摘要gydF4y2Ba
泛素E3连接酶底物适配体cereblon (CRBN)是萨力度胺和来那度胺的靶点gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，用于治疗造血系统恶性肿瘤的药物gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba以及作为靶向蛋白质降解的配体gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．这些试剂被提议模仿自然发生的脱氢子;然而，CRBN的萨力多胺结合域识别的结构基序仍然未知。在这里，我们报道了c端环酰亚胺，由谷氨酰胺或天冬酰胺残基分子内环化引起的翻译后修饰，是CRBN底物上的生理脱子。含有c端环亚胺degron的二肽在嵌入双功能化学降解剂时替代了沙利度胺。在体外和细胞内，在蛋白质的C端添加degron可诱导crbn依赖性的泛素化和降解。c端环酰亚胺在整个人类蛋白质组中在生理相关的时间尺度上偶然形成，以提供可被CRBN内源性识别和去除的脱氢子。c端环亚胺degron的发现定义了一个可能影响CRBN的生理功能和治疗作用的调节过程。gydF4y2Ba
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改变历史gydF4y2Ba
2022年10月31日gydF4y2Ba
在本文最初发布的版本中，Alessio Ciulli缺少作为同行审稿人的确认，现在已包含在文章的HTML和PDF版本中。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢Y. Amako, D. Miyamoto和A. D 'Souza的有益讨论;S. Trager, B. Budnik, R. Robinson和Z. Niziolek提供技术支持;安捷伦仪器生物分子表征卓越中心。他的gydF4y2Ba6gydF4y2Ba-CRBN-DDB1是Bristol Myers Squibb赠送的礼物。本出版物中使用的一些数据是由临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(NCI/NIH)生成的。感谢来自小野制药基金会(c.m.w)、斯隆研究基金会(c.m.w)、camil - dreyfus基金会(c.m.w)、哈佛大学Blavatnik生物医学加速器(c.m.w)、美国国立卫生研究院(R01GM114537, M.R.P.)、日本科学促进协会(S.I.)和美国国家科学基金会(H.A.F.)的支持。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
s.i.， N.V.和D.S.设计和合成的化合物。S.I.和W.X.设计并进行降解试验。h.a.f.， s.i.， W.X.和H.C.L.设计并进行了二元和三元复合体评价的研究。H.A.F, h.c.l和S.I.设计并制备了带去铁蛋白，并对工程蛋白进行了评价。W.X, H.A.F.和S.I.研究了环亚胺PTMs的形成、水解破坏及其半衰期。W.X、H.A.F、S.I.和h.c.l为蛋白质组学实验制备样品。W.X.设计并进行蛋白质组学实验，与C.M.W. B.W.联合分析蛋白质组学数据，M.R.P.进行表达蛋白结扎。c.m.w构思了这个项目，并起草了手稿。所有作者审阅并编辑了手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
哈佛大学于2022年4月13日提交了一份PCT专利申请，涵盖本文所述的化学结构及其用途。C.M.W, S.I, H.A.F.和w.x被列为本专利的发明人。吴实验室得到了默克公司和小野制药公司的支持。所有其他作者声明没有竞争利益。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba感谢Benjamin Cravatt, Alessio Ciulli和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1 BRD4双功能降解物与CRBN候选降解子的检验。gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Bac端环天冬酰胺(cN)或戊二酰亚胺(cQ)和n端焦谷氨酸(pE)在体内形成的代表性机制。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) JQ1-uracil、JQ1-PEG-uracil和JQ1-uridine的结构。（gydF4y2BacgydF4y2Ba) HEK293T细胞经JQ1-uracil、JQ1-PEG-uracil、JQ1-uridine作用24 h后BRD4的Western blot检测。（gydF4y2BadgydF4y2Ba) JQ1-cQ、JQ1-cN、JQ1-FpE的结构。（gydF4y2BaegydF4y2Ba) HEK293T细胞经JQ1-cQ、JQ1-cN、JQ1-FpE处理4 h后BRD4的Western blot检测。所有western blot数据至少代表2个独立的重复。