI生产利率正常化。所有实验条件(包括控制)在生物一式三份,定义为从每个应变测试3个殖民地。对所有实验在96 -孔板(深井和微型板块)透气膜(σ安心密封膜)是应用坚定墨辊。

一般定量PCR试验协议

一夜之间,除非另有注明pre-cultures 1:200稀释到新鲜M9-Gluc媒体,与各自的诱导物浓度,并培养5 h在37°C,摇晃在2毫升96 - 800 rpm深潜盘子。抽样时,10μL细胞培养被转移到90μL无菌MilliQ水PCR管条,和样本煮20分钟在热循环95°C。样本然后储存在-20°C,直到需要量化PCN通过定量PCR (qPCR)。

qPCR实验,快速SYBR绿色2 x mastermix(费舍尔)和反应是在生物系统中运行使用QuantStudio 7 Pro 384模块。每个生物样品在技术重复重复,每个反应都有最后一卷10μL,组成5μL酶mastermix, 0.25μL每个正向和反向引物(20μM), 2.5μL水和2μL细胞溶解产物。针对dx基因的引物²⁴(每个基因组一个副本)和氨苄青霉素抗性基因的质粒是使用Primer3Plus设计工具创建的^71年。补充表中所有设计都可以9。底漆效率计算使用的一系列5倍稀释梯度MG1655基因组DNA (dx引物),或一个氨苄青霉素耐药质粒(氨苄青霉素的引物)。底漆的效率101.4%(放大系数2.01)和105.6%(放大系数2.06)测定dx和氨苄青霉素的引物,分别。Ct(阈值周期)值从原始荧光数据中提取了dx和氨苄西林扩增子使用QuantStudio软件(设计和分析v2.5) PCN的量化^72年作为

所有qPCR实验也只是mastermix一式三份,水,每个引物对消极的控制。

一般的流式细胞术协议

除非另有指示,一夜之间文化被稀释1:200进新鲜M9-Gluc媒体,与各自的诱导物浓度,并培养5 h在37°C,摇晃在2毫升96 - 800 rpm深潜盘子。抽样时,20 - 50μL细胞转移到filter-sterilized PBS的最后一卷200μL 96 -微型板块。样本然后分析生物系统调NxT autosampler附件,在色调上运行™NxT软件;至少10000的细胞事件记录每个样本,和相对绿色荧光(即单位。,for sfGFP and eGFP) were quantified at Ex: 488 nm and Em: 530/30 nm (BL1), and relative red fluorescence (i.e., for mScarI and mKate2) were quantified at Ex: 561 nm and Em: 620/15 nm (YL2). All flow cytometry experiments had triplicates of NonFP cells as negative controls. An example of gating cell events in flow cytometry experiments is presented in Supplementary Fig.27。

一般标实验协议

除非另有指示,一夜之间文化被稀释1:200进新鲜M9-Gluc媒体与各自的诱导物浓度。AHL-LuxR和Van-VanRAM诱导电路实验中,枯茗酸添加到一夜之间文化设置PCN、和AHL或香草酸的开头添加了标实验。所有实验进行了BioTek Cytation 5标操作Gen5软件。板是培养10 - 15 h(根据实验)37°C,与轨道摇晃在548 cpm轨道直径2毫米。以下测量进行每15分钟:光密度在700 nm,绿色荧光Ex: 485/10 nm和Em: 515/10 nm获得80,和红色荧光Ex: 565/15 nm和Em: 600/15 nm获得100。所有标实验一式三份空白媒体的管制,NonFP细胞,如果合适,细胞基因组(即本构mScarI表达式。,DHScarI BWScarI)。使用动能进一步详细数据标实验提出了补充部分1.10。

太极拳。生物恒浊器实验协议

太极拳。生物恒浊器³⁶预到LabMaker用于实验在无花果。4和补充图。9。M9-Gluc媒体补充适当的使用抗生素和枯茗酸气。生物实验。操作手册(版本1.2)https://chi.bio/operation/之后设置射流线路、电气连接,用户界面(操作软件v2.3),开始实验。在实验的开始,每个室挤满了20毫升M9-Gluc媒体,一夜之间的文化1:200稀释。气。生物温度设置为37°C,和传感器监测GFP(例:457/35 nm, Em: 510/40 nm,获得:512×)和光学密度在600海里(OD600) 1分钟间隔48 h。目标OD600维护将0.5 AU,上界和下界的0.6盟和0.4 AU,分别。媒体水库与适当的抗生素和诱导物浓度改变每12 h实验期间,同时20μL细胞培养也在流式细胞分析仪取样和分析量化sfGFP信号分布在人口。

质粒稳定性实验

图中给出的实验。4 b和补充图。10 b,隔夜pre-cultures准备M9-Gluc媒体补充适当的枯茗酸和氨苄青霉素的浓度。在实验的开始,所有在一夜之间文化被稀释到800μL深潜新媒体板块以适当的枯茗酸条件下,选择,要么有或没有氨苄青霉素。文化在板孵化瓶在37°C, 800 rpm。每2 h,总共14 h, 20 - 50μL的细胞培养被流式细胞仪采样进行分析。维持细胞在连续生长,细胞培养是稀释40到800年μL新鲜的媒体以适当的枯茗酸和氨苄青霉素条件6和10 h。