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图2 JQ1-XcQ和JQ1-XcN降解剂对BRD4蛋白靶向降解的评价gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)用100 nM、1µM或10µM dBET6处理HEK293T细胞后，对20种二肽降解物进行BRD4水平的Western blot检测。有趣的是，在10µM的dBET6中可以观察到导致BRD4降解减少的钩子效应，但在二肽降解物中没有观察到。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) dBET6对BRD4的降解在4小时内被来那度胺或Boc-FcQ竞争性抑制，其浓度依赖于剂量(0.1-100µM)，这表明CRBN的沙利度胺结合域被戊二酰亚胺配体参与。（gydF4y2BacgydF4y2Ba) dBET6或JQ1-FcQ处理的HEK293T细胞中BRD4随时间的变化水平。（gydF4y2BadgydF4y2Ba)评价JQ1-HcN在HEK293T细胞中不同浓度BRD4的靶向蛋白降解作用超过4小时。该探针是基于蛋白质剪接产物(gydF4y2Ba如gydF4y2Ba通常由倒数第二个组氨酸促进。（gydF4y2BaegydF4y2Ba用指定的降解物处理野生型(WT)或shRNA敲低(CRBN KD) HEK293T细胞后，Western blot检测BRD4。（gydF4y2BafgydF4y2Ba) JQ1-FcN与来那度胺或Boc-FcN联合处理HEK293T细胞后BRD4的Western blot检测。（gydF4y2BaggydF4y2Ba) JQ1-FcN处理HEK293T细胞中BRD4随时间的变化水平。所有western blot数据均代表2个独立的重复。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图3二肽降解物和配体的免疫共沉淀和光亲和置换实验。gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)用25µM或1µM指示降解物处理2小时后，HEK-CRBN内源性BRD4在细胞(左)或裂解物(右)中共免疫沉淀。Western blot数据代表2个独立的重复。（gydF4y2BabgydF4y2Ba)使用光-来那度胺(pLEN)光亲和标记置换法观察CRBN/DDB1的凝胶荧光成像。比较采用非配对双尾t检验。ns =不显著,* * * = = p < 0.05, p < 0.01, * * * = p < 0.001, * * * * = p < 0.0001。数据以均值±标准差表示(n = 3个生物独立样本)。（gydF4y2BacgydF4y2Ba)光-来那度胺(pLEN)的结构和使用光-来那度胺(pLEN)进行CRBN/DDB1凝胶荧光成像的光亲和标记置换实验示意图。（gydF4y2BadgydF4y2Ba)在光亲和标记和凝胶荧光成像之前，用1µM pLEN和100µM指定竞争对手处理CRBN/DDB1 30分钟后的相应凝胶图像。所显示的数据包括3个生物独立的重复。未裁剪的western blot和凝胶图像，参见补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图4二肽配体与CRBN和BRD4形成三元配合物。gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)显示CRBN结构域的示意图，包括具有免疫调节药物结合关键残基的CULT结构域，以及AlphaScreen设计。（gydF4y2BacgydF4y2Ba) AlphaScreen实验用所述降解物化合物进行。曲线下的相对面积反映了细胞降解趋势，其中几种二肽降解物产生的信号大于或相当于dBET6。有趣的是，非活性降解物JQ1-cQ促进三元配合物的形成，相当于活性JQ1-GcQ，表明N-1氨基酸残基将三元配合物定位在更有效的构象中。数据载于(gydF4y2BabgydF4y2Ba)及(gydF4y2BacgydF4y2Ba)分别在384孔板上进行;dBET6在每个板上检测作为内部对照。每种条件均重复测量三次。（gydF4y2BadgydF4y2Ba) NanoBRET检测原理图。（gydF4y2BaegydF4y2Ba) NanoBRET测量由降解物库的指示成员诱导的三元复合物形成，由受体:供体信号比确定，减去每个降解物的无配体控制的背景信号。每种条件均重复三次。误差柱表示平均值±SEM。gydF4y2Ba
图5 HEK293T细胞和多发性骨髓瘤MM.1S细胞中IMiDs和指示肽的特征。gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)由6BOY和6H0F建立了含CRBN的二肽降解物模型。左图:通过与CRBN(灰色)和BRD4(蓝色)三元配合物中dBET6(橙色)分子建模JQ1-FcQ(黄色)的模型。中间:CRBN结合袋与沙利度胺模拟物(橙色)、Ac-FcQ(黄色)或Ac-FcN(绿色)的放大。右图:pomalidomide(橙色)、FcQ(黄色)、FcN(绿色)在与CRBN(灰色)、IKZF1(蓝色，填充模式)三元配合物中的模型。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) Boc-cQ, Me-FcQ, Ac-FcQ, HgydF4y2Ba2gydF4y2BaN-FcN或HgydF4y2Ba2gydF4y2BaN-FcQ、Boc-FcN或Boc-FcQ、GGGFcQ。（gydF4y2Bac - dgydF4y2Ba过表达IKZF1的HEK-CRBN细胞在1µM孵育2 h后的共免疫沉淀蛋白的定量蛋白质组学(gydF4y2BacgydF4y2Ba) FcN或(gydF4y2BadgydF4y2Ba) GGGFcQ。将蛋白质水平归一化到每个通道中CRBN的数量。丰度比的p值采用TukeyHSD事后检验的单因素方差分析计算。（gydF4y2BaegydF4y2Ba)指示的二肽降解物(JQ1-FcN, JQ1-FcQ)与指示化合物在HEK293T细胞中竞争性抑制BRD4降解4 h。所有western blot数据均代表2个独立的重复。（gydF4y2BafgydF4y2Ba)用10µM Boc-FcN处理MM.1S细胞10 h后的定量蛋白质组学。丰度比的p值采用t检验(背景)方法计算。（gydF4y2BaggydF4y2Ba) MM.1S细胞经上述化合物处理10 h后IKZF1蛋白的表达水平。数据以均值±标准差表示(n = 3个生物独立样本)。（gydF4y2BahgydF4y2Ba) 0.1µM的JQ1-FcQ或dBET6处理2 h后HEK293T细胞的定量蛋白质组学。丰度比的p值采用t检验(背景)方法计算。（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba) HEK293T细胞经上述化合物处理2 h后BRD2和BRD4蛋白的表达水平。数据以均值±标准差表示(n = 3个生物独立样本)。所有蛋白质组学实验均采用生物重复。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图6 c端环亚胺脱氢是可转移的。gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)流式细胞术分析(gydF4y2Ba一个gydF4y2BaHEK293T细胞，(gydF4y2BabgydF4y2Ba) Jurkat或(gydF4y2BacgydF4y2Ba) MEF细胞电穿孔后6小时，用标记有指示肽的GFP，有或没有来那度胺竞争(100µM)。比较使用普通的单向方差分析与Šídák的多重比较检验进行，p值显示在比较条上方。（gydF4y2BadgydF4y2BaFKBP12降解剂dFKBP-1和dFKBP-FcQ的结构。（gydF4y2BaegydF4y2Ba)在0.1-25µM剂量反应范围内，用dFKBP-1或dFKBP-FcQ处理HEK293T细胞后FKBP12水平的Western blot检测。（gydF4y2BafgydF4y2Ba) dFKBP-FcQ和来那度胺或Boc-FcQ联合处理HEK293T细胞后FKBP12水平的Western blot检测。（gydF4y2BaggydF4y2Ba)经dFKBP-1或dFKBP-FcQ处理的HEK293T细胞中FKBP12随时间的变化水平。（gydF4y2BahgydF4y2Ba) CDK6降解物dCDK6-Pom和dCDK6-FcQ的结构。（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba) dCDK6-Pom或dCDK6-FcQ在0.01-10µM剂量反应范围内处理Jurkat细胞后CDK4/6水平的Western blot检测。（gydF4y2BajgydF4y2Ba) dCDK6-FcQ和来那度胺或Boc-FcQ联合作用Jurkat细胞后CDK6水平的Western blot检测。（gydF4y2BakgydF4y2Ba)由GST-FKBP12- lpetg - his生成degron标记的GST-FKBP12gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．（gydF4y2BalgydF4y2Bac端环亚胺标记的FKBP12体外泛素化。FKBP12-HgydF4y2Ba6gydF4y2Ba= FKBP12与c端HisgydF4y2Ba6gydF4y2Ba标签(无分类酶处理);FKBP12- me = FKBP12与c端FcQMe;FKBP12-FcQ = FKBP12带c端FcQ;FKBP12-FcN = FKBP12带c端FcN。（gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)转染HEK293T细胞6 h后，用标记肽标记FKBP12。（gydF4y2BangydF4y2Ba) Western blot在(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．误差条表示平均值gydF4y2Ba±gydF4y2BaSD。比较使用普通的单向方差分析与Šídák的多重比较检验进行。所有western blot数据至少代表2个独立的重复。流式细胞术数据代表3个独立的重复。