质粒选点变化实验

补充图中给出的实验。9,隔夜pre-cultures准备M9-Gluc媒体补充0.4μM枯茗酸和氨苄青霉素。在实验的开始,隔夜pre-cultures稀释接触到800年μL新鲜媒体0.4μM枯茗酸和氨苄青霉素,在深井盘子。细胞培养板的振动器设置在800 rpm 37°C和颤抖。每2 h,总共12 h, 20 - 50μL流式细胞术分析细胞培养的采样。4 h(细胞稀释1:40 800新鲜μL媒体更高浓度的枯茗酸引发PCN upregulation。这第二个枯茗酸浓度维持在剩下的实验。维持细胞在连续生长,细胞培养是稀释40到800年μL新鲜的媒体在适当8 h枯茗酸条件。

遗传拨动开关试验

图中给出的实验。7一夜之间,pre-cultures准备与氨苄青霉素M9-Gluc媒体补充,和适当的枯茗酸浓度在郁金香拨动开关存在时;没有枯茗酸添加菌株携带拨动开关固定在质粒拷贝数。在实验的开始,隔夜pre-cultures 1:800稀释到800年μL新鲜的媒体补充适当的氨苄青霉素的浓度,枯茗酸,1毫米IPTG或80海里aTc。细胞被孵化的一盘振动器设置为37°C摇晃在800 rpm。在8 h, 20μL采样和分析细胞培养的流式细胞术(“预洗”样本)。在12 h与IPTG诱导或aTc,细胞被稀释1:800到800年μL新鲜的媒体没有IPTG或aTc,一夜之间,培养板瓶。在24小时,一夜之间文化稀释1:800到800年μL新鲜的媒体相同的各自条件缺乏IPTG aTc,和一个额外的文化孕育了8 h平板振动器。32小时的实验中,20μL采样和分析细胞培养的流式细胞术(“post-wash”样本)。

CRISPRi实验

图中给出的数据。8和补充图。26,所有实验在FR-E01(补充表1)和所有指导RNA设计补充表中可以找到10。隔夜pre-cultures准备在M9-Gluc媒体补充氨苄青霉素的选择和郁金香,和卡那霉素选择gRNA表达质粒(p15A-kanR向量)。最后一个1μM aTc的浓度⁴³被用来激活dCas9从基因组表达,和0.4μM枯茗酸被用来稳定维持郁金香基底拷贝数。在一夜之间pre-culture步骤,添加适当浓度的货车或AHL诱导gRNA表达式,进而允许郁金香达到定位点在一夜之间的持续时间pre-culture拷贝数。郁金香积极控制,FR-E01细胞携带着只有郁金香引起适当的枯茗酸的浓度,并没有其他的诱导物。当天实验中,隔夜pre-cultures被稀释到200μL新媒体以适当的条件,并加载到标仪监控增长和sfGFP表达式作为PCN的代理。

数据分析

进行数据分析和策划结果,Python (v3.8.5)是用于JupyterLab接口(v2.2.6),提供的水蟒包(v1.7.2)。之()和Adobe Illustrator (v26.5)是用于创建数据。为qPCR实验中,Ct值被从原始数据中提取使用提供的软件与仪器(QuantStudio 7专业版,设计和分析v2.5), (PCN值计算是在Microsoft Excel进行以及基督教民主党在Python中可视化。流式细胞仪实验分析和可视化使用Python,第一门事件根据向前边撒山庄包括至少10000细胞事件(补充图。27)。荧光信号中值计算为每个样本代表人口的相对基因表达。拨动开关的实验,相对eGFP和mKate2信号绘制和封闭的对事件进行分类是绿色、红色或NonFP(补充无花果。16- - - - - -18)。标仪实验分析和可视化使用Python,比生长速率和荧光产率为每个以及计算

分别在哪里OD_700年(t),FP(t)表示OD和荧光测量的时间t,t₁,t₂,t₃随后的数据收集和15分钟间隔时间点吗³⁷。相应的值显示在每个图表示极大值在整个实验过程中(在指数增长,清廉的时间窗内定义h),局部使用Python函数scipy.signal.find_peaks ()。数据提出了补充无花果。28和29日说明我们的发现在不同的时间点。所有mScarI生产值是各自控制应变(即规范化。,DHScarI or BWScarI) so that the outputs of the sensor modules can be compared across the different strains of大肠杆菌。所有的实验(包括控制)进行了生物一式三份,定义为三个殖民地从每个应变测试,因此生物三胞胎的每个数据点代表一个意思,误差代表相应的标准差。数值模拟在补充部分3进行了使用MATLAB 2022 a。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然投资组合报告总结与这篇文章有关。