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图7内芯Npu DnaE和Mtu RecA不是CRBN衬底。gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba左图:37℃时环酰亚胺Fmoc-GGGFcQ或Fmoc-GGGFcN在PBS中水解。(n = 3个生物独立样本，误差条，落在符号内，代表平均值±标准差)。右图:C端环酰亚胺在PBS中在37℃下在GFP-FcQ或GFP-FcN上水解(n = 3个生物独立的样品，误差条，在符号范围内，表示平均值±标准差)。（gydF4y2BabgydF4y2Ba)内含线拼接机制的示意图，内含线切除的倒数第二步产生c端天冬酰胺，以及拼接前后的两种内含线结构。X = O或S, R = H或CHgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．（gydF4y2BacgydF4y2Ba)在插入V5标签和未插入V5标签的大肠杆菌中Npu DnaE的表达和剪接分析。(n = 1个生物独立复制)(gydF4y2BadgydF4y2Ba) v5标记的细胞裂解物的体外泛素化gydF4y2BacgydF4y2Ba(n = 3个生物独立的重复，均示)。（gydF4y2Bae, fgydF4y2BaMLN4924或来那度胺预处理对4-羟他莫西芬(4-HT)诱导的HEK293T细胞中GFP与ha标记Mtu RecA inin剪接的影响。对于e和f，所示数据均代表2个生物独立的重复。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图8来自红细胞的血红蛋白和来自牛晶状体的β -晶体蛋白c端cQ/cN修饰分析gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)全球蛋白质组学数据集中携带半胰蛋白酶末端N或Q的独特蛋白质和多肽。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) Western blot检测两名捐赠者的红细胞(RBC)裂解物与HEK293T裂解物的比较。红细胞不表达CRBN。（gydF4y2BacgydF4y2Ba红细胞裂解液中HBB(42-cN58)和HBA(63-cN79)的MS2光谱具有代表性。Western blot代表2个独立的重复。（gydF4y2BadgydF4y2Ba)在全球蛋白质组学数据集、重组血红蛋白β (HBB)蛋白和红细胞(RBC)裂解物中观察到的选定血红蛋白亚基和肌动蛋白的肽谱匹配(pms)的比较。在MS1中提取离子色谱观察HBA(63-cN69)。为进一步分析而选择的站点用红色或蓝色突出显示。（gydF4y2BaegydF4y2Ba)在有或没有碱基处理的RBC样品中，定量含有c端环亚胺的三个主要肽基。数据以均值±标准差表示(n = 3个生物独立样本)。所述p值由Proteome Discoverer的TukeyHSD事后检验单因素方差分析获得。（gydF4y2BafgydF4y2Ba)在有或没有碱基处理的RBC样品中，两种含c端环亚胺的主要凝乳蛋白酶肽群的定量。数据以均值±标准差表示(n = 5个生物独立样本)。所述p值由Proteome Discoverer的TukeyHSD事后检验单因素方差分析获得。（gydF4y2BaggydF4y2Ba)采用选定离子监测方法定量RBC样品中HBB(42-60)、HBB(42-cN58)和HBB(42-N58)的绝对质量和百分比。（gydF4y2BahgydF4y2Ba)牛晶状体中鉴定的三个环酰亚胺肽基的环酰亚胺片段质量和相应的胰蛋白酶肽的离子强度色谱图。（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba这些肽基的定量验证了环亚胺修饰对碱基处理的敏感性。数据以均值±标准差表示(n = 4个生物独立样本)。所述p值由Proteome Discoverer的TukeyHSD事后检验单因素方差分析获得。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图9合成肽的c端cQ/cN和Q/N修饰分析gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在肽中形成环酰亚胺，然后水解得到截断的c端谷氨酰胺或天冬酰胺片段。（gydF4y2BabgydF4y2Ba)各肽的代表性提取离子色谱图叠加在母肽(黑色)、环酰亚胺片段(红色)及其水解产物(蓝色)所对应的质量处。在我们的研究中，通过环酰亚胺片段水解形成的两种构型异构体没有被区分。（gydF4y2Bac - dgydF4y2Ba)体外形成环酰亚胺片段和水解产物在孵育后合成肽上指定位置的时间过程。（gydF4y2BaegydF4y2Ba)在不同ph下形成的环酰亚胺片段和相应残基处的水解产物相对于合成母肽段的百分比(gydF4y2BafgydF4y2Ba)对RBC裂解液和含有修饰物的同位素标记的HBB(42* -60)的混合物提取相应种类的质量的离子强度色谱。将红细胞样品与肽混合物加标，并在所选离子监测模式下运行，以验证保留时间的重叠并放大所选离子的信号。gydF4y2Ba
图10含c端cQ/cN和Q/N修饰的底物在体外和细胞中的分析gydF4y2Ba
（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba使用HBB(1-129)硫酯和Sec-YcQ或Sec-YcQMe连接表达蛋白生成HBB(1-cQ132)或HBB(1-Me132)的示意图。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) Western blot检测HBB蛋白体外泛素化情况。不幸的是，无论是HBB[1-cQ132]还是重组HBB都不受电穿孔的影响，这妨碍了我们评估细胞中crbn依赖性降解的能力。（gydF4y2BacgydF4y2Ba)基于tmt的体外泛素化样品K-ε-GG位点的质谱定量。数据以平均值±标准差表示(n = 4个技术重复)。使用未配对的双尾t检验进行比较，并注意到p值。（gydF4y2BadgydF4y2Ba) WT HEK293T或CRBN CRISPR/Cas9敲除HEK293T 48小时内含c端环酰亚胺肽基的火山图。上调蛋白在1% FDR =红色，5% FDR =粉色。ACTB(96-cN111)肽=蓝色。丰度比的p值采用TukeyHSD事后检验的单因素方差分析计算。（gydF4y2BaegydF4y2Ba)用200µM来那度胺处理48小时以上WT HEK293T、CRBN KO HEK293T或HEK293T中含有c端谷氨酰胺或天冬酰胺(蛋白质端除外)的肽基火山图。在1% FDR =红色，5% FDR =粉色时，肽基上调，这与阻断承载c端亚胺的底物降解使修饰物被水解的模型一致。丰度比的p值采用TukeyHSD事后检验的单因素方差分析计算。（gydF4y2BafgydF4y2Ba用DMSO或200 μ M来那度胺处理48小时以上MM.1S中含有c端谷氨酰胺或天冬酰胺(蛋白质端除外)的肽基火山图。1% FDR为上调肽组，5% FDR为上调肽组。丰度比的p值采用TukeyHSD事后检验的单因素方差分析计算。（gydF4y2BaggydF4y2Ba)对HEK293T裂解物和含有修饰物的同位素标记ACTB(96* -113)的混合物提取相应物种质量的离子强度色谱图。将细胞样本与肽混合物加标，并在选定的离子监测模式下运行，以验证保留时间的重叠并放大选定离子的信号。对于未裁剪的western blot图像，请参见补充图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
该文件包含补充图1至12，材料和仪器，合成程序，参考文献，NMR谱和IR谱。gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
在pomalidomide或cQ/cN多肽存在下，与Flag-CRBN共免疫沉淀的蛋白质(如图2b-c和扩展数据图5c-d所示)。丰度比的p值由Tukey的HSD事后检验的单因素方差分析计算。gydF4y2Ba
补充表2gydF4y2Ba
从含有IMID或cQ/ cn化合物处理的细胞中鉴定出的蛋白质(如图2d-e和扩展数据图5f, 5h所示)。丰度比的p值采用t检验(背景)方法计算。gydF4y2Ba
补充表3gydF4y2Ba
cQ/cN和Q/N肽从CPTAC数据集的元分析中鉴定出来。gydF4y2Ba
补充表4gydF4y2Ba
在重组蛋白或组织中检测到cQ/cN多肽(见图4d和扩展数据图8e-f, 8i)。丰度比的p值由Tukey的HSD事后检验的单因素方差分析计算。gydF4y2Ba
补充表5gydF4y2Ba
环亚胺的形成和多肽水解产物的定量(如图4e和扩展数据图9c-e所示)。gydF4y2Ba
补充表6gydF4y2Ba
从HBB体外泛素化样品中鉴定出K-ε-GG多肽(见扩展数据图10c)。p值由未配对的双尾t检验计算，使用所示丰度gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value在这个表中没有被使用)。gydF4y2Ba
补充表7gydF4y2Ba
从HEK293T和MM.1S细胞中鉴定出的cQ/cN和Q/N多肽(见图5c-d和扩展数据图10d-f)。丰度比的p值由Tukey的HSD事后检验的单因素方差分析计算。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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引用本文gydF4y2Ba
Ichikawa, S.， Flaxman, H.A.， Xu, W.。gydF4y2Baet al。gydF4y2BaE3连接酶适配器小脑靶向c端环亚胺去克隆。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba610gydF4y2Ba， 775-782(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05333-5gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586-022-05333-5gydF4y2Ba